Biocytin inddrivelse og 3D rekonstruktioner af fyldt hippocampus CA2 Interneurons

Denne metode kan hjælpe med at klassificere neuronal undertyper og udvide vores forståelse af det funktionelle kort over kortikale kredsløb. Denne protokol er blevet optimeret til at bevare ultrastrukturen af neuroner og opnå fremragende inddrivelse af både dendritiske og axonale arbors, så høj kvalitet rekonstruktioner. Ved afslutningen af en elektrofysiologisk optagelse overføres skiven, der indeholder den registrerede celle, til en lille skål ACSF.

Mens du arbejder i en røghætte, skal du rulle skiven på et lille stykke fint kvalitetsfilterpapir og placere endnu et stykke fugtet filterpapir på skiven. Væv i en lille plastikpotte, der indeholder 5 til 10 milliliter fiksativ opløsning, opbevares ved fire grader Celsius natten over. Den næste dag overføres vævet fra beholderen med fiksativ opløsning til en beholder med to milliliter 0,1 molarphosphat buffer for at skylle, og skære overskydende væv med en skalpel klinge.

Fjern overskydende væv ved at placere skiven i en petriskål, og skær det overskydende væv væk med en skalpelklinge. Overfør det trimmede væv til en ren petriskål, der sikrer, at det ligger fladt uden folder eller folder. Fjern den overskydende buffer ved hjælp af en tør pensel.

Dæk vævet med varm gelatineopløsning og læg petriskålen på en frossen blok for hurtigt at afkøle opløsningen. Derefter flytte skålen for indstilling gelatine til 4 grader Celsius i 30 til 60 minutter. I en røghætte, bruge en skalpel klinge til at skære en lille, 1 X 1 centimeter blok, der indeholder gelatine indlejret væv.

Løft blokken med en lille spatel og overfør forsigtigt til frisk fiksativ opløsning. Lad det fastsætte i mindst 30 minutter ved fire grader Celsius. Efter denne anden fiksering vaskes gelatineblokken i fem milliliter PB tre gange.

Efter vask, tør blokken ved hjælp af et stykke papirvæv. Brug derefter en lille mængde cyanoacrylat lim til at holde blokken, orienteret med vævet i toppen, på en vibratome lastbil ved hjælp af super lim. Afsnit skiven ved 50 mikron tykkelse ved hjælp af en vibratome og placere hver sektion omhyggeligt i et glas hætteglas, der indeholder 10 procent saccharose.

Efter trækning, omhyggeligt afhente en sektion fra hætteglasset og læg det fladt i en petriskål låg. Brug derefter en frisk skalpel klinge til at fjerne gelatine fra omkring afsnittet. Sektionerne sættes i et hætteglas med 2 milliliter frisk 10 procent saccharose i PB, og omrøres i 10 minutter for at begynde kryobeskyttelsesprocessen.

Efter kryobeskyttelse, placere sektioner fladt på et lille rektangel af aluminiumsfolie ved hjælp af en pensel. Fjern eventuel overskydende væske fra sektionerne, og fold forsigtigt folien i en pakke. Hold aluminiumsfolien tæt på overfladen af flydende nitrogen uden at røre overfladen i 30 sekunder.

Og lad derefter sektionerne tø helt op i ca. 30 sekunder. Gentag fryse tø yderligere to gange. Fjern alle sektioner fra folien med en pensel og læg dem i et glashætteglas indeholdende to milliliter PB for at vaske overskydende saccharose under konstant omrøring.

Efter immunstaining for fluorescens billeddannelse, placere diaset i et glas Petri fad, der indeholder PBS, og forsigtigt fjerne dækslet slip. Vask derefter sektionerne af sliden ved hjælp af blide impulser af PBS fra en Pasteur pipette. Sektionerne sættes i et rent glasglas, der indeholder PBS.

Udfør Avidin HRP-reaktionen ved først at inkubere afsnittene i Avidin biotinkompleks eller ABC i mindst to timer for at forstærke HRP-reaktionsproduktet. Dernæst vaskes sektionerne med PBS 3 gange i 10 minutter og derefter med tris buffer to gange i 10 minutter. Efter fjernelse af den sidste tris buffer vask, hurtigt tilføje en dråbe på otte procent nikkelchlorid opløsning til diaminobenzidin opløsning eller DAB opløsning.

Derefter pipette opløsningen ind og ud for at blande og hurtigt tilføje en milliliter af denne løsning over sektionerne. Inkuber sektionerne i denne opløsning i 15 minutter. Derefter tilsættes 10 mikroliter af 1 procent hydrogenperoxid til DAB-opløsningen.

Lad reaktionen fortsætte i mørke under konstant omrøring i ca. et til to minutter, indtil cellerne er mærket. I en røghætte skal du placere en lille cirkel af filterpapir i en petriskål og dæmpe den med PB. Løft sektionerne en ad gangen fra glashætteglasset med en pensel og læg dem forsigtigt fladt på papiret. Dæk sektionerne med en anden fugtet cirkel af filterpapir og fjern overskydende buffer ved forsigtigt at røre silkepapir til overfladen.

Påfør otte eller ni dråber af en procent osmium tetroxid i PB til det øverste papir. Dæk skålen og bibevar i røghætten i mindst 30 minutter, men ikke mere end 1 time. Efter skylning, montering, og dækker glide sektionerne, dehydrere gennem en serie på 50 procent, 70 procent, 95 procent, og 100 procent alkoholopløsninger.

Efter dehydreringstrinnet overføres sektionerne til et glashætteglas, der indeholder 100 procent ethanol på en shaker i ca. fem minutter. Alkoholopløsningen udskiftes med propylenoxid og vaskes tre gange i fem minutter. Efter den sidste vask opbevares ca. to milliliter propylenoxid i hætteglasset og tilsættes harpiks i forholdet 1:1.

Sørg for, at harpiksen er opløst, og hold sektionerne under konstant omrøring i 30 minutter. Efter 30 minutter, bruge en træpind til at placere hver sektion i en aluminium planchette indeholder epoxy harpiks, og inkubere natten over. Den næste dag, placere planchette på en varmeplade i ca 10 minutter.

Derefter afhente hver sektion med en træpind og sted på en ren rutsjebane. Når alle sektionerne er blevet overført til diaset, skal du se diaset under et dissekerende mikroskop for at kontrollere udsnittenes retning og placere en dækslæd over sektionerne. Hærde i ovnen i 48 timer ved 56 grader Celsius.

Brug en lav forstørrelse målsætning til at fokusere på hjemmet sektion, der indeholder cellen kroppen. Brug derefter en 100x-målsætning, fokuser på celleteksten, og klik i midten for at markere referencepunktet. Hvis du vil spore somaen i 3D ved hjælp af 100x-målsætningen, skal du markere konturen fra sporingsfanen og markere cellerekromekonturen.

Brug joysticket til at flytte fokus til toppen af cellekroppen. Placer punkterne ved at klikke rundt om omkredsen af den del, der i øjeblikket er i fokus. Højreklik, og vælg luk kontur for at afslutte denne første disposition.

Gentag denne proces på forskellige z positioner, indtil bunden af cellen kroppen er nået. For at spore dendritiske arbor, skal du vælge dendrite eller apical dendrite, i neuron menuen. Først skal du spore et kort indledende segment for hver dendrite ved hjælp af musen rullehjulet til at justere diameteren af markøren til at matche diameteren af dendrite.

Spor langs hver dendrite. Når en node i træet er nået, skal du højreklikke og vælge tofurende node eller trefurcating-node i rullemenuen. Hvis du vil identificere matchende punkter mellem dendritterne i en sektion, der passer som den færdige sektion, skal du klikke på flyttefanen og vælge matchpoint.

Vælg det antal point, der skal matches, og tryk derefter på OK. Klik på slutningen af en afsluttet gren og klik derefter på grenen. Gentag dette for hvert matchpunkt. Når alle dendritterne i hver sektion er blevet sporet, spore axon ved hjælp af den samme proces Vist her er en rekonstruktion af en CA2 kurv celle med begrænset dendritisk og axonal arbor ved hjælp af en tegning rør.

Dendritterne er i sort, og øksen er i rødt. Dette er et eksempel på den biocytinfyldte kurvcelle efter den Avidin HRP-protokol, der er beskrevet her. Vist her er en video af en 3D neuronal rekonstruktion af CA2 kurv celle.

Dendritterne er i mørkepint, og øksen er i hvidt. Endelig viser dette billede en dendrogram af CA2 kurv celle. Det vil tage tid at blive dygtig med denne protokol.

Men denne optimerede tilgang kan generere billeder i høj opløsning af komplekse kortikale og hippocampale strukturer in-vitro.