Esses métodos podem ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurologia e oftalmologia, e ajudar a avaliar uma grande variedade de retinopatias e manifestações de retina em vários modelos de roedores. A principal vantagem dessas técnicas é que investigações longitudinais não invasivas podem ser realizadas, reduzindo a variabilidade e reduzindo o número de animais necessários para os experimentos. Esses métodos permitem a investigação quantitativa in vivo de estrutura e função que pode ser usada para investigar as condições patológicas, ou para avaliar a utilidade potencial da nova terapêutica.
No entanto, especialmente a aplicação da tecnologia de tomografia de coerência óptica em modelos de roedores ainda é desafiadora, principalmente por causa do pequeno tamanho dos olhos. Demonstrando os procedimentos estará Michael Dietrich, um estudante de doutorado do nosso laboratório. Após anestesiar o roedor, aplique uma gota de Phenylephrine Tropicamide em cada olho para dilatação pupilar.
Limpe qualquer gota de olho molhada após um minuto. E lubrificar os olhos com gel oftálmico à base de metilcelulose para evitar secar o olho e criar uma córnea turva. Em seguida, use fórceps para colocar uma lente de contato personalizada no olho.
Pressione o botão Iniciar no canto direito do display do painel de controle para iniciar o modo de aquisição. Em seguida, para a imagem do olho esquerdo, posicione o suporte para garantir que a lâmpada do olho esquerdo do roedor fique de frente para a câmera. Defina o nível do filtro para R, e selecione BR e OCT para reflexões azuis fundus imaging e B-scan aquisição no software.
Em seguida, defina a distância de foco para aproximadamente 38 dicóteos, usando o botão de foco na parte de trás da câmera. E dê zoom na retina, até que a varredura de OCT seja visível na tela. Em seguida, para garantir um caminho de feixe através do meio da pupila, com um ângulo ortogonal da retina em todos os planos, posicione o disco óptico no meio do campo iluminado.
E ajuste a linha B horizontal e vertical para um nível horizontal girando o suporte. Na tela do software selecione o modo de varredura de volume e defina-o para 25 B-scans em modo de alta resolução a 50 rastreamento automático em tempo real. Centralize o meio da grade de varredura de volume no disco óptico e inicie a aquisição pressionando o botão de sensibilidade preta e, em seguida, adquira no painel de controle.
Após a conclusão da aquisição, defina o nível do filtro para a A.Select Blue Autofluorescence no painel de controle. E ajuste o brilho da imagem com o botão de sensibilidade. Pressione o botão de sensibilidade e, em seguida, adquira para imagem células fluorescentes ou depósitos autofluorescentes.
Para análise das varreduras de volume, use a segmentação automatizada do software do dispositivo OCT clicando com o botão direito do mouse na digitalização. E selecione Segmentação, em seguida, Todas as Camadas. Execute a correção manual das camadas clicando duas vezes na digitalização desejada.
Selecione O perfil de espessura. E clique em Editar segmentações de camadas. Selecione uma camada de cada vez.
E se necessário corrigir a linha verde movendo os pontos vermelhos arrastando e caindo para a posição correta. Em seguida, selecione o mapa de espessura da guia. Escolha a grade ETDRS de 1, 2, 3 milímetros.
Centralizar o círculo interno no disco óptico. Por fim, calcule a espessura das camadas de retina a partir dos valores de espessura fornecidos pelo software para os diferentes setores de retina de interesse. Para calcular os principais valores de espessura dos volumes, use toda a grade ETDRS de 1, 2, 3 milímetros que cobre um ângulo de aproximadamente 25 graus, excluindo o círculo interno de um milímetro que contém o disco óptico.
Comece selecionando uma plataforma para medir os roedores. Abra a janela Presettings clicando duas vezes no software. Selecione Novo Grupo e escolha o nome do grupo, o número de sujeitos, a espécie e as cepas.
Selecione um estímulo variável, frequência espesso, sensibilidade ao contraste, velocidade ou orientação no menu suspenso e pressione Criar novo grupo. Concentre-se na plataforma manipulando o anel de foco da câmera em cima da câmara. E calibrar o sistema alinhando o círculo vermelho ao redor do círculo negro na plataforma.
Em seguida, coloque o roedor na plataforma e deixe que ele se adapte ao ambiente por cerca de cinco minutos. Em seguida, inicie a medição selecionando a seta esquerda para sim ou para o quadrado para não, se o animal rastreia ou não, respectivamente. Selecione manualmente o tamanho do passo do estímulo clicando nas setas para cima e para baixo ao lado do estímulo variável.
Por fim, selecione a guia Resumo e clique na tabela de arquivo, tabela de exportação ou gráfico para exportar o conjunto de dados desejado. Os resultados indicam que a degeneração das camadas internas da retina é reduzida. E uma pontuação clínica de EAE é atenuada durante o curso EAE quando a substância 1 foi administrada.
Além disso, a OKR revela uma melhor acuidade visual dos animais tratados com substância 1 em comparação com camundongos MOG EAE não tratados medidos por testes de limiar de frequência espacial durante um período de 120 dias. Ao realizar medições de OCT, um passo crítico é a orientação ortogonal do raio laser em todos os planos em relação à retina para garantir a qualidade e a reprodutibilidade dos valores de espessura. Para a técnica OKR, distinguir entre rastreamento e movimentos comportamentais normais do animal, requer algum treinamento do investigador.
É importante ficar cego para o grupo experimental. Após essas investigações de danos estruturais e funcionais ocorridos no contexto da Encefalomielite Autoimune experimental, o procedimento também pode ser útil em outros modelos envolvendo o sistema visual, incluindo, mas não se limitando aos modelos de retinopatias, ou lesão do nervo óptico. Essas técnicas abrem caminho para pesquisas in vivo nas áreas de neurologia e oftalmologia e são facilmente transferíveis para ensaios clínicos.
