Name: isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins
Uploaded: 2019-01-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Yazarlar Blanka Duvnjak onun olağanüstü teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) WO1811/2-1 M.W. ve QU280/3-1 için IQ tarafından desteklenmiştir Sermaye sağlayıcı çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, yayımlamaya karar ve el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Fareler bir in-house cins yerel hayvan bakım tesisi veya Javier Labs Fransa olarak elde edilmiştir. İncelemeler bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanımı (ABD ulusal kurumları, Sağlık Yayın No 85-23, 1996 revize) için Kılavuzu'nda açıklanan yönergelere göre yapılmıştır. İlgili kurumsal onayları uygun olarak tüm hayvan deneyleri gerçekleştirilmiştir (eyalet hükümeti LANUV referans numarası AZ:84-02.04. 2016.A435).
1. hazırlanması çözümleri, donatım ve aygı...

<ol>
	<li>Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+biology+for+the+bedside.">Podocyte biology for the bedside.</a> American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Arrestin2+mediates+nephrin+endocytosis+and+impairs+slit+diaphragm+integrity.">beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).</li><li>Quack, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+alpha+mediates+beta-arrestin2-dependent+nephrin+endocytosis+in+hyperglycemia.">PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia.</a> Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+Trafficking+at+the+Mature+Podocyte+Slit+Diaphragm.">Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm.</a> Frontiers in Pediatrics. 5, 32 (2017).</li><li>Swiatecka-Urban, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+trafficking+in+podocyte+health+and+disease.">Membrane trafficking in podocyte health and disease.</a> Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).</li><li>Soda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+dynamin,+synaptojanin,+and+endophilin+in+podocyte+foot+processes.">Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).</li><li>Kestila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positionally+cloned+gene+for+a+novel+glomerular+protein--nephrin--is+mutated+in+congenital+nephrotic+syndrome.">Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome.</a> Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).</li><li>Martin, C. E., Jones, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrin+Signaling+in+the+Podocyte:+An+Updated+View+of+Signal+Regulation+at+the+Slit+Diaphragm+and+Beyond.">Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302 (2018).</li><li>Nielsen, J. S., McNagny, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+podocalyxin+in+health+and+disease.">The role of podocalyxin in health and disease.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).</li><li>Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27+effector+Slp2-a+transports+the+apical+signaling+molecule+podocalyxin+to+the+apical+surface+of+MDCK+II+cells+and+regulates+claudin-2+expression.">Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression.</a> Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).</li><li>Tossidou, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytic+PKC-alpha+is+regulated+in+murine+and+human+diabetes+and+mediates+nephrin+endocytosis.">Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis.</a> Public Library of Science One. 5 (4), 10185 (2010).</li><li>Qin, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+nephrin+triggers+its+internalization+by+raft-mediated+endocytosis.">Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).</li><li>Waters, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+dynamin-dependent+endocytosis+of+nephrin.">Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).</li><li>Zhang, X., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+tyrosine+kinases+endocytosis+in+endothelium:+biology+and+signaling.">Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling.</a> Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).</li><li>Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+trafficking+mechanisms+in+endothelial+cells+as+modulators+of+the+tumor+vasculature+and+targets+of+antiangiogenic+therapies.">Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).</li><li>Satchell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+glomerular+endothelial+cells+expressing+fenestrations+in+response+to+VEGF.">Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF.</a> Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).</li><li>Takemoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+large+scale+isolation+of+kidney+glomeruli+from+mice.">A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice.</a> American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+glomeruli+from+mice:+A+practical+approach+for+beginners.">Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners.</a> Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).</li><li>Haase, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vivo+method+to+quantify+slit+diaphragm+protein+abundance+in+murine+proteinuric+kidney+disease.">A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease.</a> Public Library of Science One. 12 (6), 0179217 (2017).</li><li>Satoh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKClambda+maintains+the+integrity+of+the+glomerular+slit+diaphragm+through+trafficking+of+nephrin+to+the+cell+surface.">aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface.</a> Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).</li><li>Tomas, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+type-1+domain-containing+7A+in+idiopathic+membranous+nephropathy.">Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy.</a> New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).</li><li>Daniels, G. M., Amara, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+neurotransmitter+transporters+at+the+cell+surface.">Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface.</a> Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).</li><li>Ougaard, M. K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Nephrotoxic+Nephritis+as+a+Model+of+Chronic+Kidney+Disease.">Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease.</a> International Journal of Nephrology. 2018, 8424502 (2018).</li><li>Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+membranous+glomerulonephritis+in+rats.+Quantitative+studies+of+glomerular+immune+deposit+formation+in+isolated+glomeruli+and+whole+animals.">Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals.</a> Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).</li></ol>

Sunulan Yöntem glomerular RNA veya protein araştırmak için glomeruli başarılı yalıtım sağlar. Buna ek olarak, birincil glomerular hücre kültürlerinde izole glomeruli gerçekleştirilir. Biotin glomerular yalıtım daha önce uyguladıysanız, glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme gerçekleştirilebilir. Bu yöntemle vivo içinde glomerular hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu ve protein bereket yarı Nefelometri mümkündür. Başarıyla glomerular hücre yüzey proteini bereket...

Proteinüri glomerular yaralanma özelliğidir ve genellikle glomerular filtre1bozulma eşlik eder. Glomerular filtre Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes oluşur. Glomerular filtre hassas moleküler yapısını son derece dinamik hücre yüzey protein hem sağlıklı ve hastalıklı böbrekler2,3,4,5' te,6 kaçakçılığı olup . Endositoz hücre yüzey proteinlerin podocytes7yaşam için temel olarak gösterilmiştir. Nephrin ve podocalyxin podocytes ifade edilen transmembran proteinler vardır. Podocalyxin bir sialoglycoprotein podocytes8,9,10ikincil ayak süreçlerinin kaplama ise Nephrin glomerular yarık diyafram belkemiğidir. Endositik kaçakçılığı daha önce nephrin podocalyxin3,11,12,13,ve14için gösterilmiştir.
Bizim bilgi en iyi şekilde, endositoz hücre yüzey proteinlerin henüz literatürde glomerular endotel hücrelerinde tarif edilmiştir değil. Ancak, endotel hücreleri genel olarak tüm gerekli proteinler endositoz (Yani, clathrin bağımlı, Sal-bağımlı endositoz)15,16farklı türleri için hızlı. Bu nedenle, endotel hücre yüzey kaçakçılığı, örneğin, vasküler endotel (VE) kullanarak bu yöntemle ele-cadherin ve hücre içi adezyon molekülü (ICAM-2) bir hücre olarak yüzey glomerular endotel hücreleri17 için işaretleyici protein .
Ne yazık ki, hiçbir doğru vitro modeli hangi hücre yüzey proteini kaçakçılığı okudu olabilir hassas üç katmanlı glomerular filtresi vardır. Böylece bu yöntemin hedeftir glomerular protein kaçakçılığı vivo içindeçalışmaya. Ayrıca, bu iletişim kuralını glomeruli, daha da glomerular RNA, proteinler veya hücre Analizi etkinleştirme izole konularında bilgi sağlar. Farklı tarafından açıklanan teknikleri benzer glomerular yalıtım18,19gruplandırır.
Daha önce biz ve diğerleri ex vivo glomerular hücre yüzey proteinlerin biotinylation2,3,4,20,21tarafından etiketleme kullandık. Ancak, bu ex vivo yöntemde, izole glomeruli endositik ticareti etkileyebilecek mekanik stres maruz bırakıldı. Alternatif olarak, glomerular hücre yüzey proteinlerin ayirt etiketleme kapsamlı edebiyat2,20,22yılında kullanılmıştır. Bu yöntemle ancak, az sayıda protein bir slayt içinde analiz edilebilir ve Nefelometri ayirt görüntülerin genellikle zordur.
Bu roman vivo Yöntem glomerular hücre yüzey proteini bolluk ve kaçakçılığı doğru içinde sağlıklı ve hastalıklı böbrekler çalışmaya güvenilir bir aracı sunuyor ve ek olarak ayirt testleri kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td>PZN:01320422</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors, for cut into the aorta</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for abdominal cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery until the abdomen is opened</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EZ-link Sulfo-NHC-LC-Biotin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21335</td>
			<td>biotin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Dynabeads Untouched Mouse T-cells</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">11413D</td>
			<td>to embolize glomeruli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Collagenase A</td>
			<td style="width:77px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10103578001</td>
			<td>to digest kidney tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">DynaMag-2</td>
			<td style="width:77px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">123.21D</td>
			<td>Magnet catcher</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">100&#181;m cell stainer</td>
			<td style="width:77px;">Greiner-bio</td>
			<td style="width:101px;">542000</td>
			<td>for glomerular isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Axiovert 40 CFL</td>
			<td style="width:77px;">Zeiss</td>
			<td style="width:101px;">non available</td>
			<td>to confirm glomerular purity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">TissueRuptor</td>
			<td style="width:77px;">Quiagen</td>
			<td style="width:101px;">9002755</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">CHAPS</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">C3023</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Tris-HCL</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T5941</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaCl</td>
			<td style="width:77px;">VWR chemicals</td>
			<td style="width:101px;">27810295</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">NaF</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">201154</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">EDTA</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">E5134</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">ATP</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">34369-07-8</td>
			<td>for lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">23225</td>
			<td>Follow the manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">nephrin antibody</td>
			<td style="width:77px;">Progen</td>
			<td style="width:101px;">GP-N2</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Polyclonal goat anti-podocalyxin antibody</td>
			<td style="width:77px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:101px;">AF15556-SP</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Streptavidin Agarose Resin</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">20347</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Protein A sepharose CL-4B</td>
			<td style="width:77px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17096303</td>
			<td>for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">polyclonal rabbit anti-p57 antibody</td>
			<td style="width:77px;">SCBT</td>
			<td style="width:101px;">sc-8298</td>
			<td>for Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">mouse monoclonal anti-beta actin antibody, clone AC-74</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A2228</td>
			<td>Western blot loading control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">rabbit anti-p44/42</td>
			<td style="width:77px;">cell signalling</td>
			<td style="width:101px;">4695</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Pierce High sensitivity streptavidin-HRP</td>
			<td style="width:77px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:101px;">21130</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse ICAM-2 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF774</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">polyclonal mouse anti-VE-cadherin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF1002</td>
			<td>for westernblot</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of glomeruli and in vivo labeling of glomerular cell surface proteins

Proteinüri Poşlu endotel, glomerular membran ve podocytes onların yarık zarlar ile oluşan glomerular filtre bozulma oluşur. Glomerular filtre, özellikle yarık diyafram, narin yapısı farklı hücre yüzey proteinleri etkileşimi üzerinde dayanır. Bu hücre yüzey proteinleri eğitim defa vitro çalışmalar veya histolojik analiz için sınırlı olmuştur. Burada, glomerular hücre yüzey proteinleri fizyolojik ve etyopatogenezi koşullar altında çalışma sağlayan yöntem, etiketleme bir fare içinde vivo biotinylation mevcut. Bu iletişim kuralı fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi bir proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirme hakkında bilgi içerir. Yarı Nefelometri glomerular hücre yüzey bereket hazır bu roman yöntemi ve tüm proteinler biotin perfüzyon için erişilebilir olduğunu ve immunoprecipitation okudu. Buna ek olarak, izolasyon-in glomeruli ya da biotinylation olmadan daha fazla çözümleme glomerular RNA ve protein hem de birincil glomerular hücre kültürü (Yani, birincil podocyte hücre kültürü) sağlar.

Glomeruli doğru bir şekilde ayırmak için fare böbrekler PBSCM ile ilk sıvı gereklidir. PBSCM ile perfüzyon böbrekler soluk (Şekil 1A) döner. Glomeruli manyetik boncuklar ile embolizasyon (Şekil 1B) böbrek yüzeyinde kahverengi noktalar olarak görünür. Glomeruli yalıtım mıknatıs catcher ile kirlenme böbrek tubuli (Şekil 1C) ile g...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins at JoVE.com

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Burada fare vivo biotin ile glomerular hücre yüzey proteinlerin etiketleme için bir iletişim kuralı mevcut. Bu protokolü nasıl fare böbrekler sıvı, glomeruli ayırma ve ilgi proteinin endojen immunoprecipitation gerçekleştirmek yönergeler içerir.

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Bu yöntem, nefroloji alanındaki hücre yüzeyproteininin proteinürik böbrek hastalığında değil, proteinürik tespüleden rolü ile ilgili anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, hücre yüzeyi protein ihyasının in-vivo çalışmasını kolaylaştırması ve deney başına birden fazla proteinin analiz edilebilmiş olmasıdır. Bu yöntem glomerüler hücre yüzeyi ticareti hakkında bilgi sağlasa da, izolasyon teknikleri ile perfüzyona sahip ve erişilebilen diğer organ sistemlerine de uygulanabilir.Parmak ucuna yanıt eksikliğini onaylayarak ve anestezili farenin ventral tarafını %70 izopropil ile dezenfekte ederek başlayın. Sternum pelvis deri ile bir medyan kesim yapmak ve karın fasya deri kaldırmak için cımbız kullanın. Karın orta hattının her iki tarafında deri kesin ve ksifoid için mesane karın kas tabakası ile bir orta yapmak.Kasları dört çeyreğe bölmek için makas ve forceps kullanın ve hayvanların boynuna doğru üst iki kadranda güvenli iki cerrahi kelepçe kullanın. Bir diseksiyon mikroskobu altında hayvan yerleştirin ve visseral organları bir kenara taşımak için steril bir takas kullanın. Ince makas kullanarak, hepatik frenik bağ kesti.Ince cerrahi cımbız kullanarak, renal arterlerin hepatik mezenterik arter branial etrafında bir dikiş yerleştirin. Ve aort çevresinde, böbrek arterlerine proksimal, böbreküstü bezinde. Fasya, yağ ve diğer doku distal aort ücretsiz.Sonra, bifurkasyon yükseklikte vena kava ve aort kelepçe ve renal arterlerin aort distal etrafında başka bir dikiş yerleştirin. Proksimal aort sütür sıkılaştırmak için cımbız kullanın, kan akışını zayıflatan ve aort çapı küçük bir delik yarısı aort içine, böbrek arterlere distal kesti. Aort içine beş mililitre buz gibi pbs artı kalsiyum ve magnezyum içeren 10 mililitrelik bir şırıngaya bağlı 10 santimetrelik bir kateter yerleştirin.Ve kateteri hazırlanan bağlarla düzeltin. Sonra dakikada iki mililitre akış hızında böbrekler perfüzyon başlar. Böbrek arterlerinde renal ven içine bir delik kesmek ve hepatik ve mezenterik arterler etrafında dikiş sıkma için ince makas kullanarak.PBS tüm hacmi teslim edildikten sonra yüzey etiketleme için mililitre biotin başına 0,5 miligram ile desteklenen buz gibi pBS artı kalsiyum ve magnezyum beş mililitre perfusat ile değiştirin. Dakikada iki mililitre akış hızında böbrekleri perfüzyon devam edin. Tüm hacim teslim edildiğinde, kateter için 100 milimolar glisin ile takviye buz soğuk PBS artı kalsiyum ve magnezyum beş mililitre içeren bir şırınga takın.Glomeruli' yi glisin çözeltisinin beş mililitresini dakikada iki mililitre akış hızıyla söndürün. Sonra buz soğuk PBS artı kalsiyum ve magnezyum dakikada iki mililitre akış hızı mililitre başına mililitre başına manyetik boncuk 200 mikrolitre ile takviye beş mililitre ile böbrekler perfuse. Glomerulin kahverengi manyetik boncuklarla embolizasyonu böbrek yüzeyinde görünür olacaktır.Tüm boncuklar teslim edildiğinde böbreklerin kapsül kaldırmak ve hilum de böbrekler hasat. PBS artı kalsiyum ve magnezyum 15 mililitre içeren bir 10 santimetre hücre kültür çanak böbrekler yerleştirin. Mümkün olan en küçük parçalar halinde böbrekler kesmek için yeni bir çift kenarlı bıçak kullanın.37 santigrat derece 30 dakika kollajenaz A bir mililitre içeren iki mililitretüp içine doku aktarın, modifiye edilmiş bir 1000 mikrolitrelik pipet ucu ile sindirim öncesi ve sonrası yavaşça doku çözeltisi karıştırma. Kuluçka sonunda, sindirilmiş dokuyu 100 mikron luk bir süzgeçten geçirin. Hücre süzgeç için kalan doku püre bir hücre kazıyıcı ve buz gibi PBS artı kalsiyum ve magnezyum kullanın.Taze buz soğuk PBS artı kalsiyum ve magnezyum ile 50 mililitreye kadar böbrek tek hücre süspansiyon son hacmi ni getirin ve santrifüj ile böbrek hücrelerini toplamak. Supernatant çıkarın sonra biraz daha az ile pelet askıya 1.5 buz soğuk PBS mililitre artı kalsiyum ve magnezyum girdap ve yeni bir iki mililitrelik tüp içine glomerüler süspansiyon aktarın. Glomeruli yıkamak için, glomeruli toplamak için bir mıknatıs içine tüp yerleştirin.Bir dakika sonra, supernatant kaldırmak için 1000 mikrolitrelik pipet kullanın. Ve tüpü mıknatıstan çıkarın. Dokulara bir mililitre PBS artı kalsiyum ve magnezyum ekleyin.Pipet glomeruli yukarı ve aşağı bir kez ve girdap hücreleri. Tüpü mıknatısa geri verin ve glomerruliyi az önce gösterildiği gibi tekrar yıkayın. 40-100 X büyütmede ışık mikroskobu analizi ile numune saflığı en az %90'a ulaşana kadar.Sonra santrifüj tarafından manyetik boncuk safglomerültoplamak. %95'ten daha büyük bir saflık elde etmek için glomerulin gösterildiği gibi iyice yıkanması gerekiyordu. Biotin perfüzyonu, biotin'deki kılcal döngülerin etiketletilmesine yardımcı dır ancak perfüze fare böbreklerinde kontrol edilmez.Glomerüler ekstrelerin biotin fraksiyonunun immün çökeltisi glomerüler transmembran proteinlerinin nefrin ve podokalsinin biotin ile immünpresipite olduğunu, ancak kontrol fraksiyonu ile olmadığını ortaya koymaktadır. İmmünoprepititated fraksiyonun streptavidin ile boyanması, biotin perfüzyonda biotin kondisyonlu nefrin infilan ama perfüzyonlu hayvanları kontrol edemeyen nefrin varlığını daha da doğrular. Endotel proteini vasküler endotel kadherin ivediliği ve hücre içi adezyon molekülü iki de biotin fraksiyonu içinde immünopsipitated vardır.Nefrotoksik nefritin erken evresinde nefrotoksik nefrit hayvanlarda kontrollere göre hücre yüzeyi nefrin azaldığı gözlenmiştir. Nitekim densitometik analiz, nefrotoksik nefrit hayvanlarda denetleyicilere göre biotin laded nefrinin önemli bir azalma göstermektedir. Toplam nefrin-aktin oranının nicel analizi kontrol ve nefrotoksik nefrit fareler arasında anlamlı bir fark olmadığını ortaya koymaktadır.Buna ek olarak, nefrotoksik nefrit ve kontrol hayvanlarında eşit miktarda podosit gözlenir. Geç nefrotoksik nefritte, nefrotoksik nefrit iktisadi hayvanlar, hücre yüzeyi nefrininde kontrol ve nefrotoksik nefrit fareler arasında anlamlı bir farklılık olmayan nefrin ekspresyonunun iyileşmesi ve nefrotoksik nefrittik hayvanlarda toplam nefrin azalması ile birlikte ortaya çıkar. Ayrıca, podosit sayıları kontrol hayvanlara göre azalır.Bu prosedürü denerken, glomeruli hava embolisi önlemek için kendi bağlantısı sırasında şırınga kabarcık ücretsiz tutmak ve böbrek perfüzyon başladıktan sonra buz soğuk koşullar altında çalışmak için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürütaki ard›ndan glomeruli RNA ve protein izolasyonu gibi diğer yöntemler de sağlıklı ve hastalıklı böbreklerde protein ekspresyonu veya etkileşimleri ile ilgili ek sorulara cevap verebilmek için gerçekleştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Biyotinile Hücre Yüzey Proteinlerinin Arındırılması<emRhipicephalus microplus</em&gt; Epitelyal Gut Hücreleri

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

RNA In Vivo'nun 4-Thiouracil (Ers4tU) ile Son Derece Hızlı ve Spesifik Metabolik Etiketlemesi

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...