Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH Grant R01 GM104010. Bedankt voor de hulp met fluorescentiemicroscopie aan Vytas Bindokas en Christine labno op de geïntegreerde microscopie kern faciliteit, die wordt ondersteund door de door NIH gefinancierde Cancer Center ondersteuning Grant P30 CA014599.

1. voorbereiding
<ol><li>Maak niet-fluorescerende minimale NSD-medium2. De afwezigheid van riboflavine wordt verwacht om achtergrond intracellulaire groene fluorescentie en bijbehorende fototoxiciteit te verminderen.</li>
	<li>Kweek de gist stam 's nachts bij ~ 23 °c tot logaritmische fase in 5 ml nsd in een verbijsterd kolf van 50 ml met goede beluchting. Over 3-4 h vóór de analyse, Verdun de gistcultuur in verse NSD zodat de uiteindelijke OD600 0,5-0,8 zal zijn op het moment van beeldvorming....

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

4D confocale beeldvorming van gist organellen vereist zorgvuldige afstemming van meerdere parameters. De belangrijkste zorg is fotobleaching en fototoxiciteit. Een typische 4D-film omvat het verzamelen van duizenden optische secties, zodat de laser verlichting zo laag mogelijk moet worden gehouden. Tandem fluorescerende eiwit Tags kunnen worden gebruikt om het signaal te stimuleren zonder de expressie van het gelabelde eiwit16,17te verhogen. Het maximaliseren van...

Compartimenten van het endomembraansysteem-systeem zijn in constante flux en hun volledige karakterisering vereist Live-celbeeldvorming. Hier beschreven is een protocol dat 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie gebruikt om fluorescently gelabelde compartimenten te visualiseren in ontluikende gisten. De methode werd ontwikkeld om de dynamiek van secretoire compartimenten in Pichia pastoris en Saccharomyces cerevisiae1,2,3te volgen. Dit protocol richt zich op S. cerevisiae, die een niet-gestapelde Golgi heeft waarin de individuele cisternae optisch resolveerbaar4zijn. De ongewone Golgi-organisatie in S. cerevisiae heeft de demonstratie van 4D microscopie mogelijk gemaakt dat een Golgi Cisterna aanvankelijk etiketten met Resident vroege Golgi-eiwitten, en vervolgens deze eiwitten verliest tijdens het verwerven van Resident late Golgi-eiwitten3 ,5. Deze overgang kan worden gevisualiseerd door het creëren van een stam waarin de vroege Golgi eiwit Vrg4 is gelabeld met GFP terwijl de late Golgi eiwit Sec7 is gelabeld met een monomere rode fluorescerende eiwitten. Wanneer individuele cisternae worden bijgehouden, rijping wordt waargenomen als een groen-naar-rood conversie3. Dit type analyse kan waardevolle informatie geven over de eiwit lokalisatie en de identiteit van het compartiment. Bijvoorbeeld, twee eiwitten met licht offset aankomst-en vertrektijden kunnen soms lijken om verschillende compartimenten te labelen in statische beelden, maar kunnen worden gezien in 4D-films om hetzelfde compartiment op verschillende tijdstippen te labelen6,7 . Zo onthult 4D microscopie verschijnselen die anders niet duidelijk zouden zijn.
Informatieve 4D microscopie van gist compartimenten kan worden bereikt met de juiste procedures en apparatuur2. Waar mogelijk wordt fluorescerende eiwit tagging uitgevoerd door Gene Replacement8 om overexpressie artefacten te voorkomen. Omdat intracellulaire structuren vaak zeer dynamisch zijn, is 4D-beeldvorming nodig om ervoor te zorgen dat een structuur na verloop van tijd betrouwbaar wordt bijgehouden. Het protocol hier beschreven maakt gebruik van een laser scanning confocale Microscoop uitgerust met hoge gevoeligheid detectoren. Met dit apparaat kan het volledige celvolume van S. cerevisiae worden afgebeeld met een confocale microscopie ongeveer elke 1-3 s, waarbij 2 S-intervallen kenmerkend zijn. Gegevens kunnen worden verzameld voor maximaal 5-15 min afhankelijk van de dichtheid van de fluoroforen en hun fotomophysical eigenschappen labelen. De belangrijkste hindernis is het minimaliseren van photobleaching. Voor dit doel worden de laser intensiteiten zo laag mogelijk gehouden, de confocale scansnelheid is gemaximaliseerd, en de optische parameters zijn geconfigureerd voorbeeld bij de Nyquist-limiet om de relevante informatie te vangen terwijl overmatige licht blootstelling wordt vermeden. Deze instellingen worden ook verwacht om de fototoxiciteit te verlichten, een factor die vaak over het hoofd wordt gezien tijdens Live-celbeeldvorming9,10,11. De resulterende lawaaierige gegevens worden verwerkt met bleekmiddel correctie en deconvolutie algoritmen om kwantificering van fluorescentie intensiteiten te vergemakkelijken.
Zelfs met 4D-films van hoge kwaliteit is de analyse lastig omdat gist compartimenten vaak talrijk, heterogeen en mobiel zijn. Vanwege de intrinsieke beperkingen van confocale microscopie en de niet-optimale instellingen die nodig zijn voor langdurige 4D-beeldvorming, zijn fluorescerende structuren die in de buurt van elkaar liggen moeilijk op te lossen. Dit probleem kan worden omzeild door zich te concentreren op het kleine aantal fluorescerende constructies dat voor de duur van de etiketterings periode optisch afwikkelbaar blijft, met de veronderstelling dat deze structuren representatief zijn voor de hele populatie van gelabelde Compartimenten. Fluorescerende compartimenten die betrouwbaar kunnen worden bijgehouden, worden geïdentificeerd door films van geprojecteerde Z-stacks te bekijken en door een reeks montages te maken waarin de optische secties voor elk tijdpunt op een computerscherm worden weergegeven. Deze analyse maakt gebruik van aangepaste ImageJ12 plugins, die het mogelijk maken een individuele structuur in afzondering worden bijgehouden.
Recente methodes papers bestreken het gebruik van fluorescerende eiwitten in gist13 , evenals de theorie en praktijk van 4D confocale beeldvorming van gistcellen2. Dit protocol richt zich op de belangrijkste praktische aspecten van een 4D Imaging experiment. Het bevat enkele verbeteringen aan eerder beschreven procedures, evenals bijgewerkte versies van de ImageJ-invoegtoepassing code en documentatie. Het getoonde voorbeeld richt zich op Golgi-dynamiek, maar dit protocol is ook geschikt voor de beeldvorming van andere gist compartimenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

Het doel van dit protocol is om te karakteriseren hoe membraan compartimenten vorm en transformeren in levende cellen van ontluikende gist. Veel intracellulaire compartimenten in gist zijn dynamisch, en een volledig begrip van hun eigenschappen vereist timelapse-beeldvorming. Multi-Color 4D confocale fluorescentiemicroscopie is een krachtige methode voor het bijhouden van het gedrag en de samenstelling van een intracellulaire compartiment op een tijdschaal van 5-15 min. een grondige analyse van het compartiment dynamiek vereist de vangst van duizenden optische Secties. Om dit doel te bereiken, worden fotobleaching en fototoxiciteit geminimaliseerd door snel te scannen bij zeer lage Laser stroom, en de pixelafmetingen en Z-stap intervallen worden ingesteld op de grootste waarden die compatibel zijn met het bemonsteren van de afbeelding met volledige resolutie. De resulterende 4D-datasets zijn luidruchtig, maar kunnen worden gladgestreden door deconvolutie. Zelfs met gegevens van hoge kwaliteit is de analyse fase uitdagend omdat intracellulaire structuren vaak talrijk, heterogeen en mobiel zijn. Om aan deze behoefte te voldoen, zijn aangepaste ImageJ-plug-ins geschreven naar array 4D-gegevens op een computerscherm, identificeren van belangen structuren, bewerken van de gegevens om individuele structuren te isoleren, kwantificeren de fluorescentie tijd cursussen en maken films van de geprojecteerde Z-stacks. 4D-films zijn vooral handig voor het onderscheiden van stabiele compartimenten van tijdelijke compartimenten die omkomen door rijping. Dergelijke films kunnen ook worden gebruikt om gebeurtenissen zoals compartiment fusie te karakteriseren en om de effecten van specifieke mutaties of andere verstoringen te testen.

Het voorbeeld hier documenten gegeven en kwantificeert de rijping van twee gist Golgi cisternae als gevisualiseerd door Dual-Color 4D confocale microscopie3. Een gist cel bevat op de orde van 10-15 Golgi cisternae, elk van die rijpt over een tijdsverloop van ongeveer 2-4 min. rijping kan worden gevisualiseerd door het taggen van de vroege Golgi marker Vrg4 met GFP en door het taggen van de late Golgi marker Sec7 met een rode fluorescerende eiwitten zoals mCherry of...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D microscopie van gist

Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Deze methode volgt structuren in gistcellen in drie dimensies gedurende vele minuten, waardoor we de dynamiek van intracellulaire organellen en compartimenten kunnen bestuderen. 4D-beeldvorming zorgt ervoor dat we betrouwbare conclusies kunnen trekken over intracellulaire dynamiek, met name voor structuren of markers die van voorbijgaande aard kunnen zijn. Het aantonen van de procedure zal Natalie Johnson zijn, een postdoc uit mijn laboratorium.Begin met het kweken van een nachtelijke cultuur van de gist stam van belang in vijf milliliter van niet-fluorescerende synthetische gedefinieerd, of NSD, medium, in een 15 milliliter verbijsterd kolf met een goede beerting, op 23 graden Celsius. Drie tot vier uur voor de analyse verdun de logaritmische fase gistcultuur in verse NSD-medium, zodat de uiteindelijke optische dichtheid op 600 nanometer, of OD600, 0,5 tot 0,8 zal zijn op het moment van beeldvorming. Ten minste een uur voordat de cultuur klaar is, centrifuge een aliquot van een twee milligram per milliliter Concanavalin Een oplossing gedurende vijf minuten op volle snelheid, om eventuele deeltjes pellet, en voeg 250 microliter van de supernatant in een schone 35 millimeter glazen bodem microscopie schotel.Na 15 minuten, was de schotel twee tot drie keer met twee milliliter gedestilleerd water per wasbeurt, het toevoegen van 250 microliters van de gistcultuur aan de Concanavalin A-gecoate schotel nadat het is gedroogd. Wacht 10 minuten om de cellen te hechten, voordat zachtjes wassen van de schotel twee tot drie keer met twee milliliter verse NSD medium. Bedek vervolgens de cellen met twee milliliter verse NSD.Om de gistcellen in beeld te brengen, selecteert u een 63X-olieonderdompelingslens met een numeriek diafragma van ten minste 1,4 op een confocale lichtmicroscoop. Hier kan een 100X objectieve lens ook worden gebruikt in plaats van een 63X objectieve lens. Plaats vervolgens de schotel op de objectieflens, gespot met onderdompelingsolie.Selecteer xyzt in het vervolgkeuzemenu van het tabblad Acquisitiemodus. Op het tabblad XY wordt de framegrootte opgemaakt op 256 breedte bij 128 hoogte. Gebruik de maximale scansnelheid, die meestal op de orde van acht kilohertz.Schakel bidirectioneel X-scannen in als deze beschikbaar is en pas de zoomfactor aan op negen, wat resulteert in een pixelgrootte van ongeveer 80 nanometer. Als een doelstelling van 100X wordt gebruikt, past u de zoomfactor dienovereenkomstig aan om een pixelgrootte van ongeveer 80 nanometer te behouden. Stel vervolgens de lijnaccumulatie in op vier of zes.Stel het gaatje in op 1,2 luchtige eenheden en zet indien beschikbaar de witte lichtlaser aan. Stel vervolgens de excitatiegolflengte en procent laserkracht voor elk fluorescentiekanaal in. Schakel indien beschikbaar de gebruiksmodus van foton in onder het configuratietabblad door de maximale integratietijd uit te schakelen.Wijs voor elk fluorescentiekanaal een detector met een hoge gevoeligheid toe, stel het emissiegolflengtebereik in en schakel indien beschikbaar de fotontelmodus in. Stel de tijd gating venster op 0,6 tot 10 nanoseconden voor elk fluorescentiekanaal, om te voorkomen dat het vastleggen van gereflecteerd licht van de glazen schotel. Schakel vervolgens heldere veldbeeldweergave in en selecteer een detector met een lage gevoeligheid voor het verzamelen van gegevens.Schakel de live-beeldmodus in en zet de versterking in het heldere veldkanaal omhoog totdat de cellen duidelijk zichtbaar zijn. Als u in de fotontelmodus het bereik van de grijze waarden wijzigt van handmatig naar automatisch om het tl-signaal weer te geven. Stel de Z-stack in op het hele volume van gistcellen en geef de richting van de beeldvorming zodanig op dat naar beneden naar de afdekslip gaat.Stel het Z-stapinterval in op 0,25 tot 0,35 micrometer om ongeveer 20 tot 25 optische secties per Z-stack te verkrijgen en schakel de Galvo-stroom in als deze beschikbaar is. Stel voor een typische film het tijdsinterval tussen Z-stacks in op twee seconden en stel de duur van de film in op vijf tot tien minuten. Sla vervolgens de film op als een LIF-bestand.Voor filmdeconvolutie start u een geschikt deconvolutiesoftwareprogramma dat gebruik maakt van het klassieke schattingsalgoritme voor maximale kans en opent u de gegevensreeks. Selecteer deconvolution en parametereditor om te bevestigen dat de beeldvormingsparameters worden gedetecteerd en correct worden weergegeven. Wijzig de waarde van de inbeddingsmiddel refractieve index in 1,4 om het gistcytoplasma bij benadering te benaderen.Gebruik vervolgens de editor om de dekkingsslippositie te schatten. Selecteer Alle geverifieerde opties instellen en klik op Accepteren en selecteer Wizard Enter. Klik op de volgende pijl om de selectie van de puntspreadfunctie en het bijsnijden van pre-processing fasen te omzeilen en ga door de wizard deconvolutie voor elk fluorescentiekanaal.Selecteer de compute logaritmische verticale toewijzingsfunctie en inspecteer het profiel van de ruwe gegevensfluorescentieintensiteit. Stel handmatig in als de modus voor de achtergrondschatting, voer een achtergrondwaarde in en klik op Accepteren. Laat de maximale iteratiewaarde op 40 en voer een geschatte signaal-ruisverhouding in.Schakel vervolgens de bleekmiddelcorrectie uit en klik op Deconvolve. Selecteer Accepteren naar het volgende kanaal in het venster deconvolutieresultaat, als het geluid voldoende wordt verwijderd zonder de echte fluorescentie van de schemerige structuren te elimineren. Zodra alle fluorescerende kanalen naar tevredenheid zijn gedeconvolviseerd, klikt u op Alles gedaan en rangschikt u eerst het rode kanaal, gevolgd door de groene, blauwe en heldere veldkanalen, voor latere bewerking in ImageJ.Sla vervolgens de beeldreeks op als een TIF-bestand van acht bits en selecteer één bestand per kanaal en contrastrek als conversiemodus. Voor bleekmiddelcorrectie importeert u de gedeconvolveerde beeldsequenties in ImageJ en klikt u op Afbeelding, Hyperstack en Stapel naar Hyperstack om de afbeeldingen om te zetten in een hyperstack. Selecteer xyzct in het vervolgkeuzemenu en voer het aantal kanalen, Z-stack segmenten en tijdframes in.Als u de fluorescentiekanalen voor het bleken van foto's wilt corrigeren, selecteert u Afbeelding, Kleur, Gesplitste kanalen en voor fluorescerende kanalen, selecteert u Plug-ins, EMBLtools, Bleach Correction en Exponential Fit. Selecteer vervolgens Kanalen voor afbeeldingen, kleuren en samenvoegen om het heldere veld samen te voegen en de gecorrigeerde fluorescentiekanalen samen te voegen tot een hyperstack en sla de gedeconvolveerde en gebleekte hyperstack op voor volgende filmgeneratie en bewerking als een acht-bits TIF-bestand. Als u de gedeconvolveerde en geblen gecorrigeerde gegevensset wilt converteren naar een geschaalde montage, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Montage-serie maken en selecteert u de relevante acht-bits hyperstack.Klik op Openen en OK om te accepteren dat alle segmenten worden gebruikt om de montage te maken en klik nogmaals op OK om de voorgestelde schaalfactorwaarde te accepteren. Sla de originele montage op als een acht-bits TIF-bestand en selecteer Plugins, IJ_Plugins, Montage-serie naar Hyperstack en OK, om een 4D-hyperstack te maken van de oorspronkelijke montage die alle tijdschema's bevat. Als u de oorspronkelijke gemiddelde geprojecteerde film wilt genereren, selecteert u eerst Plug-ins, IJ_Plugins, Project Hyperstack en OK om de standaardparameters van ZProjection te accepteren.Sla de gemiddelde geprojecteerde film op als een TIF-bestand van acht bits en inspecteer de film om afzonderlijke structuren te identificeren die kunnen worden bijgehouden voor de duur van hun etiketteringsperiode. Het identificeren van een structuur die betrouwbaar kan worden bijgehouden voor de duur van de film en het isoleren van die structuur voor analyse, zijn de meest kritieke stappen van de procedure. Volg vervolgens instructies in de gebruikershandleiding van de plugin om structuren van belang te isoleren door de montage te bewerken.Maak een 4D-hyperstack van de bewerkte montage voor de periode inclusief de structuren van belang, en sla de bewerkte hyperstack. Als u de fluorescentieintensiteit in de loop van de tijd wilt kwantificeren voor de geïsoleerde structuur in de bewerkte 4D-hyperstack, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Edited Movie analyseren, voert u het tijdsinterval tussen Z-stacks in en klikt u op OK. Als u een definitieve film van de geïsoleerde structuur wilt maken, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Project Hyperstack, geeft u de Z-stacksegmenten op die moeten worden opgenomen, selecteert u Gemiddelde intensiteit als projectietype en klikt u op OK. Als u een 4D-hyperstack wilt maken met de oorspronkelijke gegevens over de bewerkte gegevens, selecteert u plug-ins, IJ_Plugins, Twee hyperstacks samenvoegen en Plaats eerst boven de seconde. Als u een film uit de 4D-hyperstack wilt genereren met de oorspronkelijke gegevens over de bewerkte gegevens, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Project Hyperstack, geeft u de Z-stacksegmenten op die moeten worden opgenomen, selecteert u Gemiddelde intensiteit als projectietype en klikt u op OK. Hier kan het eerste frame van een Z-stack projectie van ruwe gegevens worden vergeleken met dezelfde gedeconvolveerde en bleekmiddel gecorrigeerde gegevens.Deze frames uit dezelfde gedeconvolveerde en gebleekte film tonen twee reservoirs die werden geanalyseerd, die eerst label met de groene Vanadate weerstand glycosylation eiwit 4 of Vrg4 marker, en later met de rode Secretory 7 of Sec7 gen transport eiwit marker. Deze montage, gemaakt van een gedeconvolveerde en bleekmiddel gecorrigeerde hyperstack, toont alle optische secties op een enkel tijdstip voor en na het bewerken, om isolatie van het signaal van een van de gekozen stortbak mogelijk te maken. In deze figuur worden verschillende frames uit de uiteindelijke film van de geprojecteerde Z-stacks weergegeven met de originele projecties aan de bovenkant van de figuur en bewerkte projecties aan de onderkant.Kwantificering van de groene en rode fluorescerende signalen van de gekozen Golgi-reservoir laat zien dat de groene Vrg4-marker ongeveer 80 seconden aankomt en aanhoudt, waarna de rode Sec7-markering aankomt en ongeveer 60 seconden aanhoudt, met een korte overlap tussen de twee markeringen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om structuren te identificeren die ondubbelzinnig kunnen worden bijgehouden gedurende hun hele levensduur. Hetzelfde type analyse kan worden uitgevoerd na het maken van een mutatie of een ander type specifieke verstoring.Deze techniek heeft de weg geopend naar het bestuderen van het dynamische gedrag van Golgi cisternae en endoplasmische reticulum exit sites met behulp van gist als een model systeem.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Zuivering van Mitochondriën uit gistcellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Gist Colony integratiemethode

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Chromatografische zuivering van sterk actieve gist Ribosomen

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D beeldvorming van eiwitaggregatie in levende cellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...