Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss R01 GM104010 unterstützt. Vielen Dank für die Unterstützung bei der Fluoreszenzmikroskopie an Vytas Bindokas und Christine Labno in der Integrated Microscopy Core Facility, die vom NIH-finanzierten Cancer Center Support Grant P30 CA014599 unterstützt wird.

1. Vorbereitung
<ol><li>Machen Sie nicht fluoreszierendes minimales NSD-Medium2. Das Fehlen von Riboflavin wird voraussichtlich die intrazelluläre fluoreszenz und die damit verbundene Phototoxizität im Hintergrund verringern.</li>
	<li>Wachsen Sie den Hefestamm über Nacht bei 23 °C bis zur logarithmischen Phase in 5 ml NSD in einem 50 ml verwirrten Kolben mit guter Belüftung. Etwa 3-4 h vor der Analyse, verdünnen Sie die Hefekultur in frischem NSD, so dass die endgültige OD600 zum Zeitpunkt...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

Die konfokale 4D-Bildgebung von Hefeorganellen erfordert eine sorgfältige Abstimmung mehrerer Parameter. Das Hauptanliegen ist Photobleaching und Phototoxizität. Ein typischer 4D-Film beinhaltet das Sammeln von Tausenden von optischen Abschnitten, so dass die Laserbeleuchtung so gering wie möglich gehalten werden muss. Tandem fluoreszierende Protein-Tags können verwendet werden, um das Signal zu steigern, ohne die Expression des markierten Proteins16,17zu erh...

Die Fächer des Endomembransystems befinden sich im ständigen Fluss, und ihre vollständige Charakterisierung erfordert eine Live-Zell-Bildgebung. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die konfokale 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D) verwendet, um fluoreszierend beschriftete Fächer in angehenden Hefen zu visualisieren. Die Methode wurde entwickelt, um die Dynamik der Sekretoreifächer in Pichia pastoris und Saccharomyces cerevisiae1,2,3zu verfolgen. Dieses Protokoll konzentriert sich auf S. cerevisiae, das einen nicht gestapelten Golgi hat, in dem die einzelnen Zisternen optisch auflösbar sind4. Die ungewöhnliche Golgi-Organisation in S. cerevisiae ermöglichte die Demonstration durch 4D-Mikroskopie, dass eine Golgi-Zisterne zunächst mit ansässigen frühen Golgi-Proteinen etikettiert und dann diese Proteine verliert, während sie ansässige späte Golgi-Proteine erwirbt3 ,5. Dieser Übergang kann durch die Schaffung eines Stammes visualisiert werden, bei dem das frühe Golgi-Protein Vrg4 mit GFP beschriftet wird, während das späte Golgi-Protein Sec7 mit einem monomeren roten fluoreszierenden Protein gekennzeichnet ist. Wenn einzelne Zisternen verfolgt werden, wird die Reifung als Grün-Rot-Umwandlung3beobachtet. Diese Art der Analyse kann wertvolle Informationen über die Proteinlokalisierung und die Identität des Kompartiments liefern. Beispielsweise können zwei Proteine mit leicht versetzten Ankunfts- und Abfahrtszeiten manchmal verschiedene Fächer in statischen Bildern zu kennzeichnen scheinen, können aber in 4D-Filmen gesehen werden, um dasselbe Fach zu verschiedenen Zeitpunkten zu beschriften6,7 . So zeigt die 4D-Mikroskopie Phänomene auf, die sonst nicht erkennbar wären.
Informative 4D-Mikroskopie von Hefefächern kann mit geeigneten Verfahren und Ausrüstung2erreicht werden. Wann immer möglich, wird fluoreszierende Protein-Tagging durch Genersatz8 durchgeführt, um Überexpressionsartefakte zu vermeiden. Da intrazelluläre Strukturen oft sehr dynamisch sind, ist eine 4D-Bildgebung erforderlich, um sicherzustellen, dass eine Struktur im Laufe der Zeit zuverlässig nachverfolgt wird. Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein laserscannendes Konfokalmikroskop, das mit hochempfindlichen Detektoren ausgestattet ist. Mit diesem Gerät kann das gesamte Zellvolumen von S. cerevisiae durch konfokale Mikroskopie etwa alle 1-3 s abgebildet werden, wobei 2 s Intervalle typisch sind. Die Daten können je nach Beschriftungsdichten der Fluorophore und ihren photophysikalischen Eigenschaften bis zu 5-15 min gesammelt werden. Die Haupthürde ist die Minimierung der Photobleichung. Zu diesem Zweck werden die Laserintensitäten so gering wie möglich gehalten, die konfokale Scangeschwindigkeit maximiert und die optischen Parameter so konfiguriert, dass sie am Nyquist-Grenzwert abbilden, um die relevanten Informationen zu erfassen und gleichzeitig eine übermäßige Lichteinwirkung zu vermeiden. Diese Einstellungen sollen auch die Phototoxizität lindern, ein Faktor, der bei der Live-Zell-Bildgebung oft übersehen wird9,10,11. Die resultierenden lauten Daten werden mit Bleichkorrektur- und Dekonvolutionalgorithmen verarbeitet, um die Quantifizierung von Fluoreszenzintensitäten zu erleichtern.
Selbst bei hochwertigen 4D-Filmen ist die Analyse schwierig, da Hefefächer in der Regel zahlreich, heterogen und mobil sind. Aufgrund der intrinsischen Einschränkungen der konfokalen Mikroskopie und der nicht optimalen Einstellungen, die für eine längere 4D-Bildgebung erforderlich sind, sind fluoreszierende Strukturen, die nahe beieinander liegen, schwer zu lösen. Dieses Problem kann umgangen werden, indem man sich auf die geringe Anzahl von fluoreszierenden Strukturen konzentriert, die für die Dauer des Etikettierungszeitraums optisch lösbar bleiben, wobei davon ausgegangen wird, dass diese Strukturen repräsentativ für die gesamte Population der markierten Fächer. Fluoreszierende Fächer, die zuverlässig nachverfolgt werden können, werden identifiziert, indem Filme von projizierten Z-Stacks angesehen und eine Reihe von Montagen erstellt werden, in denen die optischen Abschnitte für jeden Zeitpunkt auf einem Computerbildschirm angeordnet sind. Diese Analyse verwendet benutzerdefinierte ImageJ12 Plugins, die es ermöglichen, eine individuelle Struktur isoliert nachzuverfolgen.
Jüngste Methoden Papiere behandelt die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen in Hefe13 sowie die Theorie und Praxis der 4D konfokale Bildgebung von Hefezellen2. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die wichtigsten praktischen Aspekte eines 4D-Bildgebungsexperiments. Es enthält einige Verbesserungen an zuvor beschriebenen Verfahren sowie aktualisierte Versionen des ImageJ-Plugin-Codes und der Dokumentation. Das gezeigte Beispiel konzentriert sich auf die Golgi-Dynamik, aber dieses Protokoll eignet sich gleichermaßen für die Abbildung anderer Hefekomden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu charakterisieren, wie Membranfächer sich in lebenden Zellen angehender Hefe bilden und transformieren. Viele intrazelluläre Kompartimente in Hefe sind dynamisch, und ein vollständiges Verständnis ihrer Eigenschaften erfordert Zeitraffer-Bildgebung. Die mehrfarbige 4D-Konfokalfluoreszenzmikroskopie ist eine leistungsstarke Methode zur Verfolgung des Verhaltens und der Zusammensetzung eines intrazellulären Fachs auf einer Zeitskala von 5-15 min. Eine strenge Analyse der Fachdynamik erfordert die Erfassung von Tausenden von optischen Bereichen. Um dieses Ziel zu erreichen, werden Photobleaching und Phototoxizität durch schnelles Scannen bei sehr geringer Laserleistung minimiert, und die Pixelabmessungen und Z-Schritt-Intervalle werden auf die größten Werte eingestellt, die mit der Probenahme des Bildes in voller Auflösung kompatibel sind. Die resultierenden 4D-Datensätze sind laut, können aber durch Dekonvolution geglättet werden. Selbst bei qualitativ hochwertigen Daten ist die Analysephase eine Herausforderung, da intrazelluläre Strukturen oft zahlreich, heterogen und mobil sind. Um dieser Notwendigkeit gerecht zu werden, wurden benutzerdefinierte ImageJ-Plugins in Array-4D-Daten auf einem Computerbildschirm geschrieben, Strukturen von Interesse identifiziert, die Daten bearbeitet, um einzelne Strukturen zu isolieren, die Fluoreszenzzeitkurse zu quantifizieren und Filme der projizierten Z-Stacks zu machen. 4D-Filme sind besonders nützlich, um stabile Kompartimente von transienten Fächern zu unterscheiden, die sich durch Reifung umdrehen. Solche Filme können auch verwendet werden, um Ereignisse wie Die Kompartimentfusion zu charakterisieren und die Auswirkungen bestimmter Mutationen oder anderer Störungen zu testen.

Das hier gegebene Beispiel dokumentiert und quantifiziert die Reifung von zwei Hefe Golgi Zisternen, wie durch zweifarbige 4D konfokale Mikroskopie3visualisiert. Eine Hefezelle enthält in der Größenordnung von 10-15 Golgi-Zisternen, von denen jede über einen Zeitverlauf von ca. 2-4 min reift. Die Reifung kann durch Taggen des frühen Golgi-Markers Vrg4 mit GFP und durch Taggen des späten Golgi-Markers Sec7 mit einem roten Fluoreszenz-Marker sec7 visualisiert w...

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4D Microscopy of Yeast

4D-Mikroskopie der Hefe

Dieses Protokoll beschreibt die Analyse von fluoreszierend markierten intrazellulären Kompartimenten in angehender Hefe mittels mehrfarbiger 4D-Konfokalmikroskopie (Zeitraffer-3D). Die bildgebenden Parameter werden ausgewählt, um geeignete Signale zu erfassen und gleichzeitig Photoschäden zu begrenzen. Benutzerdefinierte ImageJ-Plugins ermöglichen es, beschriftete Strukturen nachzuverfolgen und quantitativ zu analysieren.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Diese Methode verfolgt Strukturen in Hefezellen in drei Dimensionen über viele Minuten, so dass wir die Dynamik von intrazellulären Organellen und Kompartimenten untersuchen können. 4D-Bildgebung stellt sicher, dass wir zuverlässige Schlussfolgerungen über die intrazelluläre Dynamik ziehen können, insbesondere für Strukturen oder Marker, die vorübergehend sein können. Demonstriert wird das Verfahren von Natalie Johnson, einer Postdoc aus meinem Labor.Beginnen Sie mit dem Anbau einer Übernachtkultur des Hefestamms von Interesse in fünf Milliliter nicht fluoreszierenden synthetischen definiert, oder NSD, medium, in einem 15 Milliliter verwirrten Kolben mit guter Belüftung, bei 23 Grad Celsius. Drei bis vier Stunden vor der Analyse verdünnen Sie die logarithmische Phasenhefekultur in frischem NSD-Medium, so dass die endgültige optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD600 zum Zeitpunkt der Bildgebung 0,5 bis 0,8 betragen wird. Mindestens eine Stunde, bevor die Kultur fertig ist, zentrifugieren Sie ein Aliquot von zwei Milligramm pro Milliliter Concanavalin Eine Lösung für fünf Minuten bei voller Geschwindigkeit, um partikelförmige Partikel zu pellet, und fügen Sie 250 Mikroliter des Überstandes in eine saubere 35 Millimeter Glasbodenmikroskopieschale.Nach 15 Minuten die Schale zwei- bis dreimal mit zwei Millilitern destilliertem Wasser pro Wäsche waschen und 250 Mikroliter der Hefekultur nach dem Trocknen in die Concanavalin A-beschichtete Schale geben. Warten Sie 10 Minuten, bis die Zellen haften, bevor Sie die Schale zwei bis drei Mal später mit zwei Millilitern frischem NSD-Medium sanft waschen. Dann bedecken Sie die Zellen mit zwei Millilitern frischen NSD.Um die Hefezellen abzubilden, wählen Sie eine 63-fache Öl-Tauchlinse mit einer numerischen Blende von mindestens 1,4 auf einem konfokalen Lichtmikroskop aus. Hier kann anstelle einer 63X Objektivlinse auch ein 100-Fachobjektiv verwendet werden. Dann legen Sie die Schale auf die Objektivlinse, mit Tauchöl gefleckt.Wählen Sie im Dropdown-Menü der Registerkarte Erfassungsmodus xyzt aus. Formatieren Sie unter der Registerkarte XY die Rahmengröße auf 256 Breite und 128 Höhe. Verwenden Sie die maximale Scangeschwindigkeit, die in der Regel in der Größenordnung von acht Kilohertz liegt.Aktivieren Sie das bidirektionale X-Scannen, sofern er verfügbar ist, und passen Sie den Zoomfaktor auf neun an, was zu einer Pixelgröße von etwa 80 Nanometern führt. Wenn ein 100-Fach-Objektiv verwendet wird, passen Sie den Zoomfaktor entsprechend an, um eine Pixelgröße von etwa 80 Nanometern beizubehalten. Legen Sie dann die Zeilenakkumulation auf vier oder sechs fest.Stellen Sie das Loch auf 1.2 Airy-Einheiten ein, und schalten Sie den Weißlichtlaser ein, falls verfügbar. Legen Sie dann die Anregungswellenlänge und die prozentuale Laserleistung für jeden Fluoreszenzkanal fest. Aktivieren Sie, falls verfügbar, die Verwendung des Photonenzählmodus unter der Registerkarte Konfiguration, indem Sie die maximale Integrationszeit deaktivieren.Weisen Sie für jeden Fluoreszenzkanal einen Hochempfindlichkeitsdetektor zu, legen Sie den Emissionswellenlängenbereich fest und aktivieren Sie den Photonenzählmodus, sofern verfügbar. Stellen Sie das Zeitgating-Fenster für jeden Fluoreszenzkanal auf 0,6 bis 10 Nanosekunden, um zu vermeiden, dass reflektiertes Licht von der Glasschale erfasst wird. Aktivieren Sie als Nächstes die Lichtfeldabbildung, und wählen Sie einen Detektor mit geringer Empfindlichkeit für die Datenerfassung aus.Schalten Sie den Live-Bildgebungsmodus ein, und schalten Sie die Verstärkung im hellen Feldkanal aus, bis die Zellen deutlich sichtbar sind. Wenn Sie sich im Photonenzählmodus befinden, ändern Sie den Bereich der Grauwerte von manuell in automatisch, um das Fluoreszenzsignal anzuzeigen. Legen Sie den Z-Stack so fest, dass das gesamte Volumen der Hefezellen ababgebildet wird, und geben Sie die Richtung der Bildgebung so an, dass sich nach unten in Richtung des Abdeckungsschlupfes bewegt.Stellen Sie das Z-Schritt-Intervall auf 0,25 bis 0,35 Mikrometer ein, um etwa 20 bis 25 optische Abschnitte pro Z-Stack zu erhalten, und schalten Sie den Galvo-Flow ein, sofern er verfügbar ist. Legen Sie für einen typischen Film das Zeitintervall zwischen Z-Stacks auf zwei Sekunden fest, und legen Sie die Filmdauer auf fünf bis zehn Minuten fest. Speichern Sie dann den Film als LIF-Datei.Starten Sie für die Filmdekonvolution ein entsprechendes Dekonvolution-Softwareprogramm, das den klassischen Algorithmus zur Schätzung der maximalen Wahrscheinlichkeit verwendet, und öffnen Sie die Datenreihe. Wählen Sie den Dekonvolution-Assistenten und den Parameter-Editor aus, um zu bestätigen, dass die Bildparameter erkannt und korrekt angezeigt werden. Ändern Sie den Wert des einbettenden mittleren Brechungsindex in 1,4, um das Hefezytoplasma anzunähern.Verwenden Sie dann den Editor, um die Position des Deckzettels zu schätzen. Wählen Sie Alle überprüft festlegen aus, und klicken Sie auf Akzeptieren, und wählen Sie Den Assistenten eingeben aus. Klicken Sie auf den nächsten Pfeil, um die Auswahl der Punktstreufunktion und die Vorverarbeitungsphasen zu umgehen, und fahren Sie durch den Dekonvolution-Assistenten für jeden Fluoreszenzkanal.Wählen Sie die logarithmische vertikale Mapping-Funktion berechnen aus, und überprüfen Sie das Profil für die Rohdatenfluoreszenzintensität. Legen Sie das Handbuch als Modus für die Hintergrundschätzung fest, geben Sie einen Hintergrundwert ein, und klicken Sie auf Akzeptieren. Lassen Sie den maximalen Iterationswert bei 40 und geben Sie ein geschätztes Signal-Rausch-Verhältnis ein.Deaktivieren Sie dann die Bleichkorrektur, und klicken Sie auf Deconvolve. Wählen Sie Akzeptieren zum nächsten Kanal im Dekonvolution-Ergebnisfenster, wenn das Rauschen ausreichend entfernt wird, ohne die echte Fluoreszenz aus den dim Strukturen zu entfernen. Sobald alle fluoreszierenden Kanäle zufriedenstellend dekonvolviert wurden, klicken Sie auf Alle fertig und ordnen Sie den roten Kanal zuerst an, gefolgt von den grünen, blauen und hellen Feldkanälen, für die nachfolgende Bearbeitung in ImageJ.Speichern Sie dann die Bildsequenz als Acht-Bit-TIF-Datei und wählen Sie eine Datei pro Kanal und Kontrastdehnung als Konvertierungsmodus aus. Importieren Sie zur Bleichkorrektur die dekonvolveden Bildsequenzen in ImageJ, und klicken Sie auf Image, Hyperstacks und Stack to Hyperstack, um die Bilder in einen Hyperstack zu konvertieren. Wählen Sie xyzct aus dem Dropdown-Menü aus, und geben Sie die Anzahl der Kanäle, Z-Stack-Slices und Zeitrahmen ein.Um die Fluoreszenzkanäle für das Photobleichen zu korrigieren, wählen Sie Bild, Farbe, Split-Kanäle und für fluoreszierende Kanäle Plugins, EMBLtools, Bleach Correction und Exponential Fit aus. Wählen Sie dann Bild-, Farb- und Mergekanäle aus, um die hellen Feld- und Bleichfluoreszenzkanäle zu einem Hyperstack zusammenzuführen und den dekonvolveden und bleichkorrigierten Hyperstack für die nachfolgende Filmgenerierung und -bearbeitung als acht Bit TIF-Datei zu speichern. Um den dekonvolved und bleich korrigierten Datensatz in eine skalierte Montage zu konvertieren, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Make Montage Series aus, und wählen Sie den entsprechenden Acht-Bit-Hyperstack aus.Klicken Sie auf Öffnen und OK, um zu akzeptieren, dass alle Slices zum Erstellen der Montage verwendet werden, und klicken Sie erneut auf OK, um den vorgeschlagenen Skalierungsfaktorwert zu akzeptieren. Speichern Sie die Originalmontage als acht Bit TIF-Datei und wählen Sie Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack und OK, um einen 4D-Hyperstack aus der ursprünglichen Montage zu erstellen, der alle Zeitrahmen enthält. Um den ursprünglichen durchschnittlich projizierten Film zu generieren, wählen Sie zunächst Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack und OK aus, um die ZProjection-Standardparameter zu akzeptieren.Speichern Sie den durchschnittlichprojizierten Film als achtbitige TIF-Datei, und überprüfen Sie den Film, um einzelne Strukturen zu identifizieren, die für die Dauer ihrer Beschriftungsperiode nachverfolgt werden können. Das Identifizieren einer Struktur, die für die Dauer des Films zuverlässig nachverfolgt werden kann, und das Isolieren dieser Struktur für die Analyse sind die wichtigsten Schritte des Verfahrens. Dann folgen Sie den Anweisungen im Plugin-Benutzerhandbuch, um Strukturen von Interesse zu isolieren, indem Sie die Montage bearbeiten.Erstellen Sie einen 4D-Hyperstack aus der bearbeiteten Montage für den Zeitraum einschließlich der Strukturen von Interesse, und speichern Sie den bearbeiteten Hyperstack. Um die Fluoreszenzintensität im Zeitverlauf für die isolierte Struktur im bearbeiteten 4D-Hyperstack zu quantifizieren, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Bearbeiteten Film analysieren aus, geben Sie das Zeitintervall zwischen Z-Stacks ein, und klicken Sie auf OK. Um einen letzten Film der isolierten Struktur zu erstellen, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Project Hyperstack aus, geben Sie die eingeschlossenen Z-Stack-Slices an, wählen Sie Die mittlere Intensität als Projektionstyp aus, und klicken Sie auf OK. Um einen 4D-Hyperstack mit den Originaldaten über die bearbeiteten Daten zu erstellen, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins, Merge Two Hyperstacks und Place first above second aus. Um einen Film aus dem 4D-Hyperstack mit den Originaldaten über die bearbeiteten Daten zu generieren, wählen Sie Plugins, IJ_Plugins und Project Hyperstack aus, geben Sie die eingeschlossenen Z-Stack-Slices an, wählen Sie Als Projektionstyp die durchschnittliche Intensität aus, und klicken Sie auf OK. Hier kann der erste Frame einer Z-Stack-Projektion von Rohdaten mit den gleichen dekonvolveden und bleichkorrigierten Daten verglichen werden.Diese Rahmen aus dem gleichen dekonvolved und bleich korrigierten Film zeigen zwei Cistern, die analysiert wurden, die zuerst mit dem grünen Vanadate-Resistenz-Glykosylierungsprotein 4 oder Vrg4-Marker und später mit dem roten Secretory 7 oder Sec7 GenTransport Protein Marker etikettieren. Diese Montage, die aus einem dekonvolveden und bleichkorrigierten Hyperstack erstellt wurde, zeigt alle optischen Abschnitte zu einem einzigen Zeitpunkt vor und nach der Bearbeitung, um die Isolierung des Signals von einer der gewählten Cisternae zu ermöglichen. In dieser Abbildung werden mehrere Bilder aus dem letzten Film der projizierten Z-Stacks mit den Originalprojektionen am oberen Rand der Figur und bearbeiteten Projektionen unten gezeigt.Die Quantifizierung der grünen und roten Fluoreszenzsignale der gewählten Golgi-Zisternen zeigt, dass der grüne Vrg4-Marker etwa 80 Sekunden ankommt und anhält, danach kommt der rote Sec7-Marker an und bleibt etwa 60 Sekunden lang bestehen, mit einer kurzen Überlappung zwischen den beiden Markern. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, Strukturen zu identifizieren, die während ihres gesamten Lebens eindeutig nachverfolgt werden können. Die gleiche Art der Analyse kann nach einer Mutation oder einer anderen Art spezifischer Störung durchgeführt werden.Diese Technik hat den Weg für das Studium des dynamischen Verhaltens von Golgi-Zisternen und endoplasmatischen Retikulum-Ausgangsstellen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem geebnet.

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