Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Författarna vill tacka Blanka Duvnjak för hennes enastående teknisk assistans. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschafts (www.dfg.de) WO1811/2-1 till M.W. och QU280/3-1 till IQ Finansiären hade ingen roll i den studiedesign, datainsamling, dataanalys, beslut om att offentliggöra och beredning av manuskriptet.

Möss erhölls som en egen ras från lokala djurvård anläggningen eller från Janvier Labs i Frankrike. Undersökningarna genomfördes enligt de riktlinjer som beskrivs i handboken för skötsel och användning av försöksdjur (US nationella institut för hälsa publikation nr 85-23, reviderad 1996). Alla djurförsök har utförts i enlighet med de relevanta institutionella godkännanden (delstatsregeringen LANUV referens nummer AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. beredning av instrument, lösningar ...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

Den presenterade metoden möjliggör framgångsrika isolering av glomeruli att undersöka glomerulär RNA eller proteiner. Primära glomerulär cellkulturer kan dessutom utföras från de isolerade glomeruli. Om biotin appliceras innan glomerulär isolering, kan märkning av glomerulär cell ytproteiner utföras. Med den här metoden i vivo glomerulär cell surface protein människohandel kan studeras och semi kvantitering av protein överflöd är möjligt. De mest kritiska steg för att framgångsrikt testa gl...

Proteinuri är ett kännetecken för glomerulär skada och vanligen åtföljer störningar av den glomerulära filtret1. Det glomerulära filtret består av fenestrated endotelet, glomerulära basalmembranet och podocytes. Den känsliga molekylära strukturen av glomerulära filtret är mycket dynamisk och föremål för cell surface protein människohandel i både friska och sjuka njurar2,3,4,5,6 . Endocytos av cell surface proteiner har visat sig vara viktigt för överlevnaden av podocytes7. Nephrin och podocalyxin är transmembrana proteiner som uttrycks på podocytes. Nephrin är ryggraden i den glomerulära slitsbländaren, medan podocalyxin är en sialoglycoprotein beläggning den sekundära fot processen i podocytes8,9,10. Endocytic människohandel har tidigare visats för nephrin och podocalyxin3,11,12,13,14.
Till bäst av vår kunskap, har endocytos av cell ytproteiner inte ännu varit beskrivs i glomerulär endotelceller i litteraturen. Men uttrycker endotelceller i allmänhet alla nödvändiga proteiner för olika typer av endocytos (dvs. clathrin-beroende, flotte-beroende endocytos)15,16. Därför endotelceller ytan människohandel kan studeras med denna metod som använder, till exempel vaskulär endotel (VE)-cadherin och intracellulära vidhäftning molekyl (ICAM-2) som en cell surface markör protein för glomerulär endotelceller17 .
Tyvärr finns det ingen exakt in vitro- modell för delikat tre lager glomerulära filtret i vilken cell surface protein människohandel kan studeras. Målet med denna metod är således att studera glomerulär protein människohandel i vivo. Detta protokoll innehåller dessutom information om hur man isolera glomeruli, möjliggör ytterligare analys av glomerulär RNA, proteiner eller celler. Liknande glomerulär isolering tekniker har beskrivits av olika grupper18,19.
Tidigare har har vi och andra använt ex vivo märkning av glomerulär cell ytbehandlaproteinerna av biotinylation2,3,4,20,21. Dock i detta ex vivo Metod utsattes isolerade glomeruli för mekanisk stress, som kan påverka endocytic människohandel. Alternativt, immunofluorescens märkning av glomerulär cell ytproteiner har flitigt använts i litteratur2,20,22. Med denna metod, dock endast ett litet antal proteiner kan analyseras inom en bild och kvantitering av immunofluorescens bilder är ofta svårt.
Denna roman i vivo Metod erbjuder ett tillförlitligt verktyg för att studera glomerulär cell surface protein överflöd och människohandel korrekt i friska och sjuka njurar, och den kan användas som ett tillägg till immunofluorescens tester.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

Proteinuri resultat från störningar av glomerulära filtret som består av fenestrated endotelet, glomerulära basalmembranet och podocytes med deras slit membraner. Glomerulära filtret, särskilt slitsbländaren, delikat struktur är beroende av samspelet mellan skilda cellproteiner yta. Studera dessa cell ytproteiner har hittills begränsats till in vitro- studier eller histologisk analys. Här presenterar vi en murin i vivo biotinylation märkning metoden, vilket möjliggör studier av glomerulär yta cellproteiner under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Detta protokoll innehåller information om hur att BEGJUTA mus njurar, isolera glomeruli och utföra endogena immunoprecipitation av ett protein av intresse. Semi kvantitering av glomerulär cell surface överflöd är lättillgänglig med denna nya metod, och alla proteiner tillgänglig för biotin perfusion och immunoprecipitation kan studeras. Isolering av glomeruli med eller utan biotinylation möjliggör dessutom ytterligare analys av glomerulär RNA och protein samt primära glomerulär cellkultur (dvs primära podocyte cell).

För att isolera glomeruli korrekt, är det nödvändigt att BEGJUTA murina njurarna med PBSCM först. Perfusion med PBSCM vänder njurarna blek (figur 1A). Embolisering av glomeruli med magnetiska pärlor kommer att visas som bruna prickar på njure ytan (figur 1B). Isolering av glomeruli med magnet catcher kan visa kontaminering med renal tubuli (figur 1C</...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolering av Glomeruli och In Vivo märkning av glomerulär Cell ytproteiner

Här presenterar vi ett protokoll för murina i vivo märkning av glomerulär yta cellproteiner med biotin. Detta protokoll innehåller information om hur att BEGJUTA mus njurar, isolera glomeruli och utföra endogena immunoprecipitation av proteinet av intresse.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom nefrologi området om rollen av cellytan protein handel med proteinuriska och inte proteinuric njursjukdom. De främsta fördelarna med denna teknik är att den underlättar studiet av cellytproteinhandel in-vivo och att mer än ett protein kan analyseras per experiment. Även om denna metod kan ge insikt i glomerular cell yta människohandel, kan också tillämpas på andra organsystem som är perfused och är tillgängliga genom isolering tekniker.Börja med att bekräfta en brist på svar på tå nypa och desinficera den ventrala sidan av den sövda musen med 70%isopropyl. Gör en median skära genom huden från bäckenet till bröstbenet och använda pincett för att ta bort huden från buken fascia. Skär huden på båda sidor av buken mittlinjen och göra ett medium genom bukmuskeln lagret från urinblåsan till xiphoid.Använd saxen och tärna för att dela musklerna i fyra kvadranter Och använd två kirurgiska klämmor för att säkra de övre två kvadranterna mot djurens hals. Placera djuret under en dissekera mikroskop och använda en steril swap att flytta undan visceral organ. Använda fina saxar, skär den lever phrenic ligament.Använda fina kirurgiska pincett, placera en sutur runt den lever mesenteriala artären branial av njurartärerna. Och runt aorta, proximala till njurartärerna, vid binjuren. Befria den distala aorta från fascian, fett och annan vävnad.Sedan kläm vena cava och aorta på höjden av bifurkation och placera en annan sutur runt aorta distala av njurartärerna. Använd pincett för att dra åt den proximala aorta suturen, förmildrande blodflödet och skär ett litet hål hälften av diametern på aorta i aorta, distala till njurartärerna. Sätt in en 10 centimeter lång kateter som är fäst vid en 10 milliliter spruta innehållande fem milliliter iskall PBS plus kalcium och magnesium i aorta.Och fixera katetern med de förberedda ligaturerna. Sedan börja perfusera njurarna på en två milliliter per minut flöde. Använda fina saxar för att skära ett hål i njurvenen vid njurartärerna och skärpning suturen runt de lever och mesenteriala artärer.Efter att hela volymen pbs har levererats ersätta perfusate med fem milliliter iskall PBS plus kalcium och magnesium kompletteras med 0,5 milligram per milliliter biotin för ytmärkning. Fortsätt att granska njurarna med två milliliter per minut flöde. När hela volymen har levererats, fäst en spruta innehållande fem milliliter iskall PBS plus kalcium och magnesium kompletterat med 100 millimolar glycin till katetern.Släck glomeruli med alla fem milliliter av glycinlösningen med två milliliter per minutflöde. Sedan granska njurarna med fem milliliter iskall PBS plus kalcium och magnesium kompletteras med 200 mikroliter magnetiska pärlor per milliliter på en två milliliter per minut flöde. Den embolization av glomeruli med den bruna magnetiska pärlor kommer att vara synlig på njurytan.När alla pärlor har levererats ta bort kapseln av njurarna och skörda njurarna vid hilum. Placera njurarna i en 10 centimeter cellkultur maträtt som innehåller 15 milliliter PBS plus kalcium och magnesium. Använd en ny dubbel kantad blad för att skära njurarna i minsta bitar möjligt.Överför vävnaden till ett två milliliterrör som innehåller en milliliter kollagenas A i 30 minuter vid 37 grader Celsius, blanda vävnadslösningen försiktigt före och efter matsmältningen med en modifierad 1000 mikroliterpipetsspets. I slutet av inkubationen, filtrera den smälta vävnaden genom en 100 mikron cell sil. Använd en cellskrapa och iskall PBS plus kalcium och magnesium för att mosa den återstående vävnaden genom cellsilen.Ta med den slutliga volymen av njuren enda cell suspension upp till 50 milliliter med färsk iskall PBS plus kalcium och magnesium och samla njurcellerna genom centrifugeringen. Ta bort supernatanten och dra sedan upp pelleten på nytt med något mindre än 1,5 milliliter iskall PBS plus kalcium och magnesium medan du virvelning och överför den glomerulära suspensionen till ett nytt två milliliterrör. För att tvätta glomeruli, placera röret i en magnet för att aggregera glomeruli.Efter en minut, använd en 1000 microliter pipetter för att ta bort supernatanten. Och ta bort röret från magneten. Tillsätt en milliliter PBS plus kalcium och magnesium till vävnaderna.Pipett den glomeruli upp och ner en gång och virvel cellerna. Återgå röret till magneten och tvätta glomeruli igen som just visat. Tills en provrenhet har nått minst 90% av ljus mikroskop analys vid en 40 till 100 X förstoring.Samla sedan den magnetiska pärlan renad glomeruli genom centrifugeringen. För att uppnå en större än 95%-renhet behövde glomeruli tvättas noggrant som visats. Biotinperfusion underlättar märkning av kapillärslingorna i biotin men inte kontrollerade perfunderade mus njurar.Immunutfällning av biotinfraktionen av glomerular extrakt avslöjar att de glomerular transmembrane proteinerna Nephrin och podocalyxin är immunoprecipitated med biotin men inte med kontrollfraktionen. Färgning av immunoprecipitated fraktion med streptavidin ytterligare bekräftar förekomsten av biotin laded nephrin i biotinet som genomsyras men inte kontroll perfused djur. Endothelial protein Vaskulär endotel cadherin och intracellulära vidhäftningsmolekyl två är också immunoprecipitated inom fraktionen biotin.I den tidiga fasen av nefrotoxisk nefrit ett reducerat uttryck för cellytan nephrin observeras i nefrotoxiska nephrit djur jämfört med kontroller. Densitometic analys visar i själva grad en betydande minskning av biotin laded nephrin i nefrotoxiska nefritsdjur jämfört med kontrollanter. Kvantitativ analys av den totala nephrin till aktin förhållandet avslöjar inga signifikanta skillnader mellan kontroll och nefrotoxiska nephritis möss.Dessutom observeras lika stora mängder podocyter hos nefrotoxisk nefrit och kontrolldjur. I sen nefrotoxisk nephrit uppvisar nefrotoxiska nefrotetiska djur en återhämtning av nephrinuttryck utan signifikanta skillnader i cellytan nephrin mätt mellan kontroll och nefrotoxiska nefrotiskt möss och en total total nephrin-reduktion av nefrotoxiska nefrotiskt djur. Vidare är podocyte nummer minskade jämfört med kontroll djur.Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att hålla sprutor bubblan fri under deras anslutning för att undvika luft emboli av glomeruli och att arbeta under iskalla förhållanden när njurperfusion har startat. Efter detta förfarande andra metoder som isolering av glomeruli RNA och protein kan utföras för att svara på ytterligare frågor om protein uttryck eller interaktioner i friska och sjuka njurar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av intermediära filamentproteiner från flera musvävnader för att studera åldringsrelaterade posttranslationella modifieringar

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rening av biotinylerade cellytaproteiner från<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Epitelceller

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Ser utåt: isolering av Cyanobakterial släppt kolhydrat polymerer och proteiner

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Extremt snabb och specifik metabolisk märkning av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisera cellulära proteiner med In-cell Snabb fotokemisk oxidation av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analys av neutral lipidsyntes i Sackaromyces cerevisiae av metabolisk märkning och tunnskiktskromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...