Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منحة R01 GM104010. شكرا للمساعدة في التنظير المجهري الفلوري لفيتاس بيندوكاس وكريستين لابنو في المرفق الأساسي للميكروسكوب المتكامل، الذي تدعمه منحة دعم مركز السرطان التي تمولها المعاهد القومية للصحة P30 CA014599.

1- الإعداد
<ol><li>جعل غير الفلورسنتالحد الأدنى NSD المتوسطة 2. ومن المتوقع أن يؤدي غياب الريبوفلافين إلى الحد من الفلورة الخضراء داخل الخلايا الخلفية والسمية الضوئية المرتبطة بها.</li>
	<li>تنمو سلالة الخميرة بين عشية وضحاها في ~ 23 درجة مئوية إلى مرحلة لوغاريتمية في 5 مل NSD في قارورة 50 مل حيرة ...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

4D التصوير البؤري من العضيات الخميرة يتطلب ضبط دقيق من المعلمات متعددة. والشاغل الرئيسي هو ابيضاض الصور والسمية الضوئية. فيلم 4D نموذجي ينطوي على جمع الآلاف من المقاطع البصرية، لذلك يجب أن تبقى الإضاءة الليزر منخفضة قدر الإمكان. جنبا إلى جنب يمكن استخدام علامات البروتين الفلورسنت لتعزيز ال...

مقصورات نظام الغشاء الداخلي في تدفق مستمر، وتوصيفها الكامل يتطلب التصوير بالخلايا الحية. يوصف هنا هو البروتوكول الذي يستخدم 4D (الفاصل الزمني 3D) مجهرية البؤرة لتصور المقصورات وصفت الفلورسنت في الخمائر الناشئة. وقد وضعت هذه الطريقة لتتبع ديناميات المقصورات السرية في Pichia pastoris وSaccharomyces cerevisiae1،2،3. يركز هذا البروتوكول على S. cerevisiaه، الذي يحتوي على غولجي غير مكدسة التي cisternae الفردية هي قابلة للحل بصريا4. منظمة غولجي غير عادية في S. cerevisiae تمكين مظاهرة عن طريق الفحص المجهري 4D أن تفيجبالا غولجي تسميات في البداية مع البروتينات غولجي المقيمة في وقت مبكر، ومن ثم يفقد تلك البروتينات في حين الحصول على البروتينات غولجي المقيمة في وقت متأخر3 ،5. ويمكن تصور هذا الانتقال عن طريق خلق سلالة التي يتم تسمية البروتين غولجي في وقت مبكر Vrg4 مع GFP في حين يتم تسمية البروتين غولجي في وقت متأخر Sec7 مع بروتين الفلورسنت الأحمر الأحادي. عندما يتم تعقب التصهريج الفردية، ويلاحظ النضج كتحويل الأخضر إلى الأحمر3. هذا النوع من التحليل يمكن أن توفر معلومات قيمة حول توطين البروتين وهوية المقصورة. على سبيل المثال، قد يظهر بروتينان مع إزاحة طفيفة لأوقات الوصول والمغادرة في بعض الأحيان لتسمية مقصورات مختلفة في صور ثابتة، ولكن يمكن رؤيتها في أفلام 4D لتسمية نفس المقصورة في نقاط زمنية مختلفة6،7 . وهكذا، يكشف الفحص المجهري 4D الظواهر التي لن تكون واضحة خلاف ذلك.
يمكن تحقيق مجهرية 4D مفيدة من مقصوراتالخميرة مع الإجراءات المناسبة والمعدات 2. كلما كان ذلك ممكنا، يتم وضع العلامات البروتين الفلورسنت عن طريق استبدال الجينات8 لتجنب القطع الأثرية الإفراط في التعبير. نظرًا لأن الهياكل داخل الخلايا غالبًا ما تكون ديناميكية جدًا، فهناك حاجة إلى التصوير ثلاثي الأبعاد لضمان تتبع البنية بشكل موثوق مع مرور الوقت. البروتوكول الموصوف هنا يستخدم مجهر ضوئي ضوئي مسح بالليزر مجهز بكاشفات حساسية عالية. مع هذا الجهاز، يمكن تصوير حجم الخلية بالكامل من S. cerevisiae عن طريق الفحص المجهري البؤري تقريبا كل 1-3 ق، مع فترات 2 ق يجري نموذجية. يمكن جمع البيانات لمدة تصل إلى 5-15 دقيقة اعتمادا على كثافات وضع العلامات من الفلوروفوريس وخصائصها البيوفيزيائية الضوئية. العقبة الرئيسية هي تقليل تبييض الصور. ولهذا الغرض، يتم الاحتفاظ بكثافة الليزر في أدنى مستوى ممكن، وتُزيد سرعة المسح الضوئي البؤري إلى أقصى حد، وتُمكَّن المعلمات البصرية للصورة عند حد Nyquist من أجل التقاط المعلومات ذات الصلة مع تجنب التعرض المفرط للضوء. ومن المتوقع أيضا أن تخفف هذه الإعدادات من السمية الضوئية، وهو عامل غالبا ما يتم تجاهله أثناء تصوير الخلايا الحية9و10و11. تتم معالجة البيانات الصاخبة الناتجة عن ذلك مع تصحيح التبييض وخوارزميات التناقص لتسهيل القياس الكمي لكثافة الفلورة.
حتى مع أفلام 4D عالية الجودة، والتحليل صعب لأن مقصورات الخميرة تميل إلى أن تكون عديدة، غير متجانسة، والمحمول. نظرًا للقيود الجوهرية للتنظير المجهري البؤري والإعدادات غير المثلى المطلوبة للتصوير ثلاثي الأبعاد لفترات طويلة، يصعب حل هياكل الفلورسنت القريبة من بعضها البعض. ويمكن التحايل على هذه المشكلة من خلال التركيز على عدد قليل من الهياكل الفلورية التي لا تزال قابلة للحل بصريا لمدة فترة وضع العلامات، مع افتراض أن تلك الهياكل تمثل جميع السكان من المسمى المقصورات. يتم تحديد مقصورات الفلورسنت التي يمكن تعقبها بشكل موثوق عن طريق عرض الأفلام من مكدسات Z المتوقعة وعن طريق إنشاء سلسلة من المونتاج الذي يتم تجميع المقاطع البصرية لكل نقطة زمنية على شاشة الكمبيوتر. يستخدم هذا التحليل الإضافات المخصصة ImageJ12، والتي تسمح بتتبع بنية فردية في عزلة.
أوراق الأساليب الأخيرة غطت استخدام البروتينات الفلورية في الخميرة13 وكذلك نظرية وممارسة التصوير البؤري 4D من خلايا الخميرة2. يركز هذا البروتوكول على الجوانب العملية الرئيسية لتجربة التصوير رباعية الأبعاد. وهو يتضمن بعض التحسينات على الإجراءات الموصوفة سابقا، فضلا عن الإصدارات المحدثة من رمز البرنامج المساعد ImageJ والوثائق. المثال المعروض يركز على ديناميات غولجي، ولكن هذا البروتوكول هو على قدم المساواة مناسبة لتصوير مقصورات الخميرة الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

الهدف من هذا البروتوكول هو تحديد كيفية تشكيل مقصورات الغشاء وتحويلها في الخلايا الحية من الخميرة الناشئة. العديد من المقصورات داخل الخلايا في الخميرة ديناميكية، وفهم كامل لخصائصها يتطلب التصوير بفاصل زمني. مجهري الفلورية البؤرية ثنائية الجوانب متعددة الألوان هي طريقة قوية لتتبع سلوك وتكوين المقصورة داخل الخلايا على مقياس زمني من 5-15 دقيقة. المقاطع. ولتحقيق هذا الهدف، يتم تقليل ابيضاض الصور والسمية الضوئية عن طريق المسح الضوئي بسرعة بقوة ليزر منخفضة جداً، ويتم تعيين أبعاد البكسل والفواصل الزمنية لخطوات Z إلى أكبر القيم المتوافقة مع أخذ عينات من الصورة بدقة كاملة. مجموعات البيانات 4D الناتجة صاخبة ولكن يمكن تمهيدها عن طريق deconvolution. حتى مع بيانات عالية الجودة، فإن مرحلة التحليل صعبة لأن الهياكل داخل الخلايا غالباً ما تكون عديدة وغير متجانسة ومتحركة. لتلبية هذه الحاجة، تمت كتابة الإضافات ImageJ المخصصة إلى مجموعة البيانات 4D على شاشة الكمبيوتر، وتحديد الهياكل ذات الأهمية، تحرير البيانات لعزل الهياكل الفردية، وقياس الدورات الزمنية الفلورة، وجعل الأفلام من مكدسات Z المتوقعة. الأفلام 4D مفيدة بشكل خاص للتمييز بين مقصورات مستقرة من مقصورات عابرة التي تتحول عن طريق النضج. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الأفلام لوصف أحداث مثل الانصهار مقصورة، واختبار آثار طفرات محددة أو اضطرابات أخرى.

المثال الوارد هنا وثائق وكميا نضج اثنين من الخميرة غولجي cisternae كما تصورها مزدوج ة اللون 4D مجهري ة البؤرة3. خلية الخميرة يحتوي على ترتيب 10-15 غولجي cisternae، كل منها ينضج على مدى فترة زمنية من حوالي 2-4 دقيقة. البروتين مثل mCherry أو mScarlet. تسميات الصهريج الفردية في البداي...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D مجهرية الخميرة

يصف هذا البروتوكول تحليل المقصورات داخل الخلايا التي تحمل علامة الفلورسنت في الخميرة الناشئة باستخدام مجهرية متعددة الألوان 4D (الفاصل الزمني 3D). يتم اختيار معلمات التصوير لالتقاط إشارات كافية مع الحد من الأضرار الضوئية. تسمح الإضافات المخصصة لـ ImageJ بتتبع الهياكل المسماة وتحليلها كمياً.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

هذه الطريقة تتعقب الهياكل في خلايا الخميرة في ثلاثة أبعاد على مدى عدة دقائق ، مما يسمح لنا بدراسة ديناميات العضيات داخل الخلايا والمقصورات. يضمن التصوير رباعي الأبعاد أن نتمكن من استخلاص استنتاجات موثوقة حول الديناميات داخل الخلايا، خاصة بالنسبة للهياكل أو العلامات التي قد تكون عابرة. إثبات الإجراء سيكون ناتالي جونسون، ما بعد الدكتوراه من مختبري.تبدأ من خلال زراعة ثقافة بين عشية وضحاها من سلالة الخميرة من الاهتمام في خمسة ملليلتر من الاصطناعية غير الفلورية المحددة، أو NSD، المتوسطة، في قارورة 15 ملليلتر حائرة مع تهوية جيدة، في 23 درجة مئوية. قبل ثلاث إلى أربع ساعات من التحليل، تمييع ثقافة الخميرة المرحلة اللوغاريتمية في وسط NSD الطازجة، بحيث تكون الكثافة البصرية النهائية في 600 نانومتر، أو OD600، 0.5 إلى 0.8 في وقت التصوير. على الأقل ساعة واحدة قبل الثقافة جاهزة، وأجهزة الطرد المركزي aliquot من اثنين ملليغرام لكل ملليلتر Concanavalin A حل لمدة خمس دقائق بأقصى سرعة، ل بيليه أي الجسيمات، وإضافة 250 ميكرولترات من الماغنات إلى نظيفة 35 ملليمتر الزجاج أسفل طبق المجهر.بعد 15 دقيقة، اغسل الطبق مرتين إلى ثلاث مرات بمليلترين من الماء المقطر لكل غسل، إضافة 250 ميكرولترات من ثقافة الخميرة إلى الطبق المغلف بالكونكافانافلين A بعد تجفيفه. انتظر 10 دقائق للسماح للخلايا بالتمسك ، قبل غسل الطبق برفق مرتين إلى ثلاث مرات أخرى مع ملليلترين من وسط NSD الطازج. ثم تغطية الخلايا مع مليلتر اثنين من NSD جديدة.لتصوير خلايا الخميرة، حدد عدسة غمر الزيت 63X مع فتحة رقمية لا تقل عن 1.4 على مجهر خفيف. هنا ، يمكن أيضا عدسة الهدف 100X يمكن استخدامها بدلا من عدسة الهدف 63X. ثم، ضع الطبق على العدسة الموضوعية، التي تم رصدها مع زيت الغمر.من القائمة المنسدلة لعلامة التبويب وضع الاكتساب، حدد xyzt. تحت علامة التبويب س ص، قم بتنسيق حجم الإطار إلى 256 عرض بواسطة 128 ارتفاع. استخدم السرعة القصوى للمسح الضوئي، والتي عادةً ما تكون على أساس ثمانية كيلوهيرتز.قم بتشغيل المسح الضوئي X ثنائي الاتجاه إذا كان متوفراً، وضبط عامل التكبير إلى 9، مما سيؤدي إلى حجم بكسل يبلغ حوالي 80 نانومتر. إذا تم استخدام هدف 100X، ضبط عامل التكبير وفقاً لذلك للحفاظ على حجم بكسل من 80 نانومتر تقريباً. ثم تعيين تراكم الخط إلى أربعة أو ستة.تعيين الثقب إلى 1.2 وحدات هوائية، وتشغيل الليزر الضوء الأبيض، إذا كان متوفرا. ثم تعيين الطول الموجي الإثارة وقوة الليزر في المئة لكل قناة الفلوريسنس. إذا كان متوفراً، قم بتمكين استخدام وضع العد الضوئي تحت علامة تبويب التكوين عن طريق إلغاء تحديد الحد الأقصى لوقت التكامل.لكل قناة من قنوات الفلوريسين، قم بتعيين جهاز كشف حساسية عالية، وتعيين نطاق الطول الموجي للانبعاثات، وتشغيل وضع العد الضوئي، إذا كان ذلك متاحًا. تعيين نافذة توقيت البوابات إلى 0.6 إلى 10 نانو ثانية لكل قناة الفلوريسين، لتجنب التقاط الضوء المنعكوس من الطبق الزجاجي. بعد ذلك، قم بتشغيل التصوير الميداني الساطع، وحدد جهاز كشف الحساسية المنخفضة لجمع البيانات.قم بتشغيل وضع التصوير المباشر، ثم قم بتشغيل المكسب في قناة الحقل الساطع حتى تصبح الخلايا مرئية بوضوح. إذا كان في وضع العد الفوتون، قم بتغيير نطاق القيم الرمادية من يدوي إلى تلقائي لعرض إشارة الفلورسنت. تعيين Z-المكدس لصورة حجم كامل من خلايا الخميرة وتحديد اتجاه التصوير بحيث تتحرك لأسفل نحو زلة الغطاء.تعيين الفاصل الزمني الخطوة Z إلى 0.25 إلى 0.35 ميكرومتر للحصول على حوالي 20 إلى 25 المقاطع البصرية لكل Z المكدس، وتشغيل تدفق Galvo إذا كان متوفراً. بالنسبة لفيلم نموذجي، قم بتعيين الفاصل الزمني بين مكدسات Z إلى ثانيتين، ثم قم بتعيين مدة الفيلم إلى خمس إلى 10 دقائق. ثم احفظ الفيلم كملف LIF.لdeonvolution الفيلم، إطلاق برنامج فك التشفير المناسبة التي تستخدم خوارزمية التقدير الاحتمال الأقصى الكلاسيكية، وفتح سلسلة البيانات. حدد معالج deconvolution ومحرر المعلمة للتأكد من الكشف عن معلمات التصوير وعرضها بشكل صحيح. تغيير قيمة معامل الانكسار المتوسطة المضمّنة إلى 1.4 إلى تقريبية السيتوبلازم الخميرة.ثم استخدم المحرر لتقدير موضع قسيمة الغلاف. حدد تعيين الكل الذي تم التحقق منه، ثم انقر فوق قبول، وحدد أدخل المعالج. انقر فوق السهم التالي لتجاوز تحديد وظيفة انتشار النقطة واقتصاص مراحل المعالجة المسبقة، ثم انتقل خلال معالج إلغاء الفبركة لكل قناة من قنوات الفلوريسنس.حدد دالة تعيين اللوغاريتمية اللوغاريتمية الرأسية وفحص ملف تعريف كثافة الفلورسنسيات الأولية للبيانات. تعيين يدوي كوضع لتقدير الخلفية، وأدخل قيمة خلفية، وانقر فوق قبول. اترك قيمة الحد الأقصى للتكرار عند 40 وأدخل نسبة إشارة إلى ضوضاء مقدرة.ثم قم بإيقاف تشغيل تصحيح التبييض، ثم انقر فوق Deconvolve. حدد قبول إلى القناة التالية في نافذة نتيجة deconvolution، إذا تمت إزالة الضوضاء بشكل كاف دون إزالة الفلوريس حقيقي من الهياكل خافتة. بمجرد أن يتم إلغاء تفكيك جميع القنوات الفلورسنت بشكل مرضٍ ، انقر فوق All done وترتيب القناة الحمراء أولاً ، تليها قنوات الحقل الأخضر والأزرق ومشرق ، للتحرير اللاحق في ImageJ.ثم حفظ تسلسل الصورة كملف TIF ثمانية بت وحدد ملف واحد لكل قناة والتباين تمتد كوضع التحويل. لتصحيح التبييض، قم باستيراد تسلسلات الصورة deconvolved إلى ImageJ وانقر فوق ImageJ، Hyperstacks، و Stack إلى Hyperstack لتحويل الصور إلى كومة هد. حدد xyzct من القائمة المنسدلة وأدخل عدد القنوات وشرائح المكدس Z والإطار الزمني.لتصحيح قنوات الفلوريسنس لتبييض الصور، حدد الصورة، اللون، قنوات الانقسام، والقنوات الفلورية، حدد الإضافات، EMBLtools، تصحيح التبييض، وتناسب الأسي. ثم حدد الصور واللون وقنوات دمج لدمج حقل مشرق وتبييض قنوات الفلورانس تصحيحها في كومة الذاكرة المؤقتة ، وحفظ الهايبركوم تصحيح deconvolved والتبييض لتوليد الفيلم اللاحقة والتحرير كملف TIF ثمانية بت. لتحويل مجموعة البيانات المصححة deconvolved والتبييض إلى مونتاج متحجيم ، حدد الإضافات ، IJ_Plugins ، وجعل سلسلة المونتاج ، وحدد الهايبركست ثمانية بت ذات الصلة.انقر فوق فتح و موافق لقبول أن جميع الشرائح سيتم استخدامها لإنشاء المونتاج، وانقر فوق موافق مرة أخرى لقبول قيمة عامل مقياس المقترحة. حفظ المونتاج الأصلي كملف TIF بت ثمانية وحدد الإضافات، IJ_Plugins، سلسلة المونتاج إلى Hyperstack و OK، لإنشاء هايبركاك 4D من المونتاج الأصلي الذي يتضمن كل الأطر الزمنية. لإنشاء الفيلم الأصلي متوسط المتوقعة، حدد أولا الإضافات، IJ_Plugins، مشروع هايبرستاك، و OK، لقبول المعلمات الافتراضية ZProjection.حفظ متوسط الفيلم المتوقعة كملف TIF ثمانية بت وفحص الفيلم لتحديد الهياكل الفردية التي يمكن تعقبها لمدة فترة وضع العلامات الخاصة بهم. إن تحديد بنية يمكن تعقبها بشكل موثوق طوال مدة الفيلم، وعزل هذا الهيكل للتحليل، هما أهم الخطوات في الإجراء. ثم اتبع التعليمات في دليل المستخدم المساعد، لعزل هياكل الفائدة من خلال تحرير المونتاج.إنشاء هايبركاك 4D من المونتاج تحريرها للفترة بما في ذلك هياكل الفائدة، وحفظ هايبركاك تحريرها. لتحديد كثافة الفلوريسانس مع مرور الوقت للهيكل المعزول في كومة الذاكرة المؤقتة رباعية الأبعاد المحررة، حدد الإضافات، IJ_Plugins، و تحليل الفيلم المحرر، أدخل الفاصل الزمني بين رصات Z، وانقر فوق موافق. لإنشاء فيلم نهائي للبنية المعزولة، حدد الإضافات IJ_Plugins و Project Hyperstack، حدد شرائح مكدس Z التي يجب تضمينها، حدد متوسط الكثافة كنوع الإسقاط، وانقر فوق موافق. لإنشاء كومة 4D مع البيانات الأصلية عبر البيانات المحررة ، حدد الإضافات ، IJ_Plugins ، دمج اثنين من Hyperstacks ، والمكان أولاً فوق الثانية. لإنشاء فيلم من الـ 4D مع البيانات الأصلية عبر البيانات المحررة، حدد الإضافات IJ_Plugins و Project Hyperstack، حدد شرائح مكدس Z التي يجب تضمينها، حدد متوسط الكثافة كنوع الإسقاط، وانقر فوق موافق. هنا، يمكن مقارنة الإطار الأول من إسقاط Z-المكدس من البيانات الخام إلى نفس deconvolved وتبييض تصحيح البيانات.هذه الإطارات من نفس deconvolved والتبييض الفيلم تصحيحها تظهر اثنين من cisternae التي تم تحليلها، والتي التسمية الأولى مع الأخضر فانادايت المقاومة جليكوسيل البروتين 4 أو علامة Vrg4، وفي وقت لاحق مع الإفراز الأحمر 7 أو Sec7 الجينات علامة البروتين النقل. هذا المونتاج، التي أنشئت من فرط التبييض deconvolved وتصحيحها، ويبين جميع المقاطع البصرية في نقطة زمنية واحدة قبل وبعد التحرير، للسماح لعزل إشارة من واحدة من cisternae المختار. في هذا الشكل، تظهر عدة إطارات من الفيلم النهائي من مداخن Z المتوقعة مع الإسقاطات الأصلية في الجزء العلوي من الشكل والإسقاطات المحررة في الجزء السفلي.ويكشف القياس الكمي للإشارات الفلورية الخضراء والحمراء من الـ Golgi cisternae المختار أن علامة Vrg4 الخضراء تصل وتستمر لمدة 80 ثانية ، وبعد ذلك ، تصل علامة Sec7 الحمراء وتستمر لمدة 60 ثانية ، مع تداخل قصير بين العلامتين. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تحديد الهياكل التي يمكن تتبعها بشكل واضح طوال فترة حياتهم. يمكن إجراء نفس النوع من التحليل بعد إجراء طفرة أو نوع آخر من الانزعاج المحدد.وقد فتحت هذه التقنية الطريق لدراسة السلوك الديناميكي للGolgi cisternae و endoplasmic مواقع الخروج من شبكة الإنترنت باستخدام الخميرة كنظام نموذجي.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

الكروماتوغرافي تنقية ريبوسوم الخميرة نشطة للغاية

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...