Disse metodene kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen nevrologi og oftalmologi, og bidra til å evaluere et stort utvalg av retinopatier og retinale manifestasjoner i ulike gnagermodeller. Den største fordelen med disse teknikkene er at ikke-invasive langsgående undersøkelser kan utføres, redusere variasjon og kutte ned antall dyr som trengs for eksperimentene. Disse metodene tillater kvantitativ in vivo-undersøkelse av struktur og funksjon som kan brukes til å undersøke de patologiske forholdene, eller for å evaluere den potensielle nytten av nye terapeutiske midler.
Men spesielt anvendelsen av optisk sammenhengtomografiteknologi i gnagermodeller er fortsatt utfordrende, hovedsakelig på grunn av den lille øyestørrelsen. Demonstrere prosedyrene vil være Michael Dietrich, en ph.d.-student fra laboratoriet vårt. Etter bedøving av gnageren, bruk en dråpe fenylefrintropamid på hvert øye for pupillutvidelse.
Tørk av overflødig øyedråpe våt etter ett minutt. Og smør øynene metylcellulosebasert oftalmisk gel for å unngå å tørke ut øyet og skape en uklar hornhinnen. Bruk deretter tang til å plassere en tilpasset kontaktlinse på øyet.
Trykk på Start-knappen i høyre hjørne av kontrollpanelet for å starte anskaffelsesmodus. Deretter, for å bilde venstre øye, plasser holderen for å sikre at gnagerens venstre øyepære vender mot kameraet. Sett filternivået til R, og velg BR og OCT for blå refleksjoner fundus imaging og B-scan oppkjøp i programvaren.
Deretter setter du fokusavstanden til ca. 38 dioptere ved hjelp av fokusknappen på baksiden av kameraet. Og zoom inn på netthinnen, til OCT-skanningen er synlig på skjermen. Deretter for å sikre en strålebane gjennom midten av eleven, med en ortogonal vinkel på netthinnen i alle plan, plasser optisk plate midt i det opplyste feltet.
Og juster den horisontale og vertikale linje B-skanningen til et horisontalt nivå ved å rotere holderen. På programvareskjermen velger du volumskanningsmodus, og sett den til 25 B-skanninger i høyoppløsningsmodus ved 50 automatisk sanntidssporing. Midt i volumskanningsrutenettet på optisk plate og start oppkjøpet ved å trykke på den svarte følsomhetsknappen, og deretter Acquire på kontrollpanelet.
Når anskaffelsen er fullført, setter du filternivået til A.Select Blue Autofluorescence på kontrollpanelet. Og juster bildelysheten med følsomhetsknappen. Trykk på følsomhetsknappen og hent deretter til bildefluoreserende celler eller autofluorescerende avleiringer.
For analyse av volumskanningene, bruk den automatiske segmenteringen av OCT-enhetens programvare ved å høyreklikke på skanningen. Og velg Segmentering, deretter Alle lag. Utfør manuell korrigering av lagene ved å dobbeltklikke på ønsket skanning.
Velg Tykkelsesprofil. Og klikk på Rediger lagsegmenteringer. Velg ett lag om gangen.
Og om nødvendig korrigere den grønne linjen ved å flytte de røde prikkene ved å dra og slippe til riktig posisjon. Velg deretter kategorien Tykkelseskart. Velg 1, 2, 3 millimeter ETDRS-rutenett.
Midtstill den indre sirkelen på optisk plate. Til slutt beregner du tykkelsen på retinale lag fra tykkelsesverdiene som tilbys av programvaren for de forskjellige retinale sektorene av interesse. For å beregne hovedtykkelsesverdiene fra volumskanninger, bruk hele 1, 2, 3, millimeter ETDRS-rutenettet som dekker en vinkel på ca. 25 grader, unntatt den indre en millimetersirkelen som inneholder optisk plate.
Begynn med å velge en plattform for å måle gnagere. Åpne Presettings -vinduet ved å dobbeltklikke på programvaren. Velg Ny gruppe, og velg gruppenavnet, antall, arten og belastningene.
Velg en variabel stimulans, spatiotemporal frekvens, kontrastfølsomhet, hastighet eller retning i rullegardinmenyen, og trykk Opprett ny gruppe. Fokuser på plattformen ved å manipulere fokusringen på kameraet på toppen av kammeret. Og kalibrer systemet ved å justere den røde sirkelen rundt den svarte sirkelen på plattformen.
Deretter plasserer du gnageren på plattformen og lar den tilpasse seg miljøet i omtrent fem minutter. Start deretter målingen ved å velge venstre pil for ja eller firkanten for nei, hvis dyret sporer eller ikke sporer henholdsvis. Velg trinnstørrelsen på stimulansen manuelt ved å klikke på pil opp og pil ned ved siden av variabel stimulansen.
Til slutt velger du Sammendrag-fanen og klikker på fil, eksporter tabell eller graf for å eksportere ønsket datasett. Resultatene indikerer at degenerasjonen av de indre retinale lagene reduseres. Og en klinisk EAE-skår dempes under EAE-kurset når substans 1 ble administrert.
Videre avslører OKR en forbedret synsskarphet av dyr behandlet med substans 1 sammenlignet med ubehandlede MOG EAE-mus målt ved romlig frekvensterskeltesting over en periode på 120 dager. Når du utfører OCT-målinger, et kritisk trinn er ortogonal orientering av laserstrålen i alle plan i forhold til netthinnen for å sikre kvaliteten og reproduserbarheten av tykkelsesverdiene. For OKR-teknikken krever det å skille mellom sporing og normale atferdsbevegelser av dyret, litt opplæring av utprøveren.
Det er viktig å bli blindet for den eksperimentelle gruppen. Etter disse undersøkelsene av strukturell og funksjonell skade som oppstår i sammenheng med eksperimentell Autoimmune Encefalomyelitt, kan prosedyren også være nyttig i andre modeller som involverer det visuelle systemet, inkludert, men ikke begrenset til modeller av retinopatier, eller optisk nerveskade. Disse teknikkene baner vei for in vivo forskning innen nevrologi og oftalmologi og er lett overførbare til kliniske studier.
