Diese Methoden können helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neurologie und Ophthalmologie zu beantworten, und helfen, eine Vielzahl von Retinopathien und netzhautmanifestationen in verschiedenen Nagetiermodellen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass nichtinvasive Längsschnittuntersuchungen durchgeführt werden können, wodurch die Variabilität verringert und die Anzahl der für die Experimente benötigten Tiere reduziert werden kann. Diese Methoden ermöglichen eine quantitative In-vivo-Untersuchung von Struktur und Funktion, die verwendet werden kann, um die pathologischen Bedingungen zu untersuchen oder den potenziellen Nutzen neuartiger Therapeutika zu bewerten.
Vor allem die Anwendung der optischen Kohärenztomographie in Nagetiermodellen ist jedoch nach wie vor eine Herausforderung, vor allem wegen der geringen Augengröße. Die Verfahren werden Michael Dietrich, ein Doktorand aus unserem Labor, demonstrieren. Nach der Anästhesisierung des Nagetiers, wenden Sie einen Tropfen Phenylephrin Tropicamid edonauf jedes Auge für die Pupillendilatation.
Wischen Sie überschüssige Saugentropfen nach einer Minute nass ab. Und schmieren Sie die Augen Methylcellulose-basierte ophthalmologische Gel, um zu vermeiden, das Auge austrocknen und eine trübe Hornhaut zu schaffen. Verwenden Sie dann Zangen, um eine benutzerdefinierte Kontaktlinse auf das Auge zu legen.
Drücken Sie die Starttaste in der rechten Ecke der Anzeige des Bedienfelds, um den Erfassungsmodus zu starten. Als nächstes, um das linke Auge zu fotografieren, positionieren Sie den Halter, um sicherzustellen, dass die linke Augenlampe des Nagetiers der Kamera zusieht. Legen Sie die Filterebene auf R fest, und wählen Sie BR und OCT für die Fundusabbildung und B-Scan-Erfassung in der Software aus.
Legen Sie als Nächstes den Fokusabstand auf ca. 38 Dioptrien fest, indem Sie den Fokusknopf auf der Rückseite der Kamera verwenden. Und zoomen Sie auf die Netzhaut, bis der OCT-Scan auf dem Bildschirm sichtbar ist. Um dann einen Strahlweg durch die Mitte der Pupille zu gewährleisten, mit einem orthogonalen Winkel der Netzhaut in allen Ebenen, positionieren Sie die optische Scheibe in der Mitte des beleuchteten Feldes.
Und stellen Sie die horizontale und vertikale Linie B-Scans auf eine horizontale Ebene durch Drehen des Halters. Wählen Sie auf dem Softwarebildschirm den Lautstärkescanmodus aus und stellen Sie ihn auf 25 B-Scans im hochauflösenden Modus bei 50 automatischer Echtzeit-Tracking ein. Zentrieren Sie die Mitte des Volumenscanrasters auf der optischen Disc, und starten Sie die Erfassung, indem Sie den schwarzen Empfindlichkeitsknopf drücken, und erfassen Sie dann auf dem Bedienfeld.
Stellen Sie nach Abschluss der Erfassung die Filterebene auf A.Select Blue Autofluorescence auf dem Bedienfeld ein. Und passen Sie die Bildhelligkeit mit dem Empfindlichkeitsknopf an. Drücken Sie den Empfindlichkeitsknopf und erfassen Sie dann, um fluoreszierende Zellen oder autofluoreszierende Ablagerungen abzubilden.
Für die Analyse der Volumenscans verwenden Sie die automatisierte Segmentierung der Software des OCT-Geräts, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den Scan klicken. Und wählen Sie Segmentierung und dann Alle Layer aus. Führen Sie eine manuelle Korrektur der Ebenen durch Doppelklicken auf den gewünschten Scan durch.
Wählen Sie Dickenprofil aus. Und klicken Sie auf Layer-Segmentierungen bearbeiten. Wählen Sie jeweils eine Ebene aus.
Und wenn nötig, korrigieren Sie die grüne Linie, indem Sie die roten Punkte verschieben, indem Sie ziehen und an die richtige Position fallen. Wählen Sie als Nächstes die Registerkarte Dicke Karte aus. Wählen Sie das 1, 2, 3 Millimeter ETDRS Raster.
Zentrieren Sie den inneren Kreis auf der optischen Scheibe. Schließlich berechnen Sie die Dicke der Netzhautschichten aus den Dickenwerten, die von der Software für die verschiedenen von Interesse bereitgestellten Netzhautsektoren bereitgestellt werden. Um die Hauptdickenwerte aus Volumenscans zu berechnen, verwenden Sie das gesamte ETDRS-Raster von 1, 2, 3, Millimeter, das einen Winkel von etwa 25 Grad abdeckt, mit Ausnahme des inneren Kreises von einem Millimeter, der die optische Scheibe enthält.
Wählen Sie zunächst eine Plattform aus, um die Nagetiere zu messen. Öffnen Sie das Fenster Voreinstellungen, indem Sie auf die Software doppelklicken. Wählen Sie Neue Gruppe aus, und wählen Sie den Gruppennamen, die Anzahl der Themen, die Arten und Stämme aus.
Wählen Sie im Dropdown-Menü einen variablen Stimulus, eine raumzeitliche Frequenz, kontrastreiche Empfindlichkeit, Geschwindigkeit oder Ausrichtung aus, und drücken Sie Neue Gruppe erstellen. Konzentrieren Sie sich auf die Plattform, indem Sie den Fokusring der Kamera auf der Oberseite der Kammer manipulieren. Und kalibrieren Sie das System, indem Sie den roten Kreis um den schwarzen Kreis auf der Plattform ausrichten.
Als nächstes stellen Sie das Nagetier auf die Plattform und lassen Sie es sich für etwa fünf Minuten an die Umgebung anpassen. Starten Sie dann die Messung, indem Sie den linken Pfeil für ja oder das Quadrat für nein auswählen, wenn das Tier spuren oder nicht verfolgt. Wählen Sie manuell die Schrittgröße des Stimulus aus, indem Sie auf die Pfeile nach oben und unten neben dem variablen Stimulus klicken.
Wählen Sie schließlich die Registerkarte Zusammenfassung aus und klicken Sie auf Datei, Exporttabelle oder Diagramm, um den gewünschten Datensatz zu exportieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Degeneration der inneren Netzhautschichten reduziert wird. Und ein klinischer EAE-Score wird während des EAE-Kurses abgeschwächt, wenn Substanz 1 verabreicht wurde.
Darüber hinaus zeigt OKR eine verbesserte Sehschärfe von Tieren, die mit Substanz 1 behandelt werden, im Vergleich zu unbehandelten MOG EAE-Mäusen, die durch räumliche Frequenzschwellentests über einen Zeitraum von 120 Tagen gemessen werden. Bei der Durchführung von OCT-Messungen ist ein kritischer Schritt die orthogonale Ausrichtung des Laserstrahls in allen Ebenen in Bezug auf die Netzhaut, um die Qualität und Reproduzierbarkeit der Dickenwerte zu gewährleisten. Für die OKR-Technik erfordert die Unterscheidung zwischen Tracking und normalen Verhaltensbewegungen des Tieres eine gewisse Schulung des Prüfers.
Es ist wichtig, für die experimentelle Gruppe geblendet zu werden. Nach diesen Untersuchungen von strukturellen und funktionellen Schäden, die im Zusammenhang mit experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis auftreten, kann das Verfahren auch bei anderen Modellen hilfreich sein, die das visuelle System betreffen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Modelle von Retinopathien oder Sehnervenverletzungen. Diese Techniken ebnen den Weg für die In-vivo-Forschung in den Bereichen Neurologie und Augenheilkunde und sind leicht auf klinische Studien übertragbar.
