Dessa metoder kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom neurologi och oftalmologi, och bidra till att utvärdera en stor mängd retinopathies och retinal manifestationer i olika gnagare modeller. Den största fördelen med dessa tekniker är att noninvasiva longitudinella undersökningar kan utföras, vilket minskar variabiliteten och skär ner antalet djur som behövs för experimenten. Dessa metoder möjliggör kvantitativ in vivo undersökning av struktur och funktion som kan användas för att undersöka de patologiska tillstånd, eller att utvärdera den potentiella nyttan av nya therapeutics.
Men särskilt tillämpningen av optisk koherens tomografi teknik i gnagare modeller är fortfarande utmanande, främst på grund av den lilla ögonstorlek. Demonstrera förfarandena kommer att Michael Dietrich, en doktorand från vårt laboratorium. Efter anesthetizing gnagaren, applicera en droppe fenylefrin Tropicamide på varje öga för pupillary dilation.
Torka bort eventuellt överflödigt ögondroppar vått efter en minut. Och smörj ögonen metylcellulosa baserade oftalmisk gel för att undvika att torka ut ögat och skapa en grumlig hornhinna. Använd sedan tivor för att placera en anpassad kontaktlins på ögat.
Tryck på Start-knappen i det högra hörnet av kontrollpanelens display för att starta anskaffningsläget. Nästa, att bilden det vänstra ögat, placera hållaren för att säkerställa att det vänstra ögat glödlampa av gnagaren är vänd mot kameran. Ställ in filternivån till R, och välj BR och OCT för blå reflektioner fundus imaging och B-scan förvärv i programvaran.
Därefter ställer du in fokusavståndet till cirka 38 dioptrier, med hjälp av fokusratten på kamerans baksida. Och zooma in på näthinnan, tills OCT scan syns på skärmen. Sedan för att säkerställa en strålbana genom mitten av pupillen, med en ortogonal vinkel på näthinnan i alla plan, placera den optiska skivan i mitten av det upplysta fältet.
Och justera den horisontella och vertikala linjen B-skanningar till en horisontell nivå genom att rotera hållaren. På programvaran skärmen välj volym scan-läge, och ställa in den på 25 B-scans i hög upplösning läge på 50 automatisk realtid spårning. Centrera mitten av volymskanningsgallret på den optiska skivan och starta förvärvet genom att trycka på den svarta känslighetsratten och sedan Anskaffa på kontrollpanelen.
När förvärvet är klart ställer du in filternivån på A.Select Blue Autofluorescence på kontrollpanelen. Och justera bildens ljusstyrka med känslighetsvredet. Tryck på känslighetsvredet och sedan Förvärva till bild fluorescerande celler eller autofluorescerande avlagringar.
För analys av volymskanningar använda den automatiserade segmenteringen av OCT-enhetens programvara genom att högerklicka på skanningen. Och välj Segmentering, sedan Alla lager. Utför manuell korrigering av lagren genom att dubbelklicka på önskad skanning.
Välj Tjockleksprofil. Och klicka på Redigera lager segmenteringar. Välj ett lager i taget.
Och vid behov korrigera den gröna linjen genom att flytta de röda prickarna genom att dra och släppa till rätt läge. Nästa väljer fliken Tjocklek Karta. Välj 1, 2, 3 millimeters ETDRS-rutnät.
Centrera den inre cirkeln på den optiska skivan. Slutligen beräkna tjockleken på näthinnans lager från tjockleksvärdena som tillhandahålls av programvaran för de olika näthinnans sektorer av intresse. För att beräkna de viktigaste tjockleksvärdena från volymskanningar, använd hela 1, 2, 3, millimeter ETDRS-rutnätet som täcker en vinkel på cirka 25 grader, exklusive den inre en millimetercirkeln som innehåller den optiska skivan.
Börja med att välja en plattform för att mäta gnagare. Öppna fönstret Presettings genom att dubbelklicka på programvaran. Välj Ny grupp och välj gruppnamn, antal motiv, art och stammar.
Välj en variabel stimulus, spatiotemporal frekvens, kontrast känslighet, hastighet eller orientering i dropdown menyn och tryck skapa ny grupp. Fokusera på plattformen genom att manipulera kamerans fokusring ovanpå kammaren. Och kalibrera systemet genom att rikta den röda cirkeln runt den svarta cirkeln på plattformen.
Därefter placerar du gnagaren på plattformen och låter den anpassa sig till miljön i cirka fem minuter. Starta sedan mätningen genom att välja vänsterpilen för ja eller fyrkanten för nej, om djuret spårar eller inte spårar respektive inte. Välj manuellt stegstorleken på stimulansen genom att klicka på Upp- och nedpilarna bredvid den variabla stimulansen.
Slutligen, välj fliken Sammanfattning och klicka på Filen, Exportera tabell eller Graf för att exportera önskad datauppsättning. Resultaten indikerar att degenereringen av de inre näthinnans skikt reduceras. Och en klinisk EAE-poäng försvagas under EAE-kursen då substans 1 administrerades.
Vidare avslöjar OKR en förbättrad synskärpa hos djur som behandlats med ämne 1 jämfört med obehandlade MOG EAE-möss som uppmätts genom rumslig frekvenströskeltestning under en period av 120 dagar. Vid utförande av OCT-mätningar är Ett kritiskt steg laserstrålens ortogonala orientering i alla plan i förhållande till näthinnan för att säkerställa tjockleksvärdenas kvalitet och reproducerbarhet. För OKR-tekniken, som skiljer mellan spårning och normala beteendemässiga rörelser av djuret, kräver viss utbildning av prövaren.
Det är viktigt att bli förblindad för försöksgruppen. Efter dessa undersökningar av strukturella och funktionella skador som uppstår i samband med experimentell Autoimmun Encefalomyelit, förfarandet kan också vara till hjälp i andra modeller som involverar det visuella systemet, inklusive men inte begränsat till de modeller av retinopathies, eller optik nerv skada. Dessa tekniker bana väg för in vivo forskning inom områdena neurologi och oftalmologi och är lätt överföras till kliniska prövningar.