Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Авторы благодарят Blanka Duvnjak за ее исключительной технической помощи. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1-М.В и QU280/3-1-I.Q. Спонсора имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных, анализ данных, решение опубликовать и подготовка рукописи.

Мышей были получены как внутренний породы от местных животных ухода объекта или Жанвье лабораторий во Франции. Согласно руководящим принципам, изложенным в руководстве для ухода и использования лабораторных животных (США национальных институтов из здравоохранения публикация № 85-23, р...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

Представленный метод позволяет успешно изоляции клубочков расследовать клубочковых RNA или протеина. Кроме того культуры первичной клубочковых клеток может выполняться из изолированных клубочков. Если биотина применяется перед клубочковых изоляции, маркировки клубочковых клеток по?...

Протеинурия является отличительной чертой клубочковых травмы и обычно сопровождает нарушение клубочковых фильтра1. Клубочковой фильтрации состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes. Деликатный молекулярной структуры клубочковой фильтрации очень динамичный и подвергать белка клеточной поверхности оборота как здоровые и больные почки2,3,4,5,6 . Эндоцитоза поверхностных белков клеток было показано, быть необходимым для выживания podocytes7. Трансмембранные белки, выраженные на podocytes Nephrin и podocalyxin. Nephrin является основой клубочковых щели диафрагмы, в то время как podocalyxin является sialoglycoprotein, покрытие процессов вторичного ноги podocytes8,9,10. Endocytic оборот ранее было показано, для nephrin и podocalyxin3,11,12,,1314.
В меру наших знаний эндоцитоза белков клеток поверхности не еще был описан в клубочковых клеток эндотелия в литературе. Однако эндотелиальные клетки в целом выразить все необходимые белки для различных типов эндоцитоза (то есть, зависящих от Клатрин, плот зависимая эндоцитоза)15,16. Таким образом, эндотелиальных клеток поверхности людьми может быть изучена с помощью этого метода, используя, например, сосудистого эндотелия (VE)-Кадгерины и внутриклеточных Межмицеллярная молекула (ICAM-2) как клетка поверхности белка маркера для клубочковых клеток эндотелия17 .
К сожалению не существует точного в vitro модели для деликатной трехслойное клубочковых фильтра, в котором ячейки могут быть изучены людьми поверхности белка. Цель этого метода является таким образом изучить клубочковых белка торговли людьми, в естественных условиях. Кроме того этот протокол содержит информацию о том, как изолировать клубочков, позволяя дальнейшего анализа клубочковых РНК, белки или клетки. Подобные клубочковых изоляции, что методы были описаны различные группы18,19.
Ранее мы и другие использовали ex vivo маркировки клубочковых клеток поверхности белков biotinylation2,3,4,,2021. Однако в этом методе ex vivo , изолированные клубочков были подвержены механическому воздействию, которое может повлиять на endocytic людьми. Кроме того Этикетировочный иммунофлуоресценции клубочковых клеток поверхности белков широко использовалась в литературе2,20,22. С помощью этого метода однако, только небольшое количество белков могут быть проанализированы в течение одного слайда, и количественный иммунофлюоресценции изображений часто бывает трудно.
Этот роман в vivo метод предлагает надежный инструмент для изучения клубочковых клеток поверхности белка изобилия и людьми точно в здоровые и больные почки, и он может использоваться как дополнение к иммунофлюоресценции тесты.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

Протеинурия результаты от нарушения клубочковых фильтр, который состоит из перфорированную эндотелия, клубочковых базальной мембраны и podocytes с их щели диафрагмы. Деликатный структура клубочковых фильтра, особенно щели диафрагмы, опирается на взаимодействие различных клеток поверхности белков. Изучая эти клетки поверхности белки до настоящего времени была ограничена в vitro исследования или гистологический анализ. Здесь мы представляем мышиных в vivo biotinylation маркировки метод, который позволяет исследование белков клубочковых клеток поверхности физиологического и патофизиологические условиях. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса. Полуфинал количественный поверхностного залегания клубочковых клеток легко доступны с этот новый метод и все белки доступным для перфузии биотина и иммунопреципитации могут быть изучены. Кроме того изоляция клубочков, с или без biotinylation позволяет далее анализ клубочковых РНК и белка, а также первичных клубочковых клеток культуры (т.е. первичной Подоцит клеток).

Чтобы изолировать клубочков точно, надо сначала perfuse мышиных почки с PBSCM. Перфузия с PBSCM поворачивает почки бледно (рис. 1А). Эмболизация клубочков с магнитной бусины будет виден как коричневые точки на поверхности почек (рис. 1<stron...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Изоляция клубочков и в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков

Здесь мы представляем протокол для мышиных в естественных условиях маркировки клубочковых клеток поверхности белков с биотин. Этот протокол содержит информацию о том, как perfuse мыши почек, изолировать клубочков и выполнять эндогенного иммунопреципитации протеина интереса.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нефрологии о роли торговли белками поверхности клеток в белковой, а не белковой болезни почек. Основными преимуществами этого метода являются то, что он облегчает изучение торговли белками поверхности клеток in-vivo и что более одного белка может быть проанализировано за эксперимент. Хотя этот метод может дать представление о торговле поверхностью гломерулярных клеток, он также может быть применен к другим системам органов, которые пронизаны и доступны с помощью методов изоляции.Начните с подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша и дезинфекции брюшной стороны обезболивающей мыши с 70%isopropyl. Сделайте медианный разрез через кожу от таза до грудины и используйте пинцет, чтобы удалить кожу из брюшной фасции. Вырезать кожу по обе стороны от брюшной средней линии и сделать средний через брюшной мышечный слой от мочевого пузыря до xiphoid.Используйте ножницы и щипцы, чтобы разделить мышцы на четыре квадранта и использовать два хирургических зажима для обеспечения верхних двух квадрантов к шее животных. Поместите животное под рассекающий микроскоп и используйте стерильный своп, чтобы отойти в сторону висцеральных органов. Используя тонкие ножницы, вырезать печеночными френическими связками.Используя тонкие хирургические пинцеты, поместите один шов вокруг печеночной мезентерической артерии branial почечных артерий. И вокруг аорты, проксимальной для почечных артерий, у надпочечников. Освободите дистальную аорту от фасции, жира и других тканей.Затем зажим вены и аорты на высоте бифуркации и поместите еще один шов вокруг аорты дистал почечных артерий. Используйте пинцет, чтобы затянуть проксимальный шов аорты, окутая кровоток и вырезать небольшое отверстие половину диаметра аорты в аорту, дистал почечных артерий. Вставьте 10-сантиметровый катетер, прикрепленный к 10 миллилитровому шприцу, содержащем пять миллилитров ледяного PBS плюс кальций и магний в аорту.И починить катетер с помощью подготовленных лигатур. Затем начните perfusing почек на два миллилитра в минуту скорости потока. Использование тонких ножниц, чтобы вырезать отверстие в почечной вены на почечных артерий и ужесточение шва вокруг печеночными и мезентерическими артериями.После того, как весь объем PBS был доставлен заменить перфузировать с пятью миллилитров ледяной PBS плюс кальций и магний дополняется 0,5 миллиграммов на миллилитр биотина для маркировки поверхности. Продолжайте окутыкать почки на два миллилитра в минуту скорость потока. Когда весь объем был доставлен, приложите шприц, содержащий пять миллилитров ледяного PBS плюс кальций и магний, дополненный 100 миллимолярный глицин к катетеру.Утолить гломерули со всеми пятью миллилитров раствора глицина на два миллилитра в минуту скорости потока. Затем пронизыть почки с пятью миллилитров ледяной PBS плюс кальций и магний дополняется 200 микролитров магнитных бусин на миллилитр на два миллилитра в минуту скорости потока. Эмболизация гломерули с помощью коричневых магнитных бусинок будет видна на поверхности почек.Когда все бусы были доставлены удалить капсулу почек и урожай почек на hilum. Поместите почки в 10-сантиметровую клеточную культуру, содержащую 15 миллилитров PBS плюс кальций и магний. Используйте новый двойной край лезвие, чтобы сократить почки на самые маленькие кусочки возможно.Перенесите ткань в двухми миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр коллагеназы А в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, мягко смешивая раствор ткани до и после пищеварения с модифицированным наконечником пипетки 1000 микролитров. В конце инкубации фильтруемую ткань через 100 микрон-клеточный ситечко. Используйте клеточный скребок и ледяной PBS плюс кальций и магний, чтобы пюре оставшейся ткани через ситечко клетки.Довнесите конечный объем одноклеточной суспензии почек до 50 миллилитров со свежим ледяным PBS плюс кальций и магний и соберите клетки почек путем центрифугации. Удалите супернатант затем повторно приостановить гранулы с чуть менее 1,5 миллилитров ледяной PBS плюс кальций и магний во время вихря и передачи гломерулярной подвески в новую двухми миллилитровую трубку. Чтобы вымыть гломерули, поместите трубку в магнит, чтобы агрегировать гломерули.Через минуту используйте 1000 микролитровую пипетку, чтобы удалить супернатант. И снимите трубку с магнита. Добавьте один миллилитр PBS плюс кальций и магний в ткани.Pipette glomeruli вверх и вниз один раз и вихрь клеток. Вернуть трубку к магниту и мыть glomeruli снова, как только что продемонстрировали. До тех пор, пока чистота образца не достигла по крайней мере 90% путем анализа светового микроскопа при увеличении от 40 до 100 X.Затем соберите магнитный шарик очищенный glomeruli центрифугации. Для достижения более чем 95% чистоты, glomeruli необходимо тщательно мыть, как попродемонстрировано. Биотин перфузия облегчает маркировку капиллярных петель в биотине, но не контролируется перфузных почек мыши.Иммунные осадки биотиновой фракции гломерулярных экстрактов показывают, что гломерулярные трансмембранные белки нефрин и подокаликсин иммунопреципиентированы биотином, но не контрольной фракцией. Окрашивание иммунопреципитанной фракции стрептавидином еще раз подтверждает наличие биотина в биотине нефрина в биотине, обливленном, но не контролю перфекционированных животных. Эндотелиальный белок сосудистого эндотелиального кадерин и внутриклеточная молекула адгезии два также иммунопреципиентированы в биотиновой фракции.В ранней фазе нефротоксического нефрита снижение экспрессии нефрина поверхности клетки наблюдается у нефротоксических нефритовых животных по сравнению с контролем. Действительно денситометический анализ показывает значительное снижение биотина laded нефрита в нефротоксических животных нефрита по сравнению с контроллерами. Количественный анализ общего соотношения нефрита к актину не выявил существенных различий между контролем и нефротоксическим нефритом мышей.Кроме того, одинаковое количество подоцитов наблюдается при нефротоксических нефритах и контрольных животных. В позднем нефротоксическом нефрите, нефротоксические нефритические животные демонстрируют восстановление экспрессии нефрита без существенных различий в нефрине поверхности клеток, измеренных между контролем и нефротоксическими нефритическими мышами, и общее общее сокращение нефротических нефритовых животных. Кроме того, количество подоцитов снижается по сравнению с контрольных животных.При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы сохранить пузырьк шприцев бесплатно во время их соединения, чтобы избежать эмболии воздуха гломерули и работать в условиях ледяного холода, как только перфузия почек началась. После этой процедуры другие методы, такие как изоляция РНК гломерули и белка могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о экспрессии белка или взаимодействия в здоровых и больных почек.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Очистка биотинилированных клеточных поверхностных белков от<em&gt; Ripicephalus microplus</em&gt; Эпителиальные кишечные клетки

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Взгляд наружу: Изоляция цианобактериальных высвобождаемых углеводных полимеров и белков

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Чрезвычайно быстрая и специфическая метаболическая маркировка РНК in Vivo с 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Анализ синтеза нейтральных липидов в Saccharomyces cerevisiae методом метаболической маркировки и тонкослойной хроматографии

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...