Name: quasi-metagenomic analysis of salmonella from food and environmental samples
Uploaded: 2018-10-25T14:45:00
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Les auteurs aimeraient remercier Mark Harrison et Gwen Hirsch de l’Université de Georgie pour aimablement la souche bactérienne et autres formes de soutien à cette étude.

1. préparation de l’échantillon
Remarque : Des échantillons d’aliments sont préparés pour pré-enrichissement selon microbiologie laboratoire Guidebook (MLG), du US Department of Agriculture Food Safety et Inspection Service (USDA-FSIS)11 et manuel analyse bactériologique (BAM) de la U.S. Food et Drug Administration (FDA)12.
<ol><li>Placer une portion de 25 g d’échantillon d’aliments tels que le poivre noir, poitrine de poulet, ...

<ol>
	<li>Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercially+Available+Rapid+Methods+for+Detection+of+Selected+Food-borne+Pathogens.">Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).</li><li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+metagenomic+sequencing+to+food+safety:+detection+of+Shiga+Toxin-producing+Escherichia+coli+on+fresh+bagged+spinach.">Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).</li><li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-Level+Discrimination+of+Shiga+Toxin-Producing+Escherichia+coli+in+Spinach+Using+Metagenomic+Sequencing.">Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing.</a> PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).</li><li>Hyeon, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-metagenomics+and+realtime+sequencing+aided+detection+and+subtyping+of+Salmonella+enterica+from+food+samples.">Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Hyeon, J. Y., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Salmonella+in+raw+chicken+breast+using+real-time+PCR+combined+with+immunomagnetic+separation+and+whole+genome+amplification.">Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification.</a> Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).</li><li>Hosono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+whole-genome+amplification+directly+from+clinical+samples.">Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples.</a> Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).</li><li>Seth-Smith, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture.">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).</li><li>Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+to+prepare+samples+of+leafy+green+vegetables+for+preenrichment+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual+Salmonella+culture+method.">Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method.</a> Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).</li><li>Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+the+isolation+of+Salmonella+from+alfalfa+and+mung+bean+seeds+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual's+Salmonella+culture+method.">Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method.</a> Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).</li><li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+subtyping+methods+against+a+whole-genome-sequencing+standard+for+Salmonella+enterica+serotype+Enteritidis.">Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).</li><li>. Microbiology Laboratory Guidebook Available from: <a target="_blank" href="https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook">https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook</a> (2018)</li><li>. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm">https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm</a> (2018)</li><li>Malorny, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+for+detection+of+Salmonella+in+food.">Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).</li><li>June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth,+tetrathionate+broth,+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+from+raw+flesh+and+other+highly+contaminated+foods:+precollaborative+study.">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study.</a> Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).</li><li>Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth,+tetrathionate+broth,+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+spp.+from+foods+with+a+low+microbial+load.">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load.</a> Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).</li><li>Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFSAN+SNP+Pipeline:+an+automated+method+for+constructing+SNP+matrices+from+next-generation+sequence+data.">CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data.</a> PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+serotype+determination+utilizing+high-throughput+genome+sequencing+data.">Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).</li><li>Rodrigue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+amplification+and+de+novo+assembly+of+single+bacterial+cells.">Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells.</a> PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).</li><li>Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Perspectives+on+Viable+but+Non-Culturable+(VBNC)+Pathogenic+Bacteria.">Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria.</a> Front Public Health. 2, 103 (2014).</li></ol>

En raison du souvent faible abondance et homogène en présence de Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux, enrichissement de la culture avant IMS-MDA est encore nécessaire pour la détection de Salmonella et de sous-typage ; C’est donc une étape cruciale du protocole. Pour identifier les conditions optimales d’augmenter l’abondance des salmonelles par rapport à la flore fond échantillon, milieux d’enrichissement différents peut-être être évaluées po...

Séquençage métagénomique permet théoriquement concertée de détection et de sous-typage des pathogènes d’origine alimentaire. Cependant, des échantillons d’aliments présentent des défis pour l’analyse de l’agent pathogène par séquençage direct du microbiome alimentaire. Tout d’abord, pathogènes d’origine alimentaire sont souvent présents à de faibles concentrations dans les échantillons d’aliments. La plupart des méthodes de détection rapide disponible dans le commerce encore exigent 8 à 48 h de culture afin d’enrichir les cellules pathogènes à un niveau détectable1. Deuxièmement, beaucoup d’aliments contiennent des cellules de microflore abondante et/ou aliments ADN, faisant ADN du pathogène d’origine alimentaire une petite fraction des aliments métagénome et une cible insaisissable pour la détection et le typage métagénomique séquençage directement.
Modification des aliments microbiomes a signalé afin de permettre une concentration importante de pathogènes d’origine alimentaire ADN afin de faciliter la détection basée sur le séquençage des Escherichia coliproductrices de toxine Shiga2,3 et Salmonella enterica4. Parce que les aliments modifiés microbiomes sont toujours des mélanges de différentes espèces microbiennes, leur séquençage est nommé comme quasi-métagénomique analyse4. Microbiome modification peut être effectuée par la culture enrichissement seuls2,3 , ou en combinaison avec séparation immunomagnétique (IMS) et de multiples déplacements amplification (MDA)4,5. IMS peut capturer sélectivement les cellules pathogènes de la culture d’enrichissement par l’intermédiaire de billes magnétiques revêtus d’anticorps. MDA peut produire une quantité suffisante d’ADN génomique pour l’ordonnancement par le biais de l' ADN polymérase de ɸ29 très efficace6. IMS-MDA a permis la détection des pathogènes indépendants de la culture des échantillons cliniques7et le raccourcissement de l’enrichissement de la culture pour la détection de quasi-métagénomique et sous-typage des salmonelles dans les échantillons de nourriture4.
L’objectif général de cette méthode est de préparer la quasi-métagénomiques ADN provenant d’échantillons de nourriture pour permettre la concentration ciblée de l’ADN génomique de Salmonella et de détection ultérieure et de sous-typage du contaminant Salmonella par séquençage. Par rapport aux méthodes standards pour la détection de Salmonella 8,9 et sous-typage de10, l’approche de quasimetagenomic peut raccourcir considérablement le temps d’immobilisation des aliments contaminés et les échantillons environnementaux sous-types moléculaires de l’agent pathogène en unifiant les deux généralement séparés des analyses dans un seul flux de travail. Cette méthode est particulièrement utile pour des applications telles que la riposte aux flambées épidémiques d’origine alimentaire et d’autres investigations arrière de trace où le sous-typage pathogène robuste est nécessaire en plus de la détection des pathogènes et rapide revirement analytique est important.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laboratory blender bag w/filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10048-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water</td>
			<td>Oxoid Micorbiology Products</td>
			<td>CM0509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rappaport Vassiliadis broth</td>
			<td>Neogen Acumedia</td>
			<td>7730A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher blender</td>
			<td>Seward&#160;</td>
			<td>30010108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75005194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Techne Prime</td>
			<td>EW-93945-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4.76357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR purification beads; mix well before use; store at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT library prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinIon library prep kit</td>
			<td>Oxford Nanopore</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabead Anti-Salmonella beads</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>71002</td>
			<td>Vortex well prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) 
			-Sample buffer 
			-Reaction buffer 
			-Enzyme mix</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-6600-30</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR mastermix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td>Mix well before use; store at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quasi-metagenomic analysis of salmonella from food and environmental samples

Quasi-métagénomique séquençage se réfère à l’analyse basée sur le séquençage de mis à jour le microbiomes des aliments et les échantillons environnementaux. Dans ce protocole, microbiome modification vise à concentrer l’ADN génomique d’un contaminant de pathogènes d’origine alimentaire cible afin de faciliter la détection et le typage de l’agent pathogène dans un seul flux de travail. Ici, nous expliquer et démontrer les étapes de préparation d’échantillon pour l’analyse de quasi-métagénomique de Salmonella enterica de nourriture représentatif et les échantillons environnementaux, y compris les germes de luzerne, de poivre noir moulu, boeuf haché, poitrine de poulet et les échantillons environnementaux. Les échantillons sont d’abord soumis à l’enrichissement de la culture de Salmonella pour une durée raccourcie et réglable (4 à 24 h). Cellules de Salmonella sont ensuite sélectivement capturés dans la culture d’enrichissement par séparation immunomagnétique (IMS). Enfin, plusieurs amplification de déplacement (MDA) est effectuée afin d’amplifier l’ADN de cellules IMS-capturé. La sortie de l’ADN du présent protocole peut être séquencée par des plateformes de séquençage à haut débit. Une analyse PCR quantitative en option peut être effectuée pour remplacer le séquençage pour la détection de Salmonella ou évaluer la concentration de Salmonella ADN avant de séquençage.

Avant quasimetagenomic le séquençage, la quantité globale et la pureté des produits IMS-MDA peuvent être évaluées par la fluorospectromètre (tableau 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Temps de l’enrichissement (h)</td>
			<td>Valeur de CT</td>
			<td>Concentration (ng/ul)</td>
			<td>Pureté (260/280)</t...

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Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-métagénomique analyse des Salmonella dans les aliments et les échantillons environnementaux

Nous présentons ici un protocole pour préparer des échantillons d’ADN provenant des aliments et environnement microbiomes détection concertée et sous-typage des Salmonella par séquençage de quasimetagenomic. L’utilisation combinée de l’enrichissement de la culture, séparation immunomagnétique (IMS) et le déplacement de plusieurs amplification (MDA) permet une concentration efficace de l’ADN génomique de Salmonella provenant des aliments et les échantillons environnementaux.

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Cette méthode peut être utilisée pour détecter Salmonella à partir d’échantillons d’aliments et identifier l’agent pathogène au niveau de la souche grâce à la prise d’empreintes génétiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle combine la détection et le sous-dypage de Salmonella en un seul flux de travail et réduit considérablement le délai d’exécution de l’échantillon d’aliments contaminés par Salmonella à l’empreinte digitale de l’agent pathogène. Pour commencer, placez de façon aseptique un échantillon de 25 grammes d’aliments à l’intérieur d’un sac de mélangeur de laboratoire stérile avec un filtre intégré ou préparez en option un écouvillon environnemental en humidissant aseptiquement une éponge avec du bouillon d’enrichissement, en la faisant glisser sur une surface prédéterminée et en la plaçant à l’intérieur d’un sac de mélangeur.À l’aide d’un mélangeur de laboratoire, bien mélanger chaque échantillon avec 225 millilitres de bouillon d’enrichissement rv. Puis incuber le mélange à 42 degrés Celsius pendant quatre à 21 heures. Après cela, recueillir un sous-échantillon de 50 millilitres de bouillon d’enrichissement du côté filtré du sac.Puis centrifuger le sous-échantillon à 100 fois g pendant 10 minutes. Transférer délicatement le supernatant dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres et une centrifugeuse à 3 000 à 6 000 fois g pendant 10 minutes. Jeter le supernatant et laver la pastille en cinq millilitres de BPW.Resuspendez la pastille en cinq millilitres de BPW. Tout d’abord, décongeler le tampon de l’échantillon et le tampon de réaction de la trousse MDA sur la glace. Placer un millilitre de cellules résuspendues dans bpw et 20 microlitres de perles anti-Salmonella dans un tube de microcentrifugeuse.Placer le tube de microcentrifugeuse sur un mélangeur rotatif pendant 30 minutes à température ambiante. Après cela, placez le tube sur un support magnétique pendant trois minutes. Inverser la grille magnétique plusieurs fois pour concentrer les perles dans une pastille.Garder le tube sur la grille magnétique, aspirer et jeter le surnatant. Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon de lavage au tube. Retirez le support du tube de la grille et inversez le support du tube plusieurs fois pour éliminer les bactéries non spécifiquement contraignantes du complexe.Après le troisième lavage, aspirer le surnatant du tube et le jeter. Retirez ensuite le tube de la grille magnétique et centrifugez-le pendant une seconde. Placez ensuite le tube sur la grille magnétique pendant trois minutes avant d’enlever tout tampon de lavage résiduel.Resuspendez les complexes de Salmonella perle dans neuf microlitres de tampon d’échantillon et incubez le tube à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Après refroidissement des complexes sur la glace, ajouter neuf microlitres de tampon de réaction et un microlitre de mélange d’enzymes. Incuber le tube dans un cycleur thermique selon le protocole du texte et refroidir le tube sur la glace.Ensuite, utilisez un instrument fluorospectromètre pour mesurer la concentration et la pureté de l’ADN de l’échantillon. Conservez les produits finaux à 20 degrés Celsius négatifs pour de futures expériences. Préparer 18 microlitres de mélange PCR par échantillon selon le protocole de texte.Ensuite, mélangez le produit MDA en pipetting doucement de haut en bas. Ajouter deux microlitres de la suspension du produit MDA au mélange PCR. À l’aide d’un protocole PCR optimisé en temps réel, exécutez le PCR en temps réel selon le protocole texte.Ajoutez des solutions tampons et des réaccéléments au produit MDA tel que spécifié dans le protocole de texte et transférez les 40 microlitres résultants du produit MDA préparé par séquençage à une nouvelle plaque et ajoutez 20 microlitres de perles de purification PCR à chaque puits. Ensuite, incuber la plaque à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les perles avec 80% d’éthanol et séchez-les pendant 12 minutes.Resuspendez les perles séchées dans 53 microlitres de tampon de resuspension et incuber les perles pendant deux minutes à température ambiante. Enfin, diluer et mettre en commun les bibliothèques selon les instructions du fabricant. Dans ce protocole, l’évaluation quantitative ciblée de l’ADN de Salmonella a été effectuée par PCR en temps réel.Les résultats représentatifs de deux marques de poitrines de poulet contaminées par Salmonella variaient de 701,54 à 945,86 nanogrammes par microlitre, ce qui indique que l’ADN de l’échantillon a été effectivement amplifié. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de laver et de manipuler les perles IMS avec soin, garder les reagents MDA et les produits exempts de contaminants et de maintenir une hotte propre. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la salubrité des aliments et de la santé publique afin d’explorer le suivi rapide et à haute résolution des contaminants salmonella dans les échantillons d’aliments, les environnements de produits et les chaînes d’approvisionnement.N’oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes d’origine alimentaire peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’équipement de protection individuelle et le suivi de bonnes pratiques de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

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Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

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