Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurologia e dell'oftalmologia e aiutare a valutare una grande varietà di retinopatie e manifestazioni retiniche in vari modelli di roditori. Il vantaggio principale di queste tecniche è che possono essere eseguite indagini longitudinali non invasive, riducendo la variabilità e riducendo il numero di animali necessari per gli esperimenti. Questi metodi consentono un'indagine quantitativa in vivo della struttura e della funzione che possono essere utilizzate per studiare le condizioni patologiche o per valutare la potenziale utilità di nuove terapie.
Tuttavia, soprattutto l'applicazione della tecnologia della tomografia a coerenza ottica nei modelli di roditori è ancora impegnativa, principalmente a causa delle piccole dimensioni degli occhi. A dimostrare le procedure sarà Michael Dietrich, dottorando del nostro laboratorio. Dopo aver anestetizzato il roditore, applicare una goccia di fenilefrina Tropicamide su ogni occhio per la dilatazione pupillare.
Pulire qualsiasi goccia oculare in eccesso bagnata dopo un minuto. E lubrificare gli occhi gel oftalmico a base di metilcellulosa per evitare di asciugare l'occhio e creare una cornea torbida. Quindi utilizzare le forcep per posizionare un obiettivo a contatto personalizzato sull'occhio.
Premere il pulsante Start nell'angolo destro del display del pannello di controllo per avviare la modalità di acquisizione. Successivamente, per immaginere l'occhio sinistro, posizionare il supporto per assicurarsi che il bulbo oculare sinistro del roditore si affaccia sulla fotocamera. Impostare il livello del filtro su R e selezionare BR e OCT per l'imaging fundus dei riflessi blu e l'acquisizione della scansione B nel software.
Quindi, impostare la distanza di messa a fuoco su circa 38 diottrie, utilizzando la manopola di messa a fuoco sul retro della fotocamera. E ingrandire la retina, fino a quando la scansione dello Strumento di personalizzazione di Office non è visibile sullo schermo. Quindi, per garantire un percorso del fascio attraverso il centro della pupilla, con un angolo ortogonale della retina in tutti i piani, posizionare il disco ottico al centro del campo illuminato.
E regolare le scansioni B della linea orizzontale e verticale a un livello orizzontale ruotando il supporto. Nella schermata del software selezionare la modalità di scansione del volume e impostarla su 25 scansioni B in modalità ad alta risoluzione a 50 tracciamenti automatici in tempo reale. Centrare il centro della griglia di scansione del volume sul disco ottico e iniziare l'acquisizione premendo la manopola di sensibilità nera, quindi acquisire sul pannello di controllo.
Al termine dell'acquisizione, impostare il livello del filtro su A.Select Blue Autofluorescence sul pannello di controllo. E regolare la luminosità dell'immagine con la manopola di sensibilità. Premere la manopola di sensibilità e quindi acquisire per immagini celle fluorescenti o depositi autofluorescenti.
Per l'analisi delle scansioni del volume utilizzare la segmentazione automatizzata del software del dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla scansione. Quindi selezionate Segmentazione (Segmentation), quindi Tutti i livelli (All Layers). Eseguire la correzione manuale dei livelli facendo doppio clic sulla scansione desiderata.
Selezionate Profilo spessore (Thickness Profile). Quindi fate clic su Modifica segmentazioni livello (Edit Layer Segmentations). Selezionare un livello alla volta.
E se necessario correggere la linea verde spostando i punti rossi trascinando e rilasciando nella posizione corretta. Selezionare quindi la scheda Mappa spessore. Scegli la griglia ETDRS da 1, 2, 3 millimetri.
Centrare il cerchio interno sul disco ottico. Infine, calcolare lo spessore degli strati retinali dai valori di spessore forniti dal software per i diversi settori retinali di interesse. Per calcolare i valori di spessore principali delle scansioni del volume, utilizzare l'intera griglia ETDRS da 1, 2, 3 millimetri che copre un angolo di circa 25 gradi, escluso il cerchio interno di un millimetro che contiene il disco ottico.
Inizia selezionando una piattaforma per misurare i roditori. Aprire la finestra Preimpostazioni facendo doppio clic sul software. Selezionare Nuovo gruppo e scegliere il nome del gruppo, il numero di soggetti, la specie e i ceppi.
Selezionate uno stimolo variabile, una frequenza spaziotemporale, una sensibilità al contrasto, una velocità o un orientamento nel menu a discesa e premete Crea nuovo gruppo. Concentrati sulla piattaforma manipolando l'anello di messa a fuoco della fotocamera sopra la camera. E calibrare il sistema allineando il cerchio rosso attorno al cerchio nero sulla piattaforma.
Quindi, posiziona il roditore sulla piattaforma e lascialo adattare all'ambiente per circa cinque minuti. Quindi iniziare la misurazione selezionando la freccia sinistra per sì o il quadrato per no, se l'animale tiene traccia o meno rispettivamente. Selezionare manualmente la dimensione del passo dello stimolo facendo clic sulle frecce su e giù accanto allo stimolo variabile.
Infine, selezionare la scheda Riepilogo e fare clic sul file, esportare la tabella o il grafico per esportare il set di dati desiderato. I risultati indicano che la degenerazione degli strati retinali interni è ridotta. E un punteggio EAE clinico viene attenuato durante il decorso EAE quando è stata somministrata la sostanza 1.
Inoltre, l'OKR rivela una migliore acuità visiva degli animali trattati con la sostanza 1 rispetto ai topi MOG EAE non trattati misurati mediante test della soglia di frequenza spaziale per un periodo di 120 giorni. Quando si eseguono misurazioni oct, un passo critico è l'orientamento ortogonale del raggio laser in tutti i piani in relazione alla retina per garantire la qualità e la riproducibilità dei valori di spessore. Per la tecnica OKR, distinguere tra tracciamento e normali movimenti comportamentali dell'animale, richiede un certo addestramento dell'investigatore.
È importante essere accecati per il gruppo sperimentale. A seguito di queste indagini sui danni strutturali e funzionali che si verificano nel contesto dell'encefalomielite autoimmune sperimentale, la procedura può essere utile anche in altri modelli che coinvolgono il sistema visivo, inclusi, a titolo titolo tivo ma non limitato, i modelli di retinopatie o lesioni del nervo ottico. Queste tecniche aprono la strada alla ricerca in vivo nei campi della neurologia e dell'oftalmologia e sono facilmente trasferibili agli studi clinici.
