बैक्टीरियल CRISPR-Cas9 प्रणाली ने जीवन वैज्ञानिकों के लिए प्रायोगिक विकल्पों में काफी वृद्धि की है । हालांकि, कई CRISPR दृष्टिकोण अलग-अलग कोशिकाओं में कई गाइड आरएनए के एक साथ वितरण पर निर्भर करते हैं। स्ट्रिंग असेंबली जीआरएनए क्लोनिंग एक ही क्लोनिंग चरण में मल्टीप्लेक्स जीएनए अभिव्यक्ति वैक्टर की सरल और तेज पीढ़ी की अनुमति देता है।
लेकिन STAgR न केवल सरल है, यह कुशल, सस्ता और अनुकूलित करने में आसान भी है। शुरू करने के लिए, STAgR डीएनए स्ट्रिंग के लिए आगे प्रवर्धन प्राइमर के लिए N20 gRNA दृश्यों को ओवरहांग्स के रूप में जोड़ें । एक पारंपरिक पाड़ के लिए आगे प्राइमर, पाड़ फॉरवर्ड प्राइमर के लिए पांच प्रधानमंत्री सेंस gRNA दृश्यों जोड़ें, या एक MS2 युक्त पाड़ के लिए सैम फॉरवर्ड प्राइमर के लिए ।
इसके बाद, उपयोग किए गए विशिष्ट प्रमोटरों और तारों के आधार पर आरपी प्राइमर चुनने, रिवर्स प्राइमर दृश्यों में रिवर्स पूरक N20 gRNA दृश्यों को जोड़ें। गिब्सन विधानसभा के लिए व्यक्तिगत क्लोनिंग टुकड़े पैदा शुरू करने के लिए, एक ट्यूब के लिए उच्च निष्ठा बफर के 10 माइक्रोलीटर हस्तांतरण । 10 मिलिमोलर डीएनटीपीएस का एक माइक्रोलीटर और दोनों 100 माइक्रोमोलर ओवरहांग प्राइमर के 0.25 माइक्रोलीटर जोड़ें।
डीएनए टेम्पलेट स्ट्रिंग, या वेक्टर के 10 नैनोग्राम और डीएमएसओ के 1.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। 49.5 माइक्रोलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए पर्याप्त पानी जोड़ें, और फिर एचएफ पॉलीमरेज के 0.5 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक थर्मोसाइकिलर पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें, जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित है।
इसके बाद पीसीआर रिएक्शन से 5.5 माइक्रोलिटर एलिकोट लें। सभी एलिकोट्स में लोडिंग डाई जोड़ें, और इसे 1% एगरेग्याड जेल पर लोड करें। आकार घटाने के लिए एक उपयुक्त डीएनए सीढ़ी लोड करें, और 30 मिनट के लिए 120 वोल्ट पर एक उपयुक्त जेल-रनिंग बफर में जेल चलाएं।
जबकि जेल चल रहा है, प्रतिबंध एंजाइम के साथ प्रदान की बफर के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें, और ०.५ माइक्रोलीटर डीपीएनआई वेक्टर पीसीआर प्रतिक्रिया के शेष ४४.५ माइक्रोलीटर के लिए पीसीआर के दौरान इस्तेमाल अवशिष्ट प्लाज्मिड टेम्पलेट को हटाने के लिए । 30 से 60 मिनट तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि एम्प्लिकॉन सही आकार हैं।
डीएनए शुद्धिकरण शुरू करने के लिए, पीसीआर उत्पाद के प्रति एक माइक्रोलीटर चुंबकीय मोतियों के 1.8 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। चुंबक का उपयोग करके, डीएनए टुकड़ों में मोतियों को अवशिष्ट तरल से अलग करें।
मोतियों को धोने के लिए, इसे पूरी तरह से खर्च किए बिना 70% इथेनॉल के साथ गोली कुल्ला। इस धोे को एक अतिरिक्त समय दोहराएं। एक पिपेट का उपयोग करके, सभी इथेनॉल को हटा दें और पैलेट हवा को सूखने दें।
फिर 15 से 20 माइक्रोलीटर पानी जोड़ें, और पैलेट को मिलाने और नीचे पीने के लिए पिपेट करें और गोली को भंग करें। मोतियों को तरल से अलग करने के लिए चुंबक का प्रयोग करें। स्पष्ट सुपरनेट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
इसके बाद, डीएनए सांद्रता निर्धारित करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। सबसे पहले, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप से 5x आइसोथर्मल रिएक्शन बफर तैयार करें। गिब्सन असेंबली मास्टर मिक्स के लिए, 5x आइसोथर्मल रिएक्शन बफर के 320 माइक्रोलीटर को 697 माइक्रोलीटर पानी के साथ मिलाएं।
टी5 एक्सोन्यूक्लिज के 3 माइक्रोलीटर, डीएनए पॉलीमरेज के 20 माइक्रोलीटर और ताक डीएनए लिगाज़ के 160 मैकरोलिटर जोड़ें। विधानसभा मास्टर मिक्स के 7.5 माइक्रोलीटर को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित वेक्टर में डालने के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें।
नमूनों को 45 से 60 मिनट तक 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, बाद में परिवर्तन के लिए बर्फ पर या 20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें। जब बैक्टीरिया को बदलने के लिए तैयार है, बर्फ पर रासायनिक सक्षम TOP10 ई. कोलाई बैक्टीरिया गल ।
इसके बाद, गिब्सन मिक्स के पांच माइक्रोलीटर को सक्षम बैक्टीरिया के 50 माइक्रोलीटर में जोड़ें, और ट्यूब के नीचे धीरे-धीरे फ्लिकिंग करके मिलाएं। 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट। बैक्टीरिया को हीट-शॉक करने के लिए ट्यूब को 42 डिग्री सेल्सियस वॉटर बाथ या हीट ब्लॉक में 45 सेकंड के लिए रखें।
इसके बाद ट्यूबों को वापस बर्फ पर डाल दें। बैक्टीरिया के लिए एसओसी माध्यम के २५० माइक्रोलीटर जोड़ें, और उन्हें 30 से ४५ मिनट के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ठीक होने दें । बैक्टीरिया के बरामद होने के बाद, उन्हें 1.5% पौंड एगर प्लेटों पर प्लेट करें जिसमें 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एम्पिसिलिन होता है।
रात के समय 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। शुरू करने के लिए, प्रत्येक निर्माण के लिए 200 माइक्रोलीटर पीसीआर रिएक्शन ट्यूब के कम से कम दो सेट तैयार करें। 100 माइक्रोलीटर एलबी माध्यम के साथ प्रतिक्रिया ट्यूबों के सेट में से एक भरें, जिसमें एम्पिसिलिन के 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर होते हैं।
एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करना, एक बैक्टीरियल कॉलोनी से जैविक सामग्री को खरोंच करें, और इसे एक खाली 200 माइक्रोलीटर पीसीआर रिएक्शन ट्यूब के नीचे फैलाएं। तुरंत दूसरी संबंधित प्रतिक्रिया ट्यूब है कि एलबी माध्यम शामिल करने के लिए पिपेट टिप हस्तांतरण। यह सुनिश्चित करने के लिए टिप को चारों ओर घुमाएं कि कुछ बैक्टीरिया एलबी मीडिया में स्थानांतरित हो जाएं।
बाद में उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। इसके बाद पीसीआर मास्टर मिक्स प्रति रिएक्शन ट्यूब के 10 माइक्रोलीटर तैयार करें, जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में बताया गया है । एलबी मीडिया के बिना लेबल पीसीआर रिएक्शन ट्यूब में पीसीआर मास्टर मिक्स के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।
थर्मोसाइकिलर का उपयोग करके, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, प्रवर्धित टुकड़ों में लोडिंग डाई जोड़ें, और उन्हें 1% एगरेज़ जेल पर लोड करें। आकार घटाने के लिए एक उपयुक्त डीएनए सीढ़ी लोड करें, और 30 मिनट के लिए 120 वोल्ट पर एक उपयुक्त जेल-रनिंग बफर में जेल चलाएं।
इस्तेमाल किए गए प्रमोटरों, जीआरएनए मचानों और N20 दृश्यों की संख्या के व्यक्तिगत आकार को जोड़कर एम्प्लिकॉन के सैद्धांतिक आकार की गणना करें। कॉलोनी पीसीआर के परिणामों से, सही बैंड आकार के आधार पर बैक्टीरियल क्लोन की पहचान करें, और क्या वे सही वैक्टर को आश्रय देने की संभावना रखते हैं। इसी 100 माइक्रोलीटर संस्कृति का उपयोग करके, 2.5 मिलीलीटर रातोंरात एलबी संस्कृति का टीका 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एम्पिसिलिन होता है।
12 घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फिर, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्लाज्मिड डीएनए निकालने के लिए एक वाणिज्यिक प्लाज्मिड मिनी-किट का उपयोग करें। इस प्रक्रिया में, स्ट्रिंग असेंबली जीआरएनए क्लोनिंग का उपयोग जल्दी से जीआरएनए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड उत्पन्न करने के लिए किया जाता है।
STAgR टुकड़े प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया PCRs का एक विशिष्ट परिणाम यहां देखा जाता है । छह एम्प्लिकॉन रैखिक डीएनए टुकड़ों का प्रतिनिधित्व करते हैं, प्रत्येक में उनके सिरों पर व्यक्तिगत gRNA N20 दृश्यों होते हैं। प्लाज्मिड बैकबोन को gRNA1 और gRNA6 के लक्षित दृश्यों के साथ बढ़ाया जाता है, और इसलिए गिब्सन असेंबली के लिए दो अन्य पीसीआरएस के लिए आवश्यक ओवरलैप के पास है।
शुद्धिकरण के बाद, वैक्टर और आवेषण के लिए कम से कम एक माइक्रोग्राम की डीएनए उपज प्राप्त की जा सकती है। गिब्सन असेंबली के बाद, बैक्टीरियल परिवर्तन के परिणामस्वरूप 100 से 700 बैक्टीरियल कॉलोनियां हैं। छह GRNA कैसेट के साथ एक STAgR प्रोटोकॉल के बाद कॉलोनी पीसीआर के माध्यम से 22 जीवाणु कालोनियों के प्रतिनिधि विश्लेषण, इंगित करता है कि सात क्लोन पूर्ण विधानसभा के लिए अपेक्षित एम्प्लिकॉन आकार दिखाते हैं ।
अन्य क्लोनों की संभावना STAgR वैक्टर प्राप्त, एक से पांच gRNA कैसेट युक्त है, जबकि एक क्लोन पूरी तरह से खाली है । एक बार महारत हासिल होने के बाद इस तकनीक को कुछ ही घंटों में किया जा सकता है। ठीक से प्रदर्शन किया, यह एक काम सप्ताह से भी कम समय में मल्टीप्लेक्स gRNA अभिव्यक्ति वैक्टर की एक भीड़ की पीढ़ी की अनुमति देता है ।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, N20 ओवरहांग प्राइमर के सही असाइन और संयोजन पर ध्यान देना महत्वपूर्ण है। इस वीडियो को देखने के बाद, आपको अपनी खुद की मल्टीप्लेक्स गाइड आरएनए एक्सप्रेशन वैक्टर बनाने के तरीके पर एक अच्छी समझ होनी चाहिए।