Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

저자는 그녀의 뛰어난 기술 지원 시 Duvnjak를 감사합니다. 이 작품 가운데 도이치 (www.dfg.de) WO1811/2-1 M.W. 및 QU280/3-1 지능에 의해 지원 되었다 Funder 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 게시, 결정 및 원고 준비에 전혀 역할을 했다.

마우스는 프랑스에서 1 월 실험실 또는 현지 동물 보호 시설에서 자체 품종으로 획득 했다. 조사 관리 및 실험 동물 사용 (미국 국립 연구소의 건강 게시 번호 85-23, 개정 1996)에 대 한 가이드에 설명 된 지침에 따라 실시 했다. 모든 동물 실험 관련 기관 승인에 따라 수행 했다 (주 정부 LANUV 참조 번호 AZ:84-02.04. 2016.A435)입니다.
1. 악기, 솔루션, 및 장비 준비
<ol><li>1mm 염화 마그네...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

제시 방법 glomeruli 조사 사 RNA 또는 단백질의 성공적인 격리 수 있습니다. 또한, 기본 사 셀 문화 격리 glomeruli에서 수행할 수 있습니다. Biotin 사 격리 하기 전에 적용 되는 경우 사 세포 표면 단백질의 라벨을 수행할 수 있습니다. 이 방법으로, vivo에서 사 세포 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다, 그리고 단백질 풍부의 반 정량 가능 합니다. 사 세포 표면 단백질 풍부를 성공적으로 테스트를 위?...

Proteinuria 사 상해의 상징 이며 일반적으로 사 필터1의 장애를 동반 한다. 사 필터 fenestrated endothelium, 사 지하실 막, 및 podocytes 구성 됩니다. 사 필터의 섬세 한 분자 구조는 매우 역동적이 고 모두 건강 하 고 병에 걸린 신장2,3,,45,6에에서 거래 하는 세포 표면 단백질에 . 세포 표면 단백질 endocytosis podocytes7의 생존을 위해 필수적인 것으로 표시 되었습니다. Nephrin와 podocalyxin는 막 횡단 단백질 podocytes에 표현. Podocalyxin은 sialoglycoprotein podocytes8,,910의 보조 발 프로세스 코팅 Nephrin은 사 슬릿 격 막의 중추 이다. Endocytic 매매 이전 표시 되었습니다 nephrin와 podocalyxin3,11,12,,1314에 대 한.
우리의 지식의 베스트에 세포 표면 단백질 endocytosis 하지 아직 설명 하고있다 문학에서 사 내 피 세포에. 그러나, 내 피 세포는 일반적 endocytosis (즉, clathrin 종속, 뗏목 종속 endocytosis)15,16의 다른 종류에 대 한 모든 필요한 단백질을 표현 한다. 따라서, 내 피 세포 표면 매매 수로 공부 될이 메서드를 사용 하 여, 예를 들어 혈관 내 피 (VE)-cadherin 및 세포내 접착 분자 (ICAM-2) 셀으로 표면 사 내 피 세포17 마커 단백질 .
불행히도, 아니 정확 하 게 체 외에서 모델 필터에 대 한 섬세 한 3 계층화 사 어느 셀에 표면 단백질 매매 공부 될 수 있다 이다. 이 방법의 목표는 이렇게 사 단백질 밀매 vivo에서공부 하. 또한,이 프로토콜 glomeruli, 추가 분석 사 RNA, 단백질, 세포의 활성화를 격리 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 유사한 사 격리 기법으로 다른 설명 되었습니다18,19그룹화 합니다.
이전에 우리와 다른 비보 전 사 세포 표면 단백질의 biotinylation2,,34,,2021에 의해 라벨 사용 했습니다. 그러나,이 비보 전 방법, 격리 glomeruli endocytic 인신 매매에 영향을 미칠 수 있습니다 기계적 스트레스에 노출 되었다. 또는, 사 세포 표면 단백질의 면역 형광 라벨은 광범위 하 게 사용 되었습니다 문학2,20,22에. 그러나이 방법으로 단백질 수가 적은 하나의 슬라이드 내에서 분석 될 수 있다, 그리고 면역 형광 이미지의 정량은 종종 어려운.
사 세포 표면 단백질 풍부 하 고 매매 정확 하 게에 건강 하 고 병에 걸린 신장, 공부를 신뢰할 수 있는 도구를 제공 하는이 소설은 vivo에서 방법 그리고 면역 형광 시험에 추가로 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

Proteinuria fenestrated endothelium, 사 지하실 막 그리고 podocytes 그들의 슬릿 격 막으로 구성 된 사 필터의 붕괴에서 유래한 다. 사 필터, 특히 슬릿 격 막의 섬세 한 구조는 다양 한 세포 표면 단백질의 상호 작용에 의존합니다. 공부 하는이 세포 표면 단백질은 생체 외에서 연구 또는 조직학 분석을 제한 되었습니다 지금까지. 여기, 우리 murine vivo에서 biotinylation 라벨 생리 및 pathophysiologic 조건 사 세포 표면 단백질의 연구를 수 있는 방법 제시. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다. 사 셀 표면 풍부의 반 정량이 새로운 방법, 그리고 모든 단백질 biotin 관류에 액세스할 수와 함께 쉽게 사용할 수 이며 immunoprecipitation 공부 될 수 있다. 또한, 격리 또는 biotinylation 없이 glomeruli의 기본 사 세포 배양 (즉, 기본 podocyte 세포 배양) 뿐만 아니라 사 RNA와 단백질의 분석을 추가 있습니다.

격리 glomeruli 정확 하 게, 먼저 murine 신장 PBSCM와 perfuse 필요가 있다. PBSCM와 관류 신장 창백 (그림 1A) 나타났다. 마그네틱 구슬 glomeruli의 색전술 신장 표면 (그림 1B)에 갈색 점 들으로 표시 됩니다. 자석 포 수와 glomeruli의 절연 오염 신장 tubuli (그림 1C)으로 표시할 수 있?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

이 방법은 단백뇨신장질환이 아닌 단백뇨에서 세포 표면 단백질 인신 매매의 역할에 대한 신장학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 세포 표면 단백질 인신 매매의 연구를 용이하게하고 실험 당 하나 이상의 단백질을 분석 할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 구체 세포 표면 인신 매매에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 또한 perfused 및 격리 기술에 의해 액세스 할 수있는 다른 기관 시스템에 적용 할 수 있습니다.발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고 70 %의 이소 프로필로 마취 마우스의 복부 측면을 소독하는 것으로 시작합니다. 골반에서 흉골까지 피부를 잘라내고 핀셋을 사용하여 복부 근막에서 피부를 제거합니다. 복부 중진선의 양쪽에 피부를 잘라 시포이드에 방광에서 복부 근육 층을 통해 매체를 확인합니다.가위와 집게를 사용하여 근육을 네 개의 사분면으로 나누고 두 개의 수술 클램프를 사용하여 동물의 목쪽으로 상부 2 사분면을 고정하십시오. 동물을 해부 현미경 아래에 놓고 멸균 스왑을 사용하여 내장 기관을 옆으로 이동하십시오. 미세 가위를 사용하여 간 phrenic 인대를 잘라.정밀한 외과 핀셋을 사용하여, 신장 동맥의 간 막질 동맥 branial 의 주위에 1 봉합사를 놓습니다. 그리고 대동맥 주위, 신장 동맥에 근위, 부신에서. 근막, 지방 및 기타 조직에서 말단 대어타를 해방하십시오.그런 다음 정맥 카바와 대동맥을 양분의 높이에 고정시키고 신장 동맥의 대동맥 탈구 주위에 또 다른 봉합사를 놓습니다. 핀셋을 사용하여 근접 대동맥 봉합사를 조이고 혈류를 감쇠시키고 대동맥의 직경의 작은 구멍을 대동맥으로 자르고 신장 동맥에 단념하십시오. 얼음 차가운 PBS 5밀리리터와 칼슘과 마그네슘을 10 밀리리터 주사기에 부착한 10센티미터 카테터를 대어타에 삽입합니다.그리고 준비 된 합자카테를 수정합니다. 그런 다음 분당 2 밀리리터의 신장을 퍼프하기 시작합니다. 신장 동맥의 신장 정맥으로 구멍을 자르고 간 및 막진 동맥 주위의 봉합사를 조이기 위해 미세 한 가위를 사용하십시오.PBS의 전체 부피가 전달된 후 퍼퓸을 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS와 칼슘및 마그네슘으로 대체하여 표면 라벨링을 위해 밀리리터 비오틴당 0.5 밀리그램을 보충합니다. 분당 유량 2밀리리터로 신장을 계속 인내하십시오. 전체 부피가 전달되면 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS와 칼슘, 마그네슘이 들어 있는 주사기를 카테터에 100밀리머 글리신으로 보충합니다.글리신 용액 5밀리리터를 분당 2밀리리터로 담금질합니다. 그런 다음 신장에 얼음 차가운 PBS 5 밀리리터와 칼슘및 마그네슘을 분당 2밀리리터의 유량으로 밀리리터당 200 마이크로리터의 마그네틱 비드로 보충합니다. 갈색 자기 구슬을 가진 구체의 색전은 신장 표면에 보일 것입니다.모든 구슬이 전달되었을 때 신장캡슐을 제거하고 힐룸에서 신장을 수확하십시오. 신장을 PBS 15 밀리리터와 칼슘및 마그네슘이 함유한 10센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다. 새로운 양날 블레이드를 사용하여 신장을 가능한 가장 작은 조각으로 자른다.콜라게나아제 A 1밀리리터를 30분간 30분간 함유한 2밀리리터 튜브로 조직을 옮기고, 소화 전후에 1000 마이크로리터 파이펫 팁으로 조직 용액을 부드럽게 혼합한다. 인큐베이션의 끝에서, 100 미크론 세포 여과기를 통해 소화 된 조직을 필터링. 세포 스크레이퍼와 얼음 차가운 PBS플러스 칼슘과 마그네슘을 사용하여 남은 조직을 세포 스트레이너를 통해 으깬다.신장 단일 세포 현탁액의 최종 볼륨을 신선한 얼음 차가운 PBS플러스 칼슘과 마그네슘으로 최대 50 밀리리터까지 가져와 원심분리로 신장 세포를 수집합니다. 상체를 제거한 다음 1.5 밀리리터 미만의 얼음 차가운 PBS와 칼슘및 마그네슘을 함유하고 구체 현탁액을 새로운 2밀리리터 튜브로 옮기십시오. 사구를 씻으려면 튜브를 자석에 넣고 사구를 집계합니다.1분 후 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 상체를 제거합니다. 그리고 자석에서 튜브를 제거합니다. PBS 1 밀리리터와 칼슘과 마그네슘을 조직에 추가합니다.구체를 한 번 위아래로 피펫하고 세포를 소용돌이시다. 튜브를 자석에 반품하고 방금 시연한 대로 다시 사구를 씻습니다. 40- 100 X 배율에서 광 현미경 분석에 의해 샘플 순도가 적어도 90%에 도달할 때까지.그런 다음 원심분리에 의해 자기 비드 정제 된 구체 구체를 수집합니다. 95% 이상의 순도를 달성하기 위해, 글로메룰리는 입증된 대로 철저히 세척해야 했습니다. 비오틴 관류는 비오틴에서 모세관 루프의 라벨링을 용이하게 하지만, 조절된 마우스 신장은 아닙니다.구체 추출물의 비오틴 분획의 면역 침전은 사구형 막 단백질 네프린과 포도잘록신이 바이오틴으로 면역 침전되지만 대조군 분획이 아니라는 것을 보여준다. 연쇄상 바비딘을 사용한 면역 절전 분획의 염색은 바이오틴에 있는 비오틴 래드 네프린의 존재를 더욱 확인하지만, 관대한 동물을 통제하지는 않는다. 내피 단백질 혈관 내피 카헤린 및 세포 내 접착 분자 2도 비오틴 분획 내에서 면역 침전된다.신증후군의 초기 단계에서 세포 표면 네프린의 감소된 발현은 대조군에 비해 신염 성 신염 동물에서 관찰된다. 실제로 수온 분석은 컨트롤러에 비해 신증후군 동물에서 비오틴 래드 네프린의 현저한 감소를 나타낸다. 전체 nephrin 대 액틴 비의 정량적 분석은 대조군과 신증후군 마우스 사이에 유의한 차이를 보이지 않는다.또한, 신장독성 신염 및 대조동물에서 동일한 양의 포도세포가 관찰된다. 늦은 신증후군에서, 신증후군 동물은 대조군과 신증후군 마우스 사이에서 측정된 세포 표면 신프린과 신증후군 동물의 전반적인 총 신프린 감소에 큰 차이가 없는 신증후군 발현의 회복을 나타낸다. 또한, 포도세포 수는 대조동물에 비해 감소된다.이 절차를 시도하는 동안, 구성구의 공기 색전증을 피하기 위해 자신의 연결 중에 주사기 거품을 무료로 유지하고 신장 관류가 시작되면 얼음 차가운 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 사구체 RNA와 단백질의 분리와 같은 다른 방법은 건강하고 병든 신장에서 단백질 발현 또는 상호 작용에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수있다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

세포 내 빠른 광화학적 단백질 산화로 세포 단백질 특성화

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...