Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Forfatterne takker Blanka Duvnjak for sin eksepsjonelle kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 til M.W. og QU280/3-1 til IQ Funder ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling, analyse, beslutningen om å publisere og utarbeidelse av manuskriptet.

Mus ble innhentet som en egen rase fra lokale dyr pleie anlegget eller Janvier Labs i Frankrike. Undersøkelser ble gjennomført i henhold til retningslinjene skissert i guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr (USAs nasjonale institutter av helse publikasjonen nummer 85-23, revidert 1996). Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med relevante institusjonelle godkjenninger (staten regjeringen LANUV referanse nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. utarbeidelse av instrumenter, løsninger og utstyr...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

Presentert metoden gjør det mulig for vellykket isolering av glomeruli å undersøke glomerular RNA eller protein. I tillegg kan primære glomerular cellekulturer utføres fra de isolerte glomeruli. Hvis biotin brukes før glomerular isolasjon, kan merking av glomerular celle overflaten proteiner utføres. Med denne metoden i vivo glomerular celle overflaten protein menneskehandel kan studeres, og semi kvantifisering av protein overflod er mulig. De viktigste trinnene for å kunne teste glomerular celle overfla...

Proteinuria er et kjennetegn på glomerular skader og vanligvis følger avbrudd av glomerular filteret1. Glomerular filteret består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes. Den delikate molekylære strukturen av glomerular filteret er svært dynamisk og emne til cellen overflaten protein menneskehandel i både friske og syke nyrer2,3,4,5,6 . Endocytose cellen overflaten proteiner har vist seg å være avgjørende for overlevelsen av podocytes7. Nephrin og podocalyxin er transmembrane proteiner uttrykt på podocytes. Nephrin er ryggraden i glomerular slit membranen, mens podocalyxin er en sialoglycoprotein belegg sekundære foten prosesser av podocytes8,9,10. Endocytic menneskehandel har tidligere vist for nephrin og podocalyxin3,11,12,13,14.
Til best av vår kunnskap, har endocytose cellen overflaten proteiner ikke ennå blitt beskrevet i glomerular endotelceller i litteraturen. Imidlertid uttrykke endotelceller generelt alle nødvendige proteiner for ulike endocytose (dvs. clathrin-avhengige, flåte-avhengige endocytose)15,16. Derfor endothelial celle overflaten menneskehandel kan studeres med denne metoden bruker, for eksempel vaskulær endotelial (VE)-cadherin og intracellulær vedheft molekyl (ICAM-2) som en celle overflaten markør protein for glomerular endotelceller17 .
Dessverre er det ingen nøyaktig i vitro modell for delikat tre-lagdelt glomerular filteret i hvilken celle overflaten protein menneskehandel kan studeres. Målet med denne metoden er derfor å studere glomerular protein menneskehandel i vivo. I tillegg inneholder denne protokollen informasjon om hvordan du isolerer glomeruli, en slik analyse av glomerular RNA, proteiner eller celler. Lignende glomerular isolasjon teknikker har blitt beskrevet av ulike grupper18,19.
Tidligere har vi og andre brukt ex vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner av biotinylation,2,,3,,4,,20,,21. Men i denne ex vivo metoden, ble isolerte glomeruli utsatt for mekanisk stress, som kan påvirke endocytic menneskehandel. Eventuelt er immunofluorescence merking av glomerular celle overflaten proteiner mye brukt i litteratur2,20,22. Med denne metoden, men bare et lite antall proteiner kan analyseres i ett lysbilde, og kvantifisering av immunofluorescence bilder er ofte vanskelig.
Denne romanen i vivo metoden gir et pålitelig verktøy for å studere glomerular celle overflaten protein overflod og omsetning nøyaktig i friske og syke nyrer, og den kan brukes som et tillegg til immunofluorescence tester.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

Proteinuria resultatene fra avbrudd glomerular filter som består av fenestrated endotelet, glomerular kjelleren membranen og podocytes med sine slit membraner. Delikat strukturen glomerular filter, spesielt slit membranen, er avhengig av samspillet mellom ulike celle overflaten proteiner. Studere disse cellen overflaten proteinene har så langt vært i vitro studier eller histologic analyse. Her presenterer vi et murint i vivo biotinylation merking metoden, som muliggjør studiet av glomerular celle overflaten proteiner under fysiologiske og pathophysiologic forhold. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av et protein av interesse. Immunoprecipitation kan studeres semi kvantifisering av glomerular celle overflaten overflod er lett tilgjengelig med denne romanen metoden og alle proteiner tilgjengelig for biotin perfusjon. I tillegg kan isolering av glomeruli med eller uten biotinylation videre analyse av glomerular RNA og protein, i tillegg til primære glomerular cellekultur (dvs. primære podocyte cellekultur).

For å isolere glomeruli nøyaktig, er det nødvendig å perfuse murint nyrene med PBSCM først. Perfusjon med PBSCM viser nyrer blek (figur 1A). Embolisering av glomeruli med magnetiske perler vises som brune prikker på nyre overflaten (figur 1B). Isolasjonen av glomeruli med magnet catcher kan vise forurensning med nyre tubuli (figur 1C). Før ytt...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolasjonen av Glomeruli og i Vivo merking av Glomerular celle overflaten proteiner

Her presenterer vi en protokoll for murine i vivo merking av glomerular celle overflaten proteiner med biotin. Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan du perfuse musen nyrer, isolere glomeruli og utføre endogene immunoprecipitation av protein av interesse.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i nefrologifeltet om rollen som celleoverflateproteinhandel i proteinurisk og ikke proteinnyresykdom. De viktigste fordelene med denne teknikken er at det letter studiet av celleoverflateproteinhandel in-vivo, og at mer enn ett protein kan analyseres per eksperiment. Selv om denne metoden kan gi innsikt i glomerulær celleoverflatehandel, kan også brukes på andre organsystemer som er perfundert og er tilgjengelige ved isolasjonsteknikker.Begynn med å bekrefte mangel på respons på tåklemme og desinfisere ventral side av den bedøvede musen med 70% isopropyl. Lag en median skjære gjennom huden fra bekkenet til brystbenet og bruk pinsett for å fjerne huden fra magefascia. Skjær huden på begge sider av abdominal midtlinjen og lag et medium gjennom bukmuskellaget fra blæren til xiphoid.Bruk saks og tang til å dele musklene i fire kvadranter Og bruk to kirurgiske klemmer for å sikre de to øverste kvadrantene mot dyrenes hals. Plasser dyret under et dissekerende mikroskop og bruk et sterilt bytte for å flytte til side de viscerale organene. Bruk fin saks, kutt det leverphreniske ligamentet.Bruk fine kirurgiske pinsett, plasser en sutur rundt leveren mesenterisk arterie branial av nyrearteriene. Og rundt aorta, proksimal til nyrearteriene, ved binyrene. Frigjør distal aorta fra fascia, fett og annet vev.Deretter klemmer vena cava og aorta på høyden av bifurcation og legger en annen sutur rundt aorta distal av nyrearteriene. Bruk pinsett for å stramme den proksimale aortasuturen, dempe blodstrømmen og kutte et lite hull halvparten av diameteren på aorta i aorta, distal til nyrearteriene. Sett inn et 10 centimeter kateter festet til en 10 milliliter sprøyte som inneholder fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium i aorta.Og fest kateteret med de forberedte ligaturene. Deretter begynner du å perfusere nyrene med en to milliliter per minutt strømningshastighet. Bruk fin saks til å kutte et hull i nyrevenen ved nyrearteriene og stramme suturen rundt lever- og mesenteriske arterier.Etter at hele volumet av PBS er levert erstatte perfusat med fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium supplert med 0,5 milligram per milliliter biotin for overflatemerking. Fortsett å perfuse nyrene med en to milliliter per minutt strømningshastighet. Når hele volumet er levert, fest en sprøyte som inneholder fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium supplert med 100 millimolarglysin til kateteret.Slukke glomeruli med alle fem milliliter av glysinløsningen med en to milliliter per minutt strømningshastighet. Deretter perfuse nyrene med fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium supplert med 200 mikroliter magnetiske perler per milliliter ved en to milliliter per minutt strømningshastighet. Emboliseringen av glomeruli med de brune magnetiske perlene vil være synlig på nyreoverflaten.Når alle perlene er levert, fjern nyrekapselen og høst nyrene på hilum. Legg nyrene i en 10 centimeter cellekulturrett som inneholder 15 milliliter PBS pluss kalsium og magnesium. Bruk et nytt dobbeltkantet blad for å kutte nyrene i de minste delene som er mulig.Overfør vevet til et to milliliter rør som inneholder en milliliter kollagenase A i 30 minutter ved 37 grader Celsius, bland vevsløsningen forsiktig før og etter fordøyelsen med en modifisert 1000 mikroliter pipettespiss. På slutten av inkubasjonen filtrerer du det fordøyde vevet gjennom en 100 mikron cellesil. Bruk en celleskraper og iskald PBS pluss kalsium og magnesium for å mose det gjenværende vevet gjennom cellesilen.Ta det endelige volumet av nyrene enkeltcelle suspensjon opp til 50 milliliter med frisk iskald PBS pluss kalsium og magnesium og samle nyrecellene ved sentrifugering. Fjern supernatanten og suspender pelleten igjen med litt mindre enn 1,5 milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium mens du virvler og overfører den glomerulære suspensjonen til et nytt to milliliterrør. For å vaske glomeruli, legg røret i en magnet for å aggregere glomeruli.Etter ett minutt bruker du en 1000 mikroliter pipette for å fjerne supernatanten. Og fjern røret fra magneten. Tilsett en milliliter PBS pluss kalsium og magnesium til vevet.Pipette glomeruli opp og ned en gang og vortex cellene. Returner røret til magneten og vask glomeruli igjen som nettopp demonstrert. Inntil en prøve renhet har nådd minst 90%av lys mikroskop analyse på en 40 til 100 X forstørrelse.Deretter samler den magnetiske perlen renset glomeruli ved sentrifugering. For å oppnå en større enn 95% renhet, måtte glomeruli vaskes grundig som demonstrert. Biotinperfusjon forenkler merking av kapillære løkker i biotin, men ikke kontrollertperfused mus nyrer.Immunnedbør av biotinfraksjonen av glomerulære ekstrakter avslører at de glomerulære transmembraneproteinene nephrin og podokalyxin er immunforefall med biotin, men ikke med kontrollfraksjonen. Farging av immunforebukk fraksjon med streptavidin bekrefter videre tilstedeværelsen av biotin laded nephrin i biotinperfused, men ikke kontrollere perfused dyr. Endotelprotein vaskulær endotelkaderin og intracellulært vedheftmolekyl to er også immunoprecipitated innenfor biotinfraksjonen.I den tidlige fasen av nefrotoksisk nefritt observeres et redusert uttrykk for celleoverflate nephrin hos nefrotoksiske nefritt dyr sammenlignet med kontroller. Faktisk viser densitometisk analyse en betydelig reduksjon av biotin laded nephrin hos nefrotoksiske nefritt dyr sammenlignet med kontrollere. Kvantitativ analyse av det totale nephrin-forholdet viser ingen signifikante forskjeller mellom kontroll og nefrotoksisk nefritt mus.I tillegg observeres like mengder podocytter i nefrotoksisk nefritt og kontrollerer dyr. I sen nefrotoksisk nefritt viser nefrotoksiske nefrotiske dyr en gjenoppretting av nephrinuttrykk uten signifikante forskjeller i celleoverflaten nephrin målt mellom kontroll og nefrotoksiske nefrotiske mus og en total total nephrinreduksjon i nefrotoksiske nefrotiske dyr. Videre reduseres podocytetallene sammenlignet med kontrolldyr.Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å holde sprøytene boblefri under deres forbindelse for å unngå luftemboli av glomeruli og å jobbe under iskalde forhold når nyreperfusjonen har startet. Etter denne prosedyren kan andre metoder som isolering av glomeruli RNA og protein utføres for å svare på flere spørsmål om proteinuttrykk eller interaksjoner i sunne og syke nyrer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av mellomproduktfilamentproteiner fra flere musvæsker til studie aldringsassosierte posttranslatoriske modifikasjoner

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rensing av biotinylerte celleoverflateproteiner fra<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epiteliale gutceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Looking utover: isolering av Cyanobacterial Released karbohydrater polymerer og proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Ekstremt rask og spesifikk metabolsk merking av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisere cellulære proteiner med i cellfast fotokjemisk oksidasjon av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse av nøytral lipidsyntese i saccharomyces cerevisiae ved metabolsk merking og tynn lagkromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...