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January 27th, 2019
DOI :
January 27th, 2019
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Title
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Preparation of Frozen Cecal Slurry Stock from Adult Mouse Donors
4:42
Challenging Newborn Mice with a Weight-adjusted Dose of Cecal Slurry
8:00
Monitoring Mice and Determining Humane Endpoint
10:34
Representative Results
14:28
Conclusion
Transcript
पॉलीमाइक्रोबियल सेप्सिस के लिए सेकल स्लरी मॉडल अद्वितीय नवजात रोगविज्ञान को विच्छेदन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह परिवर्तनीय हो सकता है, और मानवीय अंत बिंदुओं का अच्छी तरह से वर्णन नहीं किया गया है। यहां हम एक सीकल घोल तैयार करने और प्रयोगात्मक जानवरों में इंजेक्ट करने के लिए अपनी अत्यधिक मानकीकृत प्रक्रिया पेश करते हैं।
इसके अलावा, हम एक डेटा संचालित दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए एक जल्द से जल्द संभव समय बिंदु परसन्न पिल्ले की पहचान । चलो एक जमे हुए सेकल घोल स्टॉक तैयार करके शुरू करते हैं। यह कम से कम पांच वयस्क चूहों से सीकल कॉन्सेंट पूलिंग द्वारा किया जाता है, बाँझ डेक्सट्रोस पानी में निलंबित करता है, और बाद में उपयोग के लिए शून्य से 80 पर संग्रहीत करता है।
आप पुरुषों या महिलाओं का उपयोग कर सकते हैं, लेकिन आपके प्रयोगों के लिए चूहों की सेक्स, उम्र और पृष्ठभूमि को स्थिर रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, आइए विच्छेदन के लिए हमारे उपकरण तैयार करें। इनमें त्वचा के लिए कैंची और संदंश का एक सेट और आंतरिक अंगों के लिए एक दूसरा सेट शामिल है।
उपयोग से कम से कम 30 मिनट पहले गर्म मनका स्टरलाइजर चालू करें। उपकरणों को 70% इथेनॉल में डुबोएं और फिर उन्हें कम से कम एक मिनट के लिए गर्म मनका स्टरलाइजर में डुबो दें। 70% इथेनॉल के साथ पेपर तौलिए की चटाई स्प्रे करें, फिर उपकरण के निष्फल हिस्से को अन्य उपकरणों के गैर-बाँझ हैंडल तक छुए बिना स्टरलाइजर से उपकरण हटा दें।
उन्हें ठंडा करने के लिए कागज तौलिया पर रखें। चूहों को जैविक सुरक्षा कैबिनेट में विच्छेदन करें। माउस के पैरों को 23 गेज सुइयों का उपयोग करके स्टायरोफोम बोर्ड पर पिन करें ताकि माउस पेट ऊपर हो।
पेट को 70% इथेनॉल से स्प्रे करें। बाँझ संदंश और कैंची का उपयोग करना, त्वचा के माध्यम से काटा, कैंची के साथ पेरिटोनियल अस्तर से त्वचा को ढीला करें, और कमर से उरोस्थि और बाईं ओर दाईं ओर एक आयताकार क्षेत्र खोलें। पेरिटोनम के चारों ओर किसी भी फर को हटा दें।
पेरिटोनम के माध्यम से काटने के लिए बाँझ उपकरणों की एक नई जोड़ी पर स्विच करें, आयताकार उद्घाटन भी करें। सेकम की पहचान करें, जो शरीर के पार बाईं ओर दाईं ओर चल रहा होना चाहिए। आंतों से सीकम शाखाओं की पहचान करने और आंतों से दूर सेकम को काटने के लिए कनेक्टिव ऊतक को बाधित करें।
इसे वजन के कागज की एक निष्फल शीट पर रखें। बाँझ उपकरणों का उपयोग करना, सीकम के दोनों सिरों के माध्यम से काटा जाता है। सेकम के बीच को संदंश के साथ पकड़ें और रोलिंग मोशन का उपयोग करके सीकल सामग्री को धीरे-धीरे सिरों से बाहर धकेलने के लिए एक फ्लैट धातु स्पैटुला का उपयोग करें।
सामग्री एकत्र करें और उन्हें पूर्व-तौला 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें। एक ही ट्यूब में अधिकतम पांच चूहों से पूल सीकल सामग्री। ट्यूब फिर से वजन एक बार सभी सामग्री जोड़ दिया गया है।
प्रत्येक ट्यूब में सीकल सामग्री में जोड़ने के लिए डेक्सट्रोस पानी की मात्रा की गणना करने के लिए, ट्यूब में सीकल सामग्री के वजन को मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर में अपनी वांछित एकाग्रता से विभाजित करें। सीकल सामग्री के पुनः निलंबन के लिए बर्फ पर डेक्सट्रोस पानी का एक एलिकोट रखें। सेकल सामग्री युक्त 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में डेक्सट्रोस पानी की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
भंवर ट्यूब खड़ी और क्षैतिज लगभग 30 सेकंड के लिए । व्यास में कुछ मिलीमीटर से अधिक कण की उपस्थिति के लिए निरीक्षण करें, और यदि वर्तमान में, तब तक भंवर जारी रखें जब तक कि सभी कण गायब नहीं हो गए हैं। फिलट्रेट इकट्ठा करने के लिए बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब रखें और शीर्ष पर एक बाँझ 70 माइक्रोमीटर सेल छन्नी स्थापित करें।
पिपेट सेल छलनी पर और संग्रह ट्यूब में एक 15 मिलीलीटर ट्यूब से फिर से निलंबित घोल के चार मिलीलीटर । दो से तीन बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके पार्टिकुलेट मैटर को फिर से सस्पेंड करें। पिपेट टिप के साथ सामग्री को हिलाते हुए फ़िल्टरिंग गति बढ़ाने के लिए धीरे-धीरे बुलबुले को बाहर निकालें जब तक कि कोई और तरल फ़िल्टर नहीं किया जा रहा है।
इसमें लगभग 30 सेकंड का समय लगना चाहिए। सीकल घोल के प्रत्येक ट्यूब के बीच सेल छलनी बदलें, लेकिन एक ही 50 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में सभी सामग्री पूल। यदि आपका स्टॉक 40 मिलीलीटर से अधिक है, तो इसे 15 सेकंड के लिए भंवर, और एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब में 20 मिलीलीटर रखें।
घोल को 500 माइक्रोलीटर एलिकोट्स की क्रायोजेनिक शीशियों में विभाजित करें। हर तीन शीशियों के बीच घोल भंवर। बर्फ पर शीशियों में मास्टर स्टॉक रखें।
शून्य से 80 पर एलिकोट्स संग्रहीत करके, सीकल स्लरी तैयारी में इकाई एकाग्रता बनाने वाली एरोबिक कॉलोनी छह महीने की अवधि में नहीं बदलती है। अब जब कि सीकल घोल तैयार है, हम इसका इस्तेमाल करने के लिए एक वजन के साथ सात से आठ दिन पुराने चूहों के एक कूड़े को चुनौती कर सकते है cecal घोल की खुराक समायोजित । घोल की घातकता खुराक पर निर्भर है।
आपको एक नई खुराक टिटररेशन के साथ हर नए स्टॉक के लिए अपनी सुविधा में वांछित घातक खुराक निर्धारित करनी होगी। प्रति कूड़े में एक सेकल स्लरी इंजेक्शन एलिकोट तैयार किया जाता है। हम एक 100 माइक्रोलीटर की मात्रा के लिए इनोकुलम को सामान्य करते हैं, जो कूड़े में प्रत्येक जानवर के लिए निकटतम 10 माइक्रोलीटर तक गोलाई करते हैं।
चुनौती aliquot तैयार करने के लिए तीन गणना की आवश्यकता होती है, घोल स्टॉक की मात्रा आवश्यक है, डेक्सट्रोस पानी की अतिरिक्त मात्रा, और कूड़े में प्रत्येक पिल्ला के लिए गोल मात्रा। प्रत्येक गणना को करने के तरीके के बारे में विवरण प्रोटोकॉल के सेक्शन तीन में पाया जा सकता है। हर प्रयोग के लिए हाथ से इन गणनाओं का प्रदर्शन समय लेने वाला हो सकता है और प्रयोगात्मक त्रुटि में योगदान देगा, इस प्रकार प्रोटोकॉल के साथ एक स्प्रेडशीट डाउनलोड की जा सकती है जहां आप अपने स्टॉक एकाग्रता, वांछित खुराक और अपने कूड़े के वजन को इनपुट करते हैं, और घोल स्टॉक की मात्रा, डेक्सट्रोस पानी की मात्रा, और प्रति पिल्ला वास्तविक मात्रा स्वचालित रूप से वापस आ जाती है।
जब आप अपने जानवरों को चुनौती देने के लिए तैयार हों तो आप इस शीट को प्रिंट कर सकते हैं और इसे अपने साथ ले जा सकते हैं। एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में इंजेक्शन aliquot तैयार करें और इसे बर्फ पर रखें। सिरिंज लोड करने से पहले माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को 20 बार फ्लिक करके मिलाएं।
पिल्ले एक 28 गेज इंसुलिन सिरिंज के साथ चुनौती दी है । घोल तैयार करने से पहले, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में और बाहर चुनौती के 300 से 500 माइक्रोलीटर को प्रेरित करके और बाहर निकालने के द्वारा एलिकोट मिलाएं। फिर, चुनौती aliquot के लगभग १५० माइक्रोलीटर आकर्षित ।
यह किसी भी सात से आठ दिन पुराने पिल्ला के लिए इंजेक्शन की मात्रा से बड़ा होना चाहिए । सिरिंज पर झटका प्लंजर से बुलबुले उखाड़ फेंकना और किसी भी हवा बुलबुले निष्कासित करने के लिए सिरिंज पर थोड़ा वापस आकर्षित करने के लिए। इस प्रक्रिया के दौरान सुई या प्लंजर शाफ्ट को न छुएं।
अतिरिक्त सीकल घोल को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वापस वितरित करें जब तक कि माउस के लिए सेकल स्लरी की गणना की गई मात्रा सिरिंज में लोड न हो जाए। सेकल स्लरी को इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ प्रशासित किया जाता है। अपने पशु देखभाल संस्थान में प्रोटोकॉल के अनुसार यह प्रदर्शन करते हैं।
लीक को कम करने के लिए, पिल्ला को नीचे की ओर सामना करने के लिए झुकाएं और सुई को उथले और चमड़े के नीचे रखते हुए पैर और जननांग के बीच सुई डालें। एक सेंटीमीटर के बारे में सुई डालने के बाद, नीचे की ओर दबाएं और आगे जब तक आपको लगता है कि सुई पेरिटोनम को पंचर नहीं करती है, फिर धीरे-धीरे प्लंजर को दबाना। ध्यान से एक ही मार्ग के बाद सुई वापस लेने के रूप में आप में चला गया, अपने मध्य उंगली आराम के रूप में आप ऐसा करते हैं ।
अपनी प्रयोगशाला नोटबुक में किसी भी लीक पर ध्यान दें और अपने अंतिम परिणाम से पर्याप्त लीक के साथ जानवरों को छोड़ने पर विचार करें । इस खंड में हम स्वास्थ्य के विभिन्न स्तरों की रूपरेखा तैयार करेंगे जो हम चूहों में पॉलीमाइक्रोबियल सेप्सिस और उनके इसी मानवीय अंत बिंदु के साथ चुनौती देते हैं। नवजात चूहों से जुड़ी किसी भी प्रक्रिया के लिए, हम बिस्तर सामग्री को एक नए पिंजरे में स्थानांतरित करते हैं।
यह अपने दस्ताने पर डेम की गंध स्थानान्तरण और उसके पिंजरे में दोहराया प्रवेश से डेम पर तनाव कम कर देता है । हम नए पिंजरे में एक दूसरा घोंसला बनाने के लिए प्रक्रिया या निगरानी के अंत तक निगरानी पिल्ले पकड़ जब पूरे कूड़े को डेम पिंजरे में वापस करने के लिए तैयार है । अपनी पीठ पर एक माउस रखें और चार सेकंड के भीतर सही करने की क्षमता के लिए निगरानी करें।
यदि यह सही कर सकते हैं, तो गतिशीलता के स्तर को निर्धारित करने के लिए आठ और सेकंड इंतजार करें। एक अचुनौती या ठीक माउस अक्सर एक पंक्ति में कई कदम उठाकर अपने पर्यावरण का पता लगाने में सक्षम होता है। चूहों को फिर से समूहीकृत करें जो खुद को सही करने में सक्षम हैं और अधिकार-सुस्त के रूप में अपने पर्यावरण का पता लगाने के लिए कुछ कदम उठाते हैं।
ये चूहे एक कदम उठाते समय गिर सकते हैं और अपने पैरों पर अस्थिर दिखते हैं। एक माउस जो सही करने में असमर्थ है और कूल्हे का आंदोलन है जो क्षैतिज से 90 डिग्री से अधिक है, जैसा कि सही-मोबाइल में विफल होता है। यह माउस अंततः सही होगा, लेकिन चार सेकंड के भीतर नहीं कर सकते ।
अपने कूल्हे की गतिविधियों के कारण, यह सही मोबाइल के लिए असफल के रूप में समूहित है । पिल्ले जो सही करने में असमर्थ थे और क्षैतिज से 90 डिग्री से नीचे कूल्हे का आंदोलन है, को सही-सुस्त करने में विफल के रूप में समूहित किया जाता है। यह एक माउस का एक और उदाहरण है जिसके कूल्हे क्षैतिज से 90 डिग्री से अधिक नहीं होते हैं और इसे सही-सुस्त करने में विफल के रूप में समूहित किया जाता है।
राइट-नॉनमोबाइल पिल्ला में असफल होने से पैर होंगे जो हिला या कंपन कर सकते हैं लेकिन कोई कूल्हे का आंदोलन नहीं होगा। अंग विस्तार और वापस ले सकते हैं लेकिन पार्श्व आंदोलन नहीं होगा। पिल्ला बीमार दिख रहा है और मानवीय अंत बिंदु तक पहुंच गया है ।
यह सही-नॉनमोबाइल पिल्ला के लिए एक असफल का एक और उदाहरण है । इसके कूल्हे बाएं से दाएं नहीं हिलते हैं, लेकिन इसके पंजे कंपन करते हैं । डेम के पिंजरे को संभालते समय, पिल्ले को घोंसले से बाहर घसीटा जा सकता है अगर नर्सिंग डेम चलता है।
हम इन्हें बदलते हैं और फिर अन्य बिखरे हुए पिल्ले की जांच करते हैं जो उनके नेस्टमेट्स से दूर हैं । यदि वे बिखरे हुए पिल्ले सही-सुस्त करने में विफल रहते हैं, तो वे मानवीय अंत बिंदु पर हैं। यहां हमारे सेप्सिस मॉडल का एक Kaplan-Meier अस्तित्व वक्र है ।
मॉनीटरिंग टाइम प्वाइंट अटैच एसओपी में मिल सकते हैं। अस्तित्व वक्र के साथ किसी भी बिंदु पर यदि एक माउस सही-nonmobile करने के लिए असफल पाया जाता है, यह अपने मानवीय अंत बिंदु पर है और इच्छामृत्यु । 12 और 21 घंटे के बाद चुनौती के बीच, चूहों बीमार दिखाई देगा और चूहों के बारे में आधे एक तरफ सही करने में सक्षम हो जाएगा, जबकि अंय आधा अपने पक्षों में से किसी पर सही करने में विफल ।
यह वह समय सीमा है जहां चूहों स्वास्थ्य स्कोर में पीछे हटना शुरू कर देंगे और सही-गैर-मोबाइल के लिए असफल होने के मानवीय अंत बिंदु तक पहुंच जाएंगे। ये इस समय सीमा में देखे गए स्वास्थ्य स्कोर के प्रतिनिधि परिणाम हैं । उत्तरजीवी और गैर उत्तरजीवी समूहों को उनके स्वास्थ्य स्कोर के आधार पर इस बिंदु पर विभेदित नहीं किया जा सकता है ।
रोग के इस चरण में, चुनौती के बाद 21 से 48 घंटे, हम मानवीय अंत बिंदुओं के उच्चतम अनुपात का पालन करते हैं। हमने यह भी देखा है कि किसी भी चूहों के विशाल बहुमत है कि दोनों पक्षों पर सही करने में असमर्थ है अंत में रोग से उबरने नहीं होगा, जो इसलिए सही-nonmobile मापदंड को विफल करने के अलावा मानवीय अंत बिंदु के लिए एक नया मापदंड बन जाता है । रोग के इस चरण के दौरान मनाया स्वास्थ्य स्कोर गैर बचे से जीवित बचे लोगों के एक जुदाई के परिणामस्वरूप ।
चूहों के विशाल बहुमत है कि दोनों पक्षों पर सही करने में असमर्थ थे रोग से उबरने नहीं किया । यह डेटा समर्थन करता है कि मानवीय अंत बिंदु के लिए एक नया मापदंड 21 घंटे के बाद चुनौती पर शुरू करने के लिए किसी भी चूहों कि दोनों पक्षों पर सही करने में विफल इच्छामृत्यु होना चाहिए । 48 घंटे से अधिक चुनौती के बाद कई चूहों को और अधिक गतिविधि और एक बेहतर दक्षिणपंथी पलटा प्रदर्शित करने के लिए शुरू हो जाएगा।
हालांकि इस अवधि में मानवीय एंडपॉइंट का अनुपात कम है, फिर भी चूहे पीछे हट सकते हैं और बीमार हो सकते हैं, और उन्हें अभी भी मानवीय अंत बिंदु के लिए निगरानी की आवश्यकता होती है। इस समय सीमा के दौरान, उन चूहों में से कुछ है कि अंततः गैर बचे के रूप में समूहित किया गया एक बिंदु पर वृद्धि की गतिविधि प्रदर्शित किया था, लेकिन बाद में बदतर था और एक मानवीय अंत बिंदु तक पहुंच गया । यदि वे बदतर स्वास्थ्य परिणामों को प्रदर्शित करना शुरू करते हैं तो यह बढ़ी हुई आवृत्ति के साथ बीमार जानवरों की निरंतर निगरानी करना आवश्यक है।
स्वतंत्र प्रयोगकर्ता जिन्हें इन-पर्सन प्रशिक्षण प्राप्त नहीं हुआ है और जो केवल इस अनुदेशात्मक वीडियो का निरीक्षण करते हैं, उनके रिकॉर्ड किए गए परीक्षण वीडियो का उपयोग करके जांचकर्ताओं के समान स्कोर आवंटित करने की क्षमता में परीक्षण किया गया था। इस अनुदेशात्मक वीडियो के परिणामस्वरूप सटीक व्यवहार वर्गीकरण होता है। सही-नॉनमोबाइल नवजात चूहों को विफल करने के लिए सही स्कोर आवंटित करने की क्षमता, जो मानवीय अंत बिंदु का एक उपाय है, 60 नवजात चूहों में से निर्धारित किया गया था, और औसतन 97% व्यवहार सही ढंग से प्रतिष्ठित थे, जिसमें केवल 3% की गलत पहचान की गई थी।
इसके बाद, नवजात चूहों को अलग करने की क्षमता जो सही करने में विफल रहे थे या जो चार सेकंड के भीतर सही करने में सक्षम थे, उनका परीक्षण किया गया। यह मानवीय अंत बिंदु का एक और उपाय है और नवजात चूहों के ९७% में सही ढंग से सौंपा गया था, जबकि पिल्ले के 3% गलत तरीके से दक्षिणपंथी के रूप में सौंपा गया था । यहां चुनौती के अपने समय की तुलना में चूहों के प्रतिशत वजन परिवर्तन के लिए प्रतिनिधि परिणाम हैं ।
जीवित बचे लोगों और गैर-जीवित बचे लोगों के बीच औसत वजन परिवर्तन चुनौती के बाद 24 घंटे में अलग होने लगा, लेकिन समूहों के बीच बहुत ओवरलैप है । वहां कुछ बचे है कि 20% से अधिक वजन खो दिया है लेकिन अभी भी बीमारी से बरामद किया गया । वजन परिवर्तन स्वास्थ्य स्कोर में अंतर की तुलना में परिणाम की भविष्यवाणी करने में उतना कुशल नहीं था, यही कारण है कि यह निर्धारित करने में एक मानदंड के रूप में उपयोग नहीं किया जाता है कि चूहों एक मानवीय अंत बिंदु पर हैं या नहीं।
समाप्त करने के लिए, अब आपको जमे हुए सीकल घोल का स्टॉक तैयार करने में सक्षम होना चाहिए, वजन-समायोजित खुराक की गणना करनी चाहिए। और मानवीय अंत बिंदुओं के लिए नवजात चूहों को इंजेक्ट और मॉनिटर करें। हमें उम्मीद है कि यह आपके माउस अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन होगा।
यह प्रोटोकॉल 7 दिन पुराने चूहों में नवजात पूति की स्थापना और मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक कदम प्रदान करता है ।
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