Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant R01 GM104010. Tak for assistance med Fluorescens mikroskopi til Vytas Bindokas og Christine Labno på den integrerede mikroskopi Core Facility, som understøttes af NIH-finansierede Cancer Center support Grant P30 CA014599.

1. forberedelse
<ol><li>Lav ikke fluorescerende minimal NSD medium2. Fraværet af riboflavin forventes at reducere baggrunds intracellulær grøn fluorescens og tilhørende fototoksicitet.</li>
	<li>Dyrke gærstammen natten over ved ~ 23 °C til logaritmisk fase i 5 mL NSD i en 50 mL forvirret kolbe med god beluftning. Omkring 3-4 h før analyse, fortynde gærkulturen i frisk NSD, således at den endelige OD600 vil være 0,5-0,8 på tidspunktet for billeddannelse.</li>
	<li>Forbered en 2 mg/mL opl...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

4d konfokale Imaging af gær organeller kræver omhyggelig tuning af flere parametre. Den største bekymring er foto blegning og fototoksicitet. En typisk 4D-film involverer indsamling af tusindvis af optiske sektioner, så laser belysningen skal holdes så lav som muligt. Tandem fluorescerende protein Tags kan bruges til at øge signalet uden at øge ekspression af det mærkede protein16,17. Maksimering af scanningshastigheden hjælper med at begrænse foto skad...

Rum i endomembrane systemet er i konstant flux, og deres fulde karakterisering kræver levende celle scanning. Beskrevet her er en protokol, der beskæftiger 4D (time-lapse 3D) Konfokal mikroskopi til at visualisere fluorescently mærkede rum i spirende gær. Metoden blev udviklet til at spore dynamikken i sekretoriske rum i Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Denne protokol fokuserer på S. cerevisiae, som har en ikke-stablet Golgi, hvor de enkelte cisternae er optisk opløselige4. Den usædvanlige Golgi-organisation i S. cerevisiae gjorde det muligt at demonstrere ved 4d-mikroskopi, at en Golgi Cisterna oprindeligt mærker med residente tidlige Golgi-proteiner, og derefter mister disse proteiner, mens de erhverver residente sene Golgi-proteiner3 ,5. Denne overgang kan visualiseres ved at skabe en stamme, hvor den tidlige Golgi protein Vrg4 er mærket med GFP, mens den sene Golgi protein Sec7 er mærket med et monomerisk rødt fluorescerende protein. Når individuelle cisternae spores, observeres modning som en grøn-til-rød konvertering3. Denne type analyse kan give værdifulde oplysninger om protein lokalisering og rum identitet. For eksempel kan to proteiner med let forskudt ankomst og afgangstider undertiden synes at mærke forskellige rum i statiske billeder, men kan ses i 4d-film for at mærke det samme rum på forskellige tidspunkter6,7 . Således, 4D mikroskopi afslører fænomener, der ellers ikke ville være indlysende.
Informativ 4D-mikroskopi af gærrum kan opnås med passende procedurer og udstyr2. Når det er muligt, udføres fluorescerende protein mærkning ved genudskiftning8 for at undgå overekspressions artefakter. Da intracellulære strukturer ofte er meget dynamiske, er 4D-billeddannelse nødvendig for at sikre, at en struktur spores pålideligt over tid. Den protokol, der er beskrevet her, beskæftiger en Laserscanning Konfokal mikroskop udstyret med høj følsomhed detektorer. Med denne enhed, kan hele celle volumen af S. cerevisiae være afbildet af confokal mikroskopi ca hver 1-3 S, med 2 S intervaller er typiske. Data kan indsamles for op til 5-15 min afhængigt af mærkningen tætheder af fluorophores og deres photophysical egenskaber. Hoved forhindring er at minimere foto blegning. Til dette formål, laser intensiteter holdes så lavt som muligt, den confokale scanningshastigheden er maksimeret, og de optiske parametre er konfigureret til billede på Nyquist grænse for at fange de relevante oplysninger og samtidig undgå overdreven lys eksponering. Disse indstillinger forventes også at lindre fototoksicitet, en faktor, der ofte overses under levende celle billeddannelse9,10,11. De resulterende støjende data behandles med blege korrektion og dekoncentrationsalgoritmer for at lette kvantificering af fluorescens intensiteter.
Selv med høj kvalitet 4D-film, analysen er vanskelig, fordi gærrum tendens til at være talrige, heterogene, og mobile. På grund af de iboende begrænsninger af confokal mikroskopi og de ikke-optimale indstillinger, der kræves til langvarig 4D-billeddannelse, er fluorescerende strukturer, der er tæt på hinanden, svære at løse. Dette problem kan omgås ved at fokusere på det lille antal fluorescerende strukturer, der forbliver optisk afvikles i varigheden af mærknings perioden, med den antagelse, at disse strukturer er repræsentative for hele populationen af mærket Rum. Fluorescerende rum, der kan spores pålideligt, identificeres ved at se film af projekterede Z-stakke og ved at oprette en serie af montager, hvor de optiske sektioner for hvert tidspunkt er opstillet på en computerskærm. Denne analyse anvender brugerdefinerede ImageJ12 plugins, som gør det muligt at spore en individuel struktur isoleret.
Nylige metoder papirer dækkede brugen af fluorescerende proteiner i gær13 samt teori og praksis 4d konfokale Imaging af gærceller2. Denne protokol fokuserer på de vigtigste praktiske aspekter af et 4D-billedbehandlings eksperiment. Den indeholder nogle forbedringer af tidligere beskrevne procedurer samt opdaterede versioner af ImageJ plugin Code og dokumentation. Det viste eksempel fokuserer på Golgi dynamik, men denne protokol er lige så velegnet til billeddannelse andre gærrum.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

Målet med denne protokol er at karakterisere, hvordan membran rum form og omdanne i levende celler af spirende gær. Mange intracellulære rum i gær er dynamiske, og en fuld forståelse af deres egenskaber kræver tidsforskudt billeddannelse. Multi-Color 4D confokal Fluorescens mikroskopi er en kraftfuld metode til at spore opførsel og sammensætning af et intracellulært rum på en tidsskala på 5-15 min. grundig analyse af rummets dynamik kræver opsamling af tusindvis af optiske Sektioner. For at nå dette mål minimeres foto blegning og fototoksicitet ved at scanne hurtigt ved meget lav laser effekt, og pixeldimensionerne og Z-trins intervallerne er indstillet til de største værdier, der er kompatible med prøvetagning af billedet ved fuld opløsning. De resulterende 4D datasæt er støjende, men kan udjævnet ved dekoncentrering. Selv med data af høj kvalitet er analysefasen udfordrende, fordi intracellulære strukturer ofte er talrige, heterogene og mobile. For at imødekomme dette behov, Custom ImageJ plugins blev skrevet til array 4D data på en computerskærm, identificere strukturer af interesse, redigere data for at isolere individuelle strukturer, kvantificere fluorescens tid kurser, og gøre film af de projekterede Z-stakke. 4D-film er især nyttige til at skelne stabile rum fra forbigående rum, der vender sig over ved modning. Sådanne film kan også bruges til at karakterisere begivenheder såsom rum fusion, og til at teste virkningerne af specifikke mutationer eller andre forstyrrelser.

Eksemplet her dokumenter og kvantificerer modning af to gær Golgi cisternae som visualiseret af Dual-Color 4D confokal mikroskopi3. En gærcelle indeholder på rækkefølgen af 10-15 Golgi cisternae, som hver modnes over et tidsforløb på ca. 2-4 min. modning kan visualiseres ved at tagge den tidlige Golgi-markør Vrg4 med GFP og ved at tagge den sene Golgi-markør Sec7 med et rødt fluorescerende protein såsom mCherry eller mScarlet. En individuel Cisterna etik...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D-mikroskopi af gær

Denne protokol beskriver analysen af fluorescently mærkede intracellulære rum i spirende gær ved hjælp af multi-Color 4D (time-lapse 3D) confokal mikroskopi. Billedbehandlings parametrene vælges til at opfange passende signaler, samtidig med at foto skader begrænses. Brugerdefinerede ImageJ plugins tillader, at mærkede strukturer spores og analyseres kvantitativt.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Denne metode sporer strukturer i gærceller i tre dimensioner over mange minutter, hvilket giver os mulighed for at studere dynamikken i intracellulære organeller og rum. 4D-billeddannelse sikrer, at vi kan drage pålidelige konklusioner om intracellulær dynamik, især for strukturer eller markører, der kan være forbigående. Demonstration af proceduren vil være Natalie Johnson, en postdoc fra mit laboratorium.Begynd med at dyrke en overnight kultur af gær stamme af interesse i fem milliliter af ikke-fluorescerende syntetisk defineret, eller NSD, medium, i en 15 milliliter forvirret kolbe med god befrugtning, ved 23 grader Celsius. Tre til fire timer før analysen fortyndes den logaritmiske fase gærkultur i frisk NSD-medium, således at den endelige optiske tæthed ved 600 nanometer eller OD600 vil være 0,5 til 0,8 på billeddannelsestidstid. Mindst en time før kulturen er klar, centrifuge en aliquot af en to milligram per milliliter Concanavalin En løsning i fem minutter ved fuld hastighed, at pellet eventuelle partikler, og tilsæt 250 mikroliter af supernatant i en ren 35 millimeter glas bund mikroskopi fad.Efter 15 minutter vaskes skålen to til tre gange med to milliliter destilleret vand pr. vask, og der tilsættes 250 mikroliter af gærkulturen til Concanavalin A-belagt skål, efter at den er tørret. Vent 10 minutter på at lade cellerne klæbe, før skålen vaskes to til tre gange mere med to milliliter frisk NSD-medium. Derefter dække cellerne med to milliliter frisk NSD.Hvis du vil afbilde gærcellerne, skal du vælge et 63X olienedbætningsobjektiv med en numerisk blændeåbning på mindst 1,4 på et konfokalt lysmikroskop. Her kan en 100X objektiv også bruges i stedet for en 63X objektiv. Derefter placere parabol på objektivet linse, plettet med nedsænkning olie.Vælg xyzt i rullemenuen under fanen Anskaffelsestilstand. Under fanen XY skal du formatere rammestørrelsen til 256 bredde med 128 højde. Brug den maksimale scanningshastighed, som typisk er i rækkefølge efter otte kilohertz.Slå tovejs X-scanning til, hvis den er tilgængelig, og juster zoomfaktoren til ni, hvilket vil resultere i en pixelstørrelse på ca. 80 nanometer. Hvis der bruges en 100X-målsætning, skal du justere zoomfaktoren i overensstemmelse hermed for at opretholde en pixelstørrelse på ca. 80 nanometer. Sæt derefter linjeakkumulering til fire eller seks.Indstil pinhole til 1,2 Luftige enheder, og tænd for den hvide lys laser, hvis det er tilgængeligt. Derefter indstille excitation bølgelængde og procent laser magt for hver fluorescens kanal. Hvis det er tilgængeligt, skal du aktivere brugen af fotonoptællingstilstand under fanen Konfiguration ved at fravælge maksimal integrationstid.For hver fluorescenskanal skal du tildele en højfølsom detektor, indstille bølgelængdeområdet for emissionen og aktivere fotontællingstilstand, hvis den er tilgængelig. Indstil tidsgating vinduet til 0,6 til 10 nanosekunder for hver fluorescens kanal, for at undgå at opfange reflekteret lys fra glasskålen. Derefter skal du slå lys feltbilleder til og vælge detektor med lav følsomhed til dataindsamlingen.Slå dynamisk billeddannelsestilstand til, og skru op for forstærkningen i den lyse feltkanal, indtil cellerne er tydeligt synlige. Hvis du er i fotontællingstilstand, skal du ændre området for grå værdier fra manuel til automatisk for at få vist fluorescerende signalet. Indstil Z-stakken til at afbilde hele volumenet af gærceller, og angiv billedbilledets retningsbestemthed, således at ned bevæger sig mod dækslet.Indstil Z-trinsintervallet til 0,25 til 0,35 mikrometer for at få ca. 20 til 25 optiske sektioner pr. Z-stack, og tænd for Galvo Flowet, hvis det er tilgængeligt. For en typisk film skal du indstille tidsintervallet mellem Z-stakke til to sekunder og indstille filmens varighed til fem til 10 minutter. Gem derefter filmen som en LIF-fil.I tilfælde af deconvolution af film skal du starte et passende deconvolution-softwareprogram, der bruger den klassiske estimeringsalgoritme med maksimal sandsynlighed, og åbne dataserien. Vælg guiden Deconvolution og parametereditoren for at bekræfte, at billedparametrene registreres og vises korrekt. Skift indlejringsmediets brydningsindekss værdi til 1,4 for at tilnærme gærcytoplasmaet.Brug derefter editoren til at estimere dækslets position. Vælg Angiv alle bekræftede, og klik på Acceptér, og vælg Guiden Enter. Klik på den næste pil for at omgå valg af punktspredningsfunktion og beskæring af faser for behandling, og fortsæt gennem guiden deconvolution for hver fluorescenskanal.Vælg funktionen til fysisk eller logaritmisk lodret tilknytning, og undersøg den rå datafluorescensintensitetsprofil. Angiv manuel som tilstand for baggrundsestimering, angiv en baggrundsværdi, og klik på Acceptér. Lad den maksimale iterationsværdi være 40, og indtast et anslået signal-støjforhold.Sluk derefter for blegemiddelkorrektionen, og klik på Deconvolve. Vælg Accepter til næste kanal i deconvolution-resultatvinduet, hvis støjen fjernes tilstrækkeligt, uden at den ægte fluorescens fjernes fra de dunkle strukturer. Når alle de fluorescerende kanaler er blevet tilfredsstillende dekonvolvedet, skal du klikke på Alt gjort og arrangere den røde kanal først, efterfulgt af de grønne, blå og lyse feltkanaler, til efterfølgende redigering i ImageJ.Gem derefter billedsekvensen som en otte-bit TIF-fil, og vælg én fil pr. kanal- og kontraststrækning som konverteringstilstand. For blegemiddel korrektion, importere de dekoncentralerede billedsekvenser i ImageJ og klik på Billede, Hyperstacks, og Stak til Hyperstack at konvertere billederne til en hyperstack. Vælg xyzct i rullemenuen, og angiv antallet af kanaler, Z-stack-udsnit og tidsrammer.Hvis du vil rette fluorescenskanalerne til fotoblegning, skal du vælge Billede, Farve, Split Channels og for lysstofrør skal du vælge Plugins, EMBLtools, Bleach Correction og Eksponentiel pasform. Vælg derefter Billed-, farve- og fletkanaler for at flette de lyse felt- og blegemiddelkorrigeret fluorescenskanaler til en hyperstack, og gem den dekoncentralerede og blegemiddel korrigeret hyperstack til efterfølgende filmgenerering og redigering som en otte-bit TIF-fil. Hvis du vil konvertere det dekoncentralerede og blegemiddel korrigerede datasæt til en skaleret montage, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Make Montage Series og vælge den relevante otte bit hyperstack.Klik på Åbn og OK for at acceptere, at alle udsnittene bruges til at oprette montagen, og klik på OK igen for at acceptere den foreslåede skaleringsfaktorværdi. Gem den oprindelige montage som en otte bit TIF-fil og vælg Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack og OK, for at skabe en 4D hyperstack fra den oprindelige montage, der omfatter alle tidsrammer. Hvis du vil generere den oprindelige forventede film med gennemsnittet, skal du først vælge Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack og OK for at acceptere standardparametrene for ZProjection.Gem den gennemsnitlige projicerede film som en otte-bit TIF-fil, og undersøg filmen for at identificere de enkelte strukturer, der kan spores i hele deres mærkningsperiode. Identifikation af en struktur, der kan spores pålideligt i filmens løbetid, og isolering af denne struktur til analyse er de mest kritiske trin i proceduren. Følg derefter instruktionerne i plugin brugervejledningen, at isolere strukturer af interesse ved at redigere montage.Opret en 4D hyperstack fra den redigerede montage for perioden, herunder de strukturer af interesse, og gemme den redigerede hyperstack. Hvis du vil kvantificere fluorescensintensiteten over tid for den isolerede struktur i den redigerede 4D-hyperstack, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Analysér redigeret film, indtaste tidsintervallet mellem Z-stakke og klikke på OK. Hvis du vil oprette en endelig film af den isolerede struktur, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Project Hyperstack, angive de Z-stack-udsnit, der skal medtages, vælge Gennemsnitlig intensitet som projektionstype og klikke på OK. Hvis du vil oprette en 4D-hyperstack med de oprindelige data over de redigerede data, skal du vælge plugins, IJ_Plugins, Flet to hyperstacks og Placer først over sekundet. Hvis du vil generere en film fra 4D-hyperstack med de oprindelige data over de redigerede data, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Project Hyperstack, angive de Z-stack udsnit, der skal medtages, vælge Gennemsnitlig intensitet som projektionstype og klikke på OK. Her kan den første ramme af en Z-stack projektion af rå data sammenlignes med de samme deconvolved og blegemiddel korrigerede data.Disse rammer fra samme deconvolved og blegemiddel korrigeret film viser to cisternae, der blev analyseret, som først etiket med den grønne Vanadate modstand glycosylation protein 4 eller Vrg4 markør, og senere med den røde Secretory 7 eller Sec7 gentransport protein markør. Denne montage, skabt af en deconvolved og blegemiddel korrigeret hyperstack, viser alle de optiske sektioner på et enkelt tidspunkt før og efter redigering, for at tillade isolering af signalet fra en af de valgte cisternae. I dette tal vises flere billeder fra den endelige film af de projicerede Z-stakke med de oprindelige fremskrivninger øverst på figuren og redigerede fremskrivninger nederst.Kvantificering af de grønne og røde fluorescerende signaler fra den valgte Golgi cisternae afslører, at den grønne Vrg4 markør ankommer og fortsætter i ca 80 sekunder, hvorefter den røde Sec7 markør ankommer og fortsætter i ca 60 sekunder, med en kort overlapning mellem de to markører. Når du udfører denne procedure, er det vigtigt at identificere strukturer, der entydigt kan spores gennem hele deres levetid. Den samme type analyse kan udføres efter at have foretaget en mutation eller en anden form for specifik hastighed.Denne teknik har åbnet vejen for at studere den dynamiske adfærd Golgi cisternae og endoplasmatiske reticulum exit sites ved hjælp af gær som model system.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatografisk Rensning af højaktiv Gær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging af proteinaggregering i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analyserer kraniofacial Morfogenese i zebrafisk Brug 4D konfokal mikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Bredspredning og immunfarvning af gærkromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopi af fission Gær Seksuel Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...