多微生物败血症的囊浆模型是解剖出独特的新生儿病理生理学的有力工具。它可以是可变的，并且人文端点没有很好地描述。在这里，我们介绍我们高度标准化的程序，以准备一个泥浆，并注入实验动物。
此外，我们使用数据驱动方法在最早的时间点识别垂死的幼崽。让我们从准备冷冻的泥浆库存开始。这是通过从至少五只成年小鼠中汇集的圆锥体，悬浮在无菌葡萄糖水中，并储存在负80，供以后使用。
您可以使用雄性或女性，但小鼠的性别、年龄和背景应保持不变。首先，让我们准备解剖工具。其中包括一套用于皮肤的剪刀和钳子，以及一套用于内脏器官的剪刀和钳子。
使用前至少 30 分钟打开热珠消毒器。将工具浸入 70%乙醇中，然后将它们浸入热珠消毒器中至少一分钟。用 70% 乙醇喷洒纸巾垫，然后从消毒器上取下工具，而无需将工具的消毒部分接触到其他工具的非无菌手柄上。
把它们放在纸巾上冷却。在生物安全柜中解剖小鼠。使用 23 个测量针将鼠标的腿固定到发泡胶板上，使鼠标腹部向上。
用70%乙醇喷洒腹部。使用无菌钳子和剪刀，切开皮肤，用剪刀从内膜衬里松开皮肤，从腹股沟到胸骨和左侧，从长方形区域切开。去除周围任何皮毛。
切换到一对新的无菌工具，切穿，也使一个矩形开口。识别应从左到右穿过身体的 cecum。破坏结缔组织，从肠道中识别切库姆分支，并切离肠道。
放在消毒的称重纸上。使用无菌工具，切入 cecum 的两端。用钳子握住 cecum 的中间，并使用扁平的金属铲，使用滚动运动轻轻地将 cecal 内容物从末端推出。
收集内容，并把它们放在预重的15毫升离心管。将最多五只小鼠的 cecal 含量池到同一管中。添加所有内容后，再次对管子进行加权。
要计算每管中添加到塞萨尔含量的葡萄糖水的体积，请将管中切克物量除以所需浓度（每毫升毫克）。在冰上保留一杯葡萄糖水，以重新悬浮冰面。将所需量的葡萄糖水添加到含有 cecal 含量的 15 毫升离心管中。
垂直和水平旋转管约30秒。观察直径超过几毫米的颗粒是否存在，如果存在，则继续涡旋，直到所有颗粒物都明显消失。将 50 毫升离心管放在冰上，收集滤料，并在顶部安装无菌 70 微米细胞滤株。
从一个15毫升的管子上移出四毫升的再悬浮浆料，然后放入收集管。通过上下移液两到三次，重新悬浮颗粒物。轻轻挤压气泡，提高过滤速度，同时用移液器尖端搅拌内装物，直到不再有液体被过滤。
这大约需要 30 秒。在每管的塞萨尔浆中更换细胞过滤器，但将所有内容物汇集到同一个50毫升的收集管中。如果你的库存超过40毫升，然后旋转15秒，并放置20毫升到一个新的离心管。
将泥浆分成500微升等分的低温小瓶。每三瓶瓶之间的泥浆漩涡。将主货放在冰上小瓶里。
通过将等分储存在负80，在半浆料制备中形成单位的有氧菌落浓度在六个月内不会改变。现在，cecal泥浆已经准备就绪，我们可以用它来挑战一个七到八天大的老鼠与重量调整剂量的塞萨尔浆。泥浆的致命性取决于剂量。
您必须确定所需的致命剂量在你的设施与一个新的剂量滴定每个新库存。每块垃圾都准备一个塞萨尔浆液注射等分。我们把幼崽归为100微升，将垃圾中每个动物的10微升四舍五入。
准备挑战等分需要三个计算，所需的泥浆库存量，额外的葡萄糖水量，以及垃圾中每只小狗的四舍五入量。有关如何执行每个计算的详细信息，请参阅协议的第三节。手动执行每个实验的这些计算可能非常耗时，并会导致实验错误，因此可以下载电子表格以及您输入库存浓度、所需剂量和垃圾重量的协议，以及泥浆库存量、葡萄糖水体积和每只小狗的实际体积自动返回。
您可以打印这张表格，并在准备好挑战你的动物时带它。在生物安全柜中准备注射等分，并放在冰上。在加载注射器之前，通过轻拂 20 次混合微离心管。
小狗受到28量胰岛素注射器的挑战。在绘制泥浆之前，通过激发和喷射 300 到 500 微升的挑战等分来混合等分，然后从微离心管中弹出。然后，绘制大约150微升的挑战等分。
这应该大于任何七到八天大的幼崽的注射量。轻拂注射器，从柱塞上排出气泡，然后稍微拉回注射器以排出任何气泡。过程中请勿触摸针头或柱塞轴。
将多余的 cecal 浆料分配回微离心管中，直到将鼠标的 cecal 浆料计算量加载到注射器中。Cecal浆料由内皮内注射施用。按照动物护理机构的协议执行。
为了尽量减少泄漏，将小狗向下倾斜，并将针头插入腿部和生殖器之间，使针头保持浅和皮下。插入针头约一厘米后，向下和向前按压，直到感觉到针头刺穿了内膜，然后慢慢压抑柱塞。小心地提取针，按照相同的路线，你进去，放松你的中指，你这样做。
注意实验室笔记本中的任何泄漏，并考虑从最终结果中省略有大量泄漏的动物。在本节中，我们将概述我们在受到多微生物败血症挑战的小鼠及其相应的人道终点中观察到的不同健康水平。对于任何涉及新生儿小鼠的程序，我们将床上用品转移到一个新的笼子。
这会将夫人的气味转移到你的手套上，并减轻了夫人反复进入笼子的压力。我们在新笼子里做第二个巢，将受监视的幼崽抱住，直到手术结束或监控，当整个垃圾准备好被送回夫人的笼子里时。将鼠标放在其背上，并监控在四秒内恢复操作的能力。
如果可以正确，则再等待 8 秒钟以确定移动性级别。不受挑战或正在恢复的鼠标通常能够通过连续执行多个步骤来正确和探索其环境。重新组合能够自我的老鼠，并采取一些步骤来探索其环境的权利昏昏欲睡。
这些老鼠可能会跌倒，而采取一步，看起来摇摇欲坠的脚。鼠标，这是不能的权利，有臀部运动超过90度的水平，我们分组为不能右移动。此鼠标最终将正确，但不能在四秒内。
由于其臀部运动，它被分组为无法右移动。无法右转且臀部运动从水平到 90 度以下的小狗被分组为无法右睡。这是鼠标的另一个例子，其臀部不超过90度从水平，并分组为不右嗜睡。
一个不能右移动的小狗将有腿， 可能会摇动或振动， 但没有臀部运动。肢体可以伸展和缩回，但不会有横向运动。小狗明显病了，已经到达了人道的终点。
这是另一个失败右非移动小狗的例子。它的臀部不左右摇晃，但它的爪子确实振动。处理夫人的笼子时，如果哺乳夫人逃跑，幼崽可以被拖出巢。
我们替换这些，然后检查其他分散的幼崽，这是远离他们的巢友。如果这些分散的幼崽不能右睡， 他们处于一个人道的终点。以下是我们败血症模型的卡普兰-迈尔生存曲线。
监视时间点可以在随附的 SOP 中找到。在生存曲线的任何特定点，如果发现鼠标不能右移动，它是在其人道的终点和安乐死。在挑战后12到21小时之间，老鼠会出现不适，大约一半的老鼠能够右在一边，而另一半不能右在两侧。
这是小鼠将开始偏离健康分数的时间框架，并到达未能右非移动的人道终点。这些是在此时间范围内观察到的健康分数的代表性结果。此时，无法根据幸存者和非幸存者的健康分数来区分幸存者和非幸存者群体。
在这个疾病阶段，在挑战后21至48小时，我们观察到最高比例的人道终点。我们还观察到，绝大多数不能在两边正确的小鼠最终不会从疾病中恢复过来，因此，除了未能达到正确的非移动标准之外，疾病也成为人道终点的新标准。在疾病的这一阶段观察到的健康评分导致幸存者与非幸存者分离。
绝大多数双方无法恢复的老鼠没有从疾病中恢复过来。这些数据支持，从挑战后21小时开始的人道终点的新标准应该是对双方不能正确对待的任何小鼠实施安乐死。在48小时的挑战后，许多老鼠将开始显示更多的活动和更好的右反射。
尽管在此期间人道端点的比例较低，但小鼠仍然可以偏离并生病，它们仍然需要监测人道端点。在这一时间段内，一些最终被分组为非幸存者的老鼠一度表现出活动增加，但后来情况更糟，达到了人道的终点。这就需要继续监测患病动物的频率增加，如果他们开始显示更糟糕的健康结果。
未接受现场培训且只观看此教学视频的独立实验者，其分配分数的能力与使用录制的测试视频的调查人员相同。此教学视频可进行准确的行为分类。在60只新生儿小鼠中，对右非移动的新生儿小鼠（衡量人道终点）的准确评分能力进行了确定，平均97%的行为被准确区分，只有3%被误认。
其次，测试了区分未能正确或能够在四秒内正确识别的新生儿小鼠的能力。这是人道终点的另一个衡量标准，在97%的新生儿小鼠中准确分配，而3%的幼崽被错误地分配为正确的。以下是小鼠体重变化百分比与挑战时间相比的代表性结果。
幸存者和非幸存者之间的平均体重变化在挑战后24小时开始分开，但两组之间有很多重叠。有一些幸存者体重减轻了20%以上，但仍从疾病中恢复过来。与健康分数的差异相比，体重变化在预测结果方面效率不高，因此，在确定小鼠是否处于人道终点时，体重变化不被用作标准。
总之，你现在应该能够准备冷冻的塞萨尔浆料，计算重量调整剂量。并注射和监测新生小鼠的人道终点。我们希望这将是您的鼠标研究的宝贵资源。
