Name: quasi-metagenomic analysis of salmonella from food and environmental samples
Uploaded: 2018-10-25T14:45:00
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저자 마크 해리슨과 세균성 긴장 및 다른 지원이이 연구에 친절 하 게 제공에 대 한 조지아 대학의 그웬 허쉬 감사 하 고 싶습니다.

1. 샘플 준비
참고: 음식 샘플 사전 농축 미생물학 실험실 가이드북 (MLG)에 따르면 미국 부의 농업 식품 안전 및 검사 서비스 (FSIS USDA)11 및 미국 식품의 세균 분석 매뉴얼 (BAM)의 준비는 하 고 약 청 (FDA)12.
<ol><li>Aseptically 내장 필터와 살 균 실험실 블렌더 가방에 후추, 닭 가슴살, 쇠고기, 그리고 알 팔 파 새싹 또는 환경 면봉 등 음식 샘플 25 g...

<ol>
	<li>Valderrama, W. B., Dudley, E. G., Doores, S., Cutter, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercially+Available+Rapid+Methods+for+Detection+of+Selected+Food-borne+Pathogens.">Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (9), 1519-1531 (2016).</li><li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+metagenomic+sequencing+to+food+safety:+detection+of+Shiga+Toxin-producing+Escherichia+coli+on+fresh+bagged+spinach.">Application of metagenomic sequencing to food safety: detection of Shiga Toxin-producing Escherichia coli on fresh bagged spinach.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8183-8191 (2015).</li><li>Leonard, S. R., Mammel, M. K., Lacher, D. W., Elkins, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-Level+Discrimination+of+Shiga+Toxin-Producing+Escherichia+coli+in+Spinach+Using+Metagenomic+Sequencing.">Strain-Level Discrimination of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli in Spinach Using Metagenomic Sequencing.</a> PLoS One. 11 (12), e0167870 (2016).</li><li>Hyeon, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasi-metagenomics+and+realtime+sequencing+aided+detection+and+subtyping+of+Salmonella+enterica+from+food+samples.">Quasi-metagenomics and realtime sequencing aided detection and subtyping of Salmonella enterica from food samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. , (2017).</li><li>Hyeon, J. Y., Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Salmonella+in+raw+chicken+breast+using+real-time+PCR+combined+with+immunomagnetic+separation+and+whole+genome+amplification.">Rapid detection of Salmonella in raw chicken breast using real-time PCR combined with immunomagnetic separation and whole genome amplification.</a> Food Microbiology. 63, 111-116 (2017).</li><li>Hosono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+whole-genome+amplification+directly+from+clinical+samples.">Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples.</a> Genome Research. 13 (5), 954-964 (2003).</li><li>Seth-Smith, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequences+of+Chlamydia+trachomatis+directly+from+clinical+samples+without+culture.">Whole-genome sequences of Chlamydia trachomatis directly from clinical samples without culture.</a> Genome Research. 23 (5), 855-866 (2013).</li><li>Jacobson, A. P., Gill, V. S., Irvin, K. A., Wang, H., Hammack, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+to+prepare+samples+of+leafy+green+vegetables+for+preenrichment+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual+Salmonella+culture+method.">Evaluation of methods to prepare samples of leafy green vegetables for preenrichment with the Bacteriological Analytical Manual Salmonella culture method.</a> Journal of Food Protection. 75 (2), 400-404 (2012).</li><li>Jacobson, A. P., Hammack, T. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+the+isolation+of+Salmonella+from+alfalfa+and+mung+bean+seeds+with+the+Bacteriological+Analytical+Manual's+Salmonella+culture+method.">Evaluation of sample preparation methods for the isolation of Salmonella from alfalfa and mung bean seeds with the Bacteriological Analytical Manual's Salmonella culture method.</a> Journal of AOAC International. 91 (5), 1083-1089 (2008).</li><li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+subtyping+methods+against+a+whole-genome-sequencing+standard+for+Salmonella+enterica+serotype+Enteritidis.">Comparative analysis of subtyping methods against a whole-genome-sequencing standard for Salmonella enterica serotype Enteritidis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (1), 212-218 (2015).</li><li>. Microbiology Laboratory Guidebook Available from: <a target="_blank" href="https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook">https://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/science/laboratories-and-procedures/guidebooks-and-methods/microbiology-laboratory-guidebook/microbiology-laboratory-guidebook</a> (2018)</li><li>. Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5: Salmonella Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm">https://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm</a> (2018)</li><li>Malorny, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+for+detection+of+Salmonella+in+food.">Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70 (12), 7046-7052 (2004).</li><li>June, G. A., Sherrod, P. S., Hammack, T. S., Amaguana, R. M., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth,+tetrathionate+broth,+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+from+raw+flesh+and+other+highly+contaminated+foods:+precollaborative+study.">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella from raw flesh and other highly contaminated foods: precollaborative study.</a> Journal of AOAC International. 78 (2), 375-380 (1995).</li><li>Hammack, T. S., Amaguana, R. M., June, G. A., Sherrod, P. S., Andrews, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+effectiveness+of+selenite+cystine+broth,+tetrathionate+broth,+and+Rappaport-Vassiliadis+medium+for+the+recovery+of+Salmonella+spp.+from+foods+with+a+low+microbial+load.">Relative effectiveness of selenite cystine broth, tetrathionate broth, and Rappaport-Vassiliadis medium for the recovery of Salmonella spp. from foods with a low microbial load.</a> Journal of Food Protection. 62 (1), 16-21 (1999).</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), R46 (2014).</li><li>Davis, S., Pettengill, J. B., Luo, Y., Payne, J., Shpuntoff, A., Rand, H., Strain, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFSAN+SNP+Pipeline:+an+automated+method+for+constructing+SNP+matrices+from+next-generation+sequence+data.">CFSAN SNP Pipeline: an automated method for constructing SNP matrices from next-generation sequence data.</a> PeerJ Computer Science. 1 (e20), (2015).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+serotype+determination+utilizing+high-throughput+genome+sequencing+data.">Salmonella serotype determination utilizing high-throughput genome sequencing data.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (5), 1685-1692 (2015).</li><li>Rodrigue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+amplification+and+de+novo+assembly+of+single+bacterial+cells.">Whole genome amplification and de novo assembly of single bacterial cells.</a> PLoS One. 4 (9), e6864 (2009).</li><li>Ramamurthy, T., Ghosh, A., Pazhani, G. P., Shinoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Perspectives+on+Viable+but+Non-Culturable+(VBNC)+Pathogenic+Bacteria.">Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria.</a> Front Public Health. 2, 103 (2014).</li></ol>

종종 로우 풍부 음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 동질적인 존재 때문에, IMS MDA 전에 문화 농축은 여전히 살 모 넬 라 검출 및 동등; 따라서 프로토콜의 중요 한 단계 이다. 샘플 배경 식물을 기준으로 살 모 넬 라 를 풍부 하 게 증가 하는 최적의 조건을 식별 하기 위해 다른 농축 미디어 특정 샘플에 대 한 평가 될 수 있습니다. MLG와 BAM, 음식 샘플에서 살 모 넬 라 농축...

Metagenomics 시퀀싱은 이론적으로 공동된 탐지 및 foodborne 병원 체의 동등 수 있습니다. 그러나, 음식 샘플 식품 미생물의 직접적인 연속 병원 체 분석 과제를 제시합니다. 첫째, foodborne 병원 체 들은 현재 수준 낮은 음식 샘플에 있습니다. 여전히 상용 신속한 검출 방법의 대부분 8-48 h 감지 레벨1로 병원 체 세포를 풍부 하 게 재배 해야 합니다. 둘째, 풍부한 microflora 셀 및 음식 만들기 foodborne 병원 체 DNA 음식 metagenome 및 애매 한 대상의 극히 metagenomic 시퀀싱 직접 검색 및 동등에 대 한 DNA 포함 하는 많은 음식.
음식 microbiomes의 foodborne 병원 체 시가 독 소 생산 대장균2,3 , 의 시퀀싱 기반 탐지를 촉진 하기 위하여 DNA의 내용이 풍부한 농도 수 있도록 보고 되었습니다. 살 모 넬 라 enterica4. 변형 식품 때문에 microbiomes는 여전히 다른 미생물 종의 혼합물, 그들의 시퀀싱은 준 metagenomic 분석4으로 불린다. 미생물 수정 문화 농축 혼자2,3 또는 다중 변위 증폭 (MDA)4,5immunomagnetic 분리 (IMS)와 함께에서 수행할 수 있습니다. IMS는 선택적으로 항 체-코팅 된 자석 구슬을 통해 농축 문화에서 병원 체 세포를 캡처할 수 있습니다. MDA는 고효율 ɸ29 DNA 중 합 효소6시퀀싱에 대 한 게놈 DNA의 충분 한 양을 생성할 수 있습니다. IMS-MDA는 임상 샘플7, 준 metagenomic 검색 문화 농축의 단축 및 식품 샘플4 살 모 넬 라 의 동등에서 문화권 병원 체 탐지를 허용 했다.
이 방법의 전반적인 목표 음식 샘플에서 살 모 넬 라 genomic DNA와 후속 검색의 타겟된 농도 및 시퀀싱에 의해 살 모 넬 라 오염 물질의 동등 하 준 metagenomic DNA를 준비 하는 것입니다. 살 모 넬 라 검출8,9 에 대 한 표준 방법에 비해와10동등, quasimetagenomic 접근 실질적으로 오염 된 음식과 환경 샘플에서 처리 시간을 단축 수 있습니다. 일반적으로 두 가지를 통합 하 여 병원 체의 분자 하위 단일 워크플로우로 분석을 분리. 이 메서드는 식중독 발발 응답 및 다른 추적 다시 조사 병원 체 검출 이외에 필요한은 강력한 병원 체 동등 그리고 신속한 분석 처리 중요 한 특히 유용 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Laboratory blender bag w/filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10048-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered peptone water</td>
			<td>Oxoid Micorbiology Products</td>
			<td>CM0509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rappaport Vassiliadis broth</td>
			<td>Neogen Acumedia</td>
			<td>7730A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher blender</td>
			<td>Seward&#160;</td>
			<td>30010108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>75005194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Techne Prime</td>
			<td>EW-93945-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StepOne Real-Time Thermal cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4.76357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>PCR purification beads; mix well before use; store at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT library prep kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinIon library prep kit</td>
			<td>Oxford Nanopore</td>
			<td>SQK-LSK108</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabead Anti-Salmonella beads</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>71002</td>
			<td>Vortex well prior to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illustra GenomiPhi V2 DNA amplification kit (MDA kit) 
			-Sample buffer 
			-Reaction buffer 
			-Enzyme mix</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>25-6600-30</td>
			<td>Store at -80C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HulaMixer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal PCR mastermix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4304437</td>
			<td>Mix well before use; store at 4C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-090-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quasi-metagenomic analysis of salmonella from food and environmental samples

준 metagenomics 시퀀싱 음식과 환경 샘플의 수정 된 microbiomes의 시퀀싱 기반 분석을 말합니다. 이 프로토콜에서 미생물 수정 대상 foodborne 병원 체 오염 물질의 탐지를 촉진 하기 위하여 genomic DNA와 단일 워크플로에 병원 체의 동등을 집중 하도록 설계 되었습니다. 여기, 우리가 설명 대표 음식과 알 팔 파 콩나물을 포함 하 여 환경 샘플에서 살 모 넬 라 enterica 준 metagenomics 분석에 대 한 샘플 준비 단계 지상 검은 후추, 갈은 쇠고기, 닭고기 가슴 보여주는 그리고 환경 면봉입니다. 샘플 먼저 동안 단축 및 조절 (4-24 h) 살 모 넬 라 의 문화 강화를 받게 됩니다. 살 모 넬 라 셀 다음 선택적으로 캡처됩니다 농축 문화에서 immunomagnetic 분리 (IMS)에 의해. 마지막으로, 다중 변위 증폭 (MDA)는 IMS 캡처한 세포에서 DNA를 증폭 하는 수행 됩니다. 이 프로토콜의 DNA 출력 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼으로 시퀀싱 될 수 있습니다. 살 모 넬 라 검출에 대 한 시퀀싱을 대체 하거나 시퀀싱 전에 살 모 넬 라 DNA의 농도 평가 하는 선택적 정량 PCR 분석을 수행할 수 있습니다.

Quasimetagenomic 시퀀싱, 이전 fluorospectrometer (표 1)에 의해 전체 수량 및 IMS MDA 제품의 순도 평가할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>농축 시간 (h)</td>
			<td>Ct 값</td>
			<td>농도 (ng/ul)</td>
			<td>순도 (260/280)</td>
		</tr>
<tr>
<td>브랜드 A</stron...

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Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 의 준 metagenomic 분석

여기, 선물이 공동된 검색 및 quasimetagenomic 시퀀싱을 통해 살 모 넬 라의 동등에 대 한 음식과 환경 microbiomes에서 DNA 샘플을 준비 하는 프로토콜. 사용 문화 농축, immunomagnetic 분리 (IMS), 및 다중 변위 증폭 (MDA) 음식과 환경 샘플에서 살 모 넬 라 genomic DNA의 효과적인 농도 하실 수 있습니다.

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

이 방법은 음식 견본에서 살모넬라를 검출하고 유전 지문링을 통해 긴장 수준에 병원체를 확인하는 데 이용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살모넬라 검출과 하위 입력을 단일 워크플로우로 결합하고 살모넬라 오염 식품 샘플에서 병원균의 지문까지 소요 시간을 실질적으로 단축한다는 것입니다. 우선, 멸균 실험실 블렌더 백 에 25그램의 식품 샘플을 내장 필터로 배치하거나 스폰지를 농축 국물로 무균적으로 적시적으로 적시화하여 환경 면봉을 준비하여 미리 결정된 표면을 가로질러 드래그하여 블렌더 백 안에 넣습니다.실험실 블렌더를 사용하여 각 샘플을 RV 농축 국물 225 밀리리터와 철저히 혼합합니다. 그런 다음 4 ~21 시간 동안 섭씨 42도에서 혼합물을 배양합니다. 그 후, 가방의 여과된 측면에서 농축 국물의 50 밀리리터 서브샘플을 수집합니다.그런 다음 10 분 동안 100 배 g에서 하위 샘플을 원심 분리합니다. 10분 동안 3, 000에서 6, 000배 g의 새로운 50밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기로 상피체를 조심스럽게 옮긴다. 상체를 버리고 BPW의 5 밀리리터로 펠릿을 씻으십시오.BPW의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. 먼저, 얼음 위에 있는 MDA 키트로부터 샘플 버퍼 및 반응 버퍼를 해동한다. BPW에 재중단 된 세포의 1 밀리리터와 마이크로 센트리슈후지 튜브에 항 살모넬라 구슬 20 마이크로 리터를 놓습니다.마이크로센트심분리기 튜브를 회전 믹서에 실온에서 30분 간 배치합니다. 그 후, 3 분 동안 자기 스탠드에 튜브를 배치합니다. 마그네틱 랙을 여러 번 반전하여 구슬을 펠릿에 농축합니다.튜브를 자기 랙에 고정하고, 흡인하고, 상퍼를 폐기하십시오. 다음으로 튜브에 1 밀리리터의 세척 버퍼를 추가합니다. 랙에서 튜브 홀더를 제거하고 튜브 홀더를 여러 번 반전하여 복합체에서 비특이적 결합박테리아를 제거합니다.세 번째 세척 후, 튜브에서 슈퍼 네티퍼를 흡인하고 폐기하십시오. 그런 다음 자기 랙에서 튜브를 제거하고 원심 분리기를 1 초 동안 제거합니다. 그런 다음 잔류 세척 버퍼를 제거하기 전에 3 분 동안 자기 랙에 튜브를 놓습니다.비드 살모넬라 복합체를 9마이크로리터의 샘플 버퍼로 재중단하고 3분 동안 95도의 튜브를 배양합니다. 얼음에 복합체를 냉각 한 후, 반응 버퍼의 9 마이크로 리터와 효소 믹스의 하나의 마이크로 리터를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 열 사이클러에서 튜브를 배양하고 얼음에 튜브를 냉각.다음으로, 불소 스펙트로미터 계측기를 사용하여 샘플의 DNA 농도 및 순도를 측정합니다. 최종 제품을 음수 20°C에 저장하여 향후 실험을 준비합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플당 18마이크로리터의 PCR 혼합물을 준비합니다.그런 다음 MDA 제품을 위아래로 부드럽게 피펫하여 혼합합니다. PCR 혼합물에 MDA 제품 서스펜션의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 최적화된 실시간 PCR 프로토콜을 사용하여 텍스트 프로토콜에 따라 실시간 PCR을 실행합니다.텍스트 프로토콜에 명시된 대로 MDA 제품에 버퍼 솔루션 및 시약을 추가하고 시퀀싱 준비 MDA 제품의 결과 40 마이크로리터를 새 플레이트에 전송하고 각 웰에 PCR 정화 구슬 20 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 10 분 동안 실온에서 접시를 배양. 그런 다음 구슬을 80% 에탄올로 씻고 12분간 건조시다.말린 구슬을 53마이크로리터의 재서스펜션 버퍼로 재중단하고 실온에서 2분 동안 구슬을 배양한다. 마지막으로 제조업체의 지침에 따라 라이브러리를 희석하고 풀로 만들 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 살모넬라 DNA의 표적 수량 평가는 실시간 PCR에 의해 수행되었다.살모넬라 오염 된 닭 가슴살의 두 브랜드의 대표적인 결과는 샘플 DNA가 효과적으로 증폭되었음을 나타내는 마이크로리터 당 701.54에서 945.86 나노 그램범위. 이 절차를 시도하는 동안 IMS 구슬을 조심스럽게 씻고 처리하고 MDA 시약 및 제품을 오염 물질로부터 제거하고 깨끗한 후드를 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 식품 안전 및 공중 보건 분야의 연구원들이 식품 샘플, 제품 환경 및 공급망에서 살모넬라 오염 물질의 신속하고 고해상도 추적을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.식인성 병원균과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 개인 보호 장비를 착용하고 좋은 실험실 관행을 따르는 것과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Biology

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

환경 Transcriptomics를 사용하여 해양 미생물 커뮤니티의 유전자 발현 분석

Analogous to metagenomics, environmental transcriptomics (metatranscriptomics) retrieves and sequences environmental mRNAs from a microbial assemblage ...

연구

생물학

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

만성의 살모넬라균 감염된 마우스 모델

The bacterial infected mouse model is a powerful model system for studying areas such as infection, inflammation, immunology, signal transduction, and ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bis(sulfosuccinimidyl) Suberate (BS3)

One-step Purification of Twin-Strep-tagged Proteins and Their Complexes on Strep-Tactin Resin Cross-linked With Bissulfosuccinimidyl Suberate BS3

한 단계 연쇄상-Tactin 수지 비스 (술포 숙신 이미 딜)로 가교 수베 (BS3)에 트윈 연쇄상 구균 - 태그 단백질과 그들의 단지의 정화

Affinity purification of Strep-tagged fusion proteins on resins carrying an engineered streptavidin (Strep-Tactin) has become a widely used method for ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

야생형과 간암의 시알 산의 결정<em&gt; CMAH</em&gt; 넉 아웃 마우스.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

레이저 캡처 서 유전자 표정 분석에 대 한 마우스 눈에서 높은 순수 배수 채널의

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...