Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי NIH מענק R01 GM104010. תודה על הסיוע עם מיקרוסקופ הזריחה כדי Vytas Bindokas וכריסטין Labno במתקן ליבה מיקרוסקופ משולב, אשר נתמך על ידי מרכז הסרטן NIH ממומן תמיכה גרנט P30 CA014599.

1. הכנה
<ol><li>הפוך מינימלי לא פלורסנט NSD בינונית2. היעדר הריבופלאווין צפוי להפחית את הרקע הירוק מתאים לקרינה פלואורסצנטית ירוקה ו-phototoxicity משויכת.</li>
	<li>לגדל את מאמץ שמרים לילה ב ~ 23 ° צ' לשלב לוגריתמי ב 5 mL NSD ב 50 mL מבולבל בקבוקון עם האנטנה טוב. כ 3-4 h לפני הניתוח, לדלל את התרבות שמרים ב NSD טריי...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

4d הדמיה קונפוקלית וקד של אורגלים שמרים דורש כוונון זהיר של פרמטרים מרובים. הדאגה העיקרית היא פוטוהלהלבנת ו פוטורעילות. סרט 4D אופייני כרוך באיסוף אלפי מקטעים אופטיים, כך שתאורת הלייזר חייבת להישמר כנמוכה ככל האפשר. התגים של חלבון פלואורסצנטי טנדם ניתן להשתמש כדי להגביר את האות מבלי להגדיל ...

התאים של המערכת הendomembrane הם בשטף קבוע, ואת האפיון המלא שלהם דורש הדמיה תא חי. מתוארים כאן הוא פרוטוקול המעסיק 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופיה כדי להמחיש באופן מתויג בתאי בתים של הניצנים. השיטה פותחה כדי לעקוב אחר הדינמיקה של מתאי הפרשה בפיצ'יה פסטורלה וסכומיסס סרביסיאה1,2,3. פרוטוקול זה מתמקד ב -S. cerevisiae, אשר יש golgi שאינו מוערם שבו cisternae הפרט הם לפתירה4. הארגון החריג Golgi ב -S. cerevisiae ס איפשר את ההפגנה על ידי מיקרוסקופ 4d כי golgi cisterna בתחילה תוויות עם תושב מוקדם בשנת golgi, ולאחר מכן מאבד את החלבונים האלה תוך רכישת תושב מאוחר golgi חלבונים3 ,5. מעבר זה יכול להיות דמיינו על ידי יצירת זן שבו חלבון Golgi מוקדם Vrg4 מתויג עם GFP בעוד חלבון Golgi מאוחר Sec7 מתויג עם חלבון פלורסנט monomeric אדום. כאשר cisternae בודדים מסומנים, התבגרות נצפתה כהמרה ירוק-אדום3. סוג זה של ניתוח יכול לספק מידע חשוב אודות לוקליזציה של חלבון וזהות תא. לדוגמה, שני חלבונים עם זמני הגעה ויציאה מעט נגדיים עשויים לעתים להיראות כתוויות לתאים שונים בתמונות סטטיות, אך ניתן לראות בסרטים 4d כדי לתייג את אותו תא בנקודות זמן שונות6,7 . לפיכך, מיקרוסקופ 4D חושף תופעות שלא היו נראות באופן אחר.
מיקרוסקופ 4D אינפורמטיבי של תאי שמרים ניתן להשיג עם הליכים המתאימים וציוד2. במידת האפשר, התיוג חלבון פלורסנט מבוצע על ידי החלפת גנים8 כדי למנוע חפצים ביטוי יתר. כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות דינמי מאוד, 4D הדמיה נדרשת כדי להבטיח כי מבנה מסומנים מהימן לאורך זמן. הפרוטוקול המתואר כאן מעסיק מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לייזר המצויד בגלאי רגישות גבוהה. עם התקן זה, את כל הנפח של התא של S. cerevisiae ס יכול להיות בתמונה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית בערך כל 1-3 s, עם 2 מרווחי s להיות אופייני. נתונים ניתן לאסוף עד 5-15 דקות בהתאם לצפיפות התיוג של fluorophores ואת המאפיינים שלהם פוטופיסיים. המשוכה העיקרית היא למזער את הלבנת התמונות. למטרה זו, עוצמות הלייזר נשמרות נמוכות ככל האפשר, מהירות הסריקה הקונפוקלית מוגדלת, והפרמטרים האופטיים מוגדרים לתמונה במגבלת נייקוויסט כדי ללכוד את המידע הרלוונטי תוך הימנעות מחשיפה מוגזמת באור. הגדרות אלה צפויים גם להקל על הרעילות, גורם התעלמו לעתים קרובות במהלך הדמיה תא חי9,10,11. הנתונים הרועשים הנובעים מכך מעובדים עם תיקון אקונומיקה והאלגוריתמים לפירוק כדי להקל על הכמת של עוצמות הזריחה.
גם עם איכות גבוהה בסרטים 4D, הניתוח הוא מסובך כי בתאי שמרים נוטים להיות רבים, הטרוגנית, וניידים. בשל המגבלות הפנימיות של המיקרוסקופיה וההגדרות הלא-אופטימליות הנדרשות עבור הדמיה ממושכת של 4D, מבני פלורסנט הסמוכים זה לזה קשה לפתרון. בעיה זו ניתן להקיף על-ידי התמקדות במספר קטן של מבני פלורסנט כי נשארים מחדש באופן מבחינה אופטית למשך תקופת תיוג, עם ההנחה כי מבנים אלה מייצגים את האוכלוסיה כולה של התווית תאים. תאים פלורסנט שיכולים להיות מסומנים באופן מהימן מזוהים על ידי צפייה בסרטים של ה-Z-ערימות מוקרן ועל ידי יצירת סדרה של ונטאז שבו הסעיפים האופטיים עבור כל נקודת זמן מסודר על מסך המחשב. ניתוח זה משתמש בתוספים מותאמים אישית של ImageJ12 , המאפשרים מבנה פרטני להיות מאותר בבידוד.
ניירות השיטות האחרונות כיסו את השימוש של חלבונים פלורסנט ב-13 שמרים, כמו גם את התיאוריה והתרגול של הדמיה מיקוד 4d של תאים שמרים2. פרוטוקול זה מתמקד בהיבטים המעשיים המרכזיים של ניסוי הדמיה 4-d. הוא כולל כמה שיפורים להליכים שתוארו בעבר, כמו גם גירסאות מעודכנות של הקוד והתיעוד של התוסף ImageJ. הדוגמה המוצגת מתמקדת בדינמיקה של Golgi, אך פרוטוקול זה מתאים באותה מידה ליצירת הדמיה של תאי שמרים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

המטרה של פרוטוקול זה היא לאפיין את כיצד תאים ממברנות טופס ולשנות בתאים חיים של שמרים לגבש. תאים תאיים רבים שמרים הם דינמיים, והבנה מלאה של המאפיינים שלהם דורש הדמיה בזמן. Multi-צבעים 4D מיקרוסקופ מיקרוסקופית פלואורסצנטית היא שיטה רבת עוצמה למעקב אחר ההתנהגות והרכב של תא תאיים על סולם זמן של 5-15 דקות. ניתוח קפדני של דינמיקה תא דורש לכידת אלפי אופטי סעיפים. כדי להשיג מטרה זו, photobleaching לבנת ו פוטורעילות הם ממוזער על ידי סריקת במהירות בכוח לייזר נמוך מאוד, ואת מידות פיקסל ומרווחי Z-step מוגדרים לערכים הגדולים ביותר התואמים לדגימת התמונה ברזולוציה מלאה. ערכות הנתונים המתקבלות מוסדרות, רועשות, אך ניתן לחלק אותן על-ידי פירוק. גם עם נתונים באיכות גבוהה, שלב הניתוח הוא מאתגר כי מבנים תאיים הם לעתים קרובות רבים, הטרוגנית, וניידים. כדי לענות על צורך זה, התוספים ImageJ מותאם אישית נכתבו לתוך מערך 4D נתונים על מסך המחשב, לזהות מבנים של עניין, לערוך את הנתונים כדי לבודד מבנים בודדים, לכמת את קורסי הזמן הזריחה, ולעשות סרטים של ה-Z מוקרן הערימות. 4D סרטים שימושיים במיוחד כדי להבחין תאים יציבים מתאים ארעי כי להפוך על ידי התבגרות. סרטים כאלה יכולים לשמש גם כדי לאפיין אירועים כגון היתוך תא, כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות ספציפיות או רטבאליות אחרים.

הדוגמה שניתנה כאן מסמכים וככמת את ההבשלה של שתי Golgi cisternae שמרים כפי שדמיינו על ידי המיקרוסקופיה 4D מיקרוסקופית הצבע הכפולה3. תא שמרים מכיל על הסדר של 10-15 Golgi cisternae, שכל אחד מהם מתבגר במשך זמן של כ 2-4 דקות. התבגרות יכול להיות מדמיין על ידי תיוג מוקדם מסמן Golgi Vrg4 עם GFP ...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D מיקרוסקופ של שמרים

פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של מסומן בתוך התאים התאיים בתוך שמרים באמצעות מרובת צבעים 4d (זמן הפקיעה 3d) קונפוקלית מיקרוסקופ. הפרמטרים הדמיה נבחרים כדי ללכוד אותות הולמים תוך הגבלת photodamage. תוספים מותאמים אישית של ImageJ מאפשרים מבנים עם תוויות למעקב וניתוח כימות.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

שיטה זו עוקבת אחר מבנים בתאי שמרים בשלושה ממדים לאורך דקות רבות, ומאפשרת לנו לחקור את הדינמיקה של אורגנים ותאים תאיים. הדמיה 4D מבטיחה כי אנו יכולים להסיק מסקנות אמינות על דינמיקה תאית, במיוחד עבור מבנים או סמנים שעשויים להיות ארעיים. הפגנת ההליך תהיה נטלי ג'ונסון, פוסט-דוק מהמעבדה שלי.התחל על ידי גידול תרבות לילה של זן שמרים של עניין חמישה מיליליטר של סינתטי שאינו פלואורסצנטי מוגדר, או NSD, בינוני, בבקבוק מבולבל 15 מיליליטר עם aeration טוב, ב 23 מעלות צלזיוס. שלוש עד ארבע שעות לפני הניתוח, לדלל את תרבות שמרים שלב לוגריתמי במדיום NSD טרי, כך הצפיפות האופטית הסופית ב 600 ננומטר, או OD600, יהיה 0.5 כדי 0.8 בזמן ההדמיה. לפחות שעה אחת לפני שהתרבות מוכנה, צנטריפוגה aliquot של שני מיליגרם למיליליטר קונקבאלין פתרון במשך חמש דקות במלוא המהירות, כדי גלולה כל חלקיקים, ולהוסיף 250 microliters של supernatant לתוך צלחת מיקרוסקופיה תחתית זכוכית 35 מילימטר נקי.לאחר 15 דקות, לשטוף את המנה פעמיים עד שלוש פעמים עם שני מיליליטר של מים מזוקקים לכל לשטוף, הוספת 250 microliters של תרבות השמרים לצלחת מצופה Concanavalin A לאחר שהוא מיובש. המתן 10 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק, לפני שטיפת המנה בעדינות פעמיים עד שלוש פעמים נוספות עם שני מיליליטר של מדיום NSD טרי. ואז לכסות את התאים עם שני מיליליטר של NSD טרי.כדי לדמיין את תאי השמרים, בחר עדשת טבילת שמן 63X עם צמצם מספרי של לפחות 1.4 במיקרוסקופ אור קונפוקלי. כאן, עדשה אובייקטיבית 100X ניתן להשתמש גם במקום עדשה אובייקטיבית 63X. לאחר מכן, מניחים את המנה על העדשה האובייקטיבית, הבחין בשמן טבילה.מהתפריט הנפתח של הכרטיסיה מצב רכישה, בחר xyzt. תחת הכרטיסיה XY, עצב את גודל המסגרת לרוחב 256 בגובה 128. השתמש במהירות הסריקה המרבית, שהיא בדרך כלל בסדר גודל של שמונה קילוהרץ.הפעל סריקת X דו-כיוונית אם היא זמינה, והתאם את גורם הזום לתשע, מה שיהפוך לגודל פיקסל של כ- 80 ננומטר. אם נעשה שימוש במטרה 100X, התאימו את גורם הזום בהתאם לשמירה על גודל פיקסל של כ-80 ננומטר. לאחר מכן הגדר את הצטברות הקו לארבעה או שישה.הגדר את חור הסיכה ל- 1.2 יחידות אוורימיות והדליק את לייזר האור הלבן, אם הוא זמין. לאחר מכן הגדר את אורך גל העירור ואת כוח הלייזר אחוז עבור כל ערוץ פלואורסצנטי. אם אפשרות זו זמינה, אפשר את השימוש במצב ספירת פוטון תחת לשונית התצורה על-ידי ביטול הבחירה בזמן שילוב מרבי.עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, הקצה גלאי רגישות גבוהה, הגדר את טווח אורך הגל של הפליטה והפעיל מצב ספירת פוטון, אם הוא זמין. הגדר את חלון gating הזמן ל 0.6 עד 10 ננו שניות עבור כל ערוץ פלואורסצנטי, כדי למנוע לכידת אור משתקף מצלחת הזכוכית. לאחר מכן, הפעל הדמיית שדה בהיר ובחר גלאי רגישות נמוכה עבור איסוף הנתונים.הפעל מצב דימות חי והגדל את הרווח בערוץ השדה הבהיר עד שהתאים יהיו גלויים בבירור. אם במצב ספירת פוטון, שנה את טווח הערכים האפורים מכדור ידני לאוטומטי כדי להציג את אות הפלואורסצנטי. הגדר את מחסנית Z כדי לדמיין את כל נפח תאי השמרים ולציין את הכיווניות של ההדמיה כך למטה נע לכיוון החלקת המכסה.הגדר את מרווח הזמן של שלב Z ל- 0.25 עד 0.35 מיקרומטר כדי להשיג כ- 20 עד 25 מקטעים אופטיים לכל מחסנית Z והפעיל את זרימת Galvo אם היא זמינה. עבור סרט טיפוסי, הגדר את מרווח הזמן בין ערימות Z לשתי שניות והגדר את משך הסרט לחמש עד עשר דקות. לאחר מכן שמור את הסרט כקובץ LIF.עבור פירוק סרטים, הפעל תוכנה מתאימה לפירוק המשתמשת באלגוריתם הערכת הסבירות המרבית הקלאסי, ופתח את סידרת הנתונים. בחר אשף פירוק ועורך פרמטרים כדי לאשר כי פרמטרי הדימות מזוהים ומוצגים כראוי. שנה את ערך מדד השחזור הבינוני המוטבע ל- 1.4 כדי להעריך את ציטופלסמת השמרים.לאחר מכן השתמש בעורך כדי להעריך את מיקום עמוד השער. בחר הגדר את כל המאומתים ולחץ על קבל ובחר הזן אשף. לחץ על החץ הבא כדי לעקוף את בחירת פונקציית כפולת הנקודות ואת שלבי החיתוך שלפני העיבוד, והמשך דרך אשף האצלה עבור כל ערוץ פלואורסצנטיות.בחר את פונקציית המיפוי האנכי הלוגאריתמית של המיפוי ובדוק את פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות של הנתונים הגולמיים. הגדר ידנית כ למצב להערכת הרקע, הזן ערך רקע ולחץ על קבל. השאר את ערך האיטראציות המרבי על 40 והזן אות משוער ליחס רעש.לאחר מכן כבו את תיקון האקונומיקה ולחצו על 'Deconvolve'. בחר קבל לערוץ הבא בחלון תוצאת deconvolution, אם הרעש מוסר מספיק מבלי לבטל את הפלואורסצנטיות המקורית מהמבנים העמום. לאחר שכל הערוצים הפלואורסצנטיים נותקו באופן משביע רצון, לחץ על הכל וסדר תחילה את הערוץ האדום, ואחריו ערוצי השדה הירוק, הכחול והבהיר, לעריכה הבאה ב- ImageJ.לאחר מכן שמרו את רצף התמונה כקובץ TIF של שמונה סיביות ובחרו קובץ אחד לערוץ והניגודיות נמתחת במצב המרה. לתיקון אקונומיקה, יבאו את רצפי התמונה המפותלים ל-ImageJ ולחצו על 'תמונה', 'היפרסטאק' ו'מחסנית' ל'היפרסטאק' כדי להמיר את התמונות להגזמה. בחרו xyzct מהתפריט הנפתח והזינו את מספר הערוצים, פרוסות ערימת Z ומסגרת הזמן.לתיקון ערוצי הפלואורסצנטיות להלבנת תמונות, בחרו 'תמונה', 'צבע', 'ערוצי פיצול' ובערוצי פלואורסצנט, בחרו 'תוספים', 'EMBLtools', 'תיקון אקונומיקה' ו'התאמה מעריכית'. לאחר מכן בחרו 'תמונה', 'צבע' ו'ערוצי מיזוג' כדי למזג את השדה הבהיר ואת ערוצי הפלואורסצנטיות מתוקנים להיפר-סטאק, ולשמור את ההיפר-סטאק המפותל והמכוולב עבור יצירת הסרטים והעריכה הבאים כקובץ TIF של שמונה סיביות. כדי להמיר את ערכת הנתונים המפותלת והמתוקנת למונטאז' מוקף, בחר תוספים, IJ_Plugins והפוך את סדרת מונטאז', ובחר את ההיפר-סטאק הרלוונטי של שמונה סיביות.לחץ על פתח וסדר כדי לקבל את העובדה שכל הפרוסות ישמשו ליצירת המונטאז', ולחץ שוב על אישור כדי לקבל את ערך גורם קנה המידה המוצע. שמור את מונטאז' המקורי כקובץ TIF של שמונה סיביות ובחר תוספים, IJ_Plugins, סדרת מונטאז ' ל- Hyperstack ו- OK, כדי ליצור היפרסטאק 4D מהמונטאז ' המקורי הכולל את כל לוחות הזמנים. כדי ליצור את הסרט המוקרן הממוצע המקורי, בחר תחילה תוספים, IJ_Plugins, Project Hyperstack ו- OK, כדי לקבל את פרמטרי ברירת המחדל של ZProjection.שמור את הסרט המוקרן הממוצע כקובץ TIF של שמונה סיביות ובדוק את הסרט כדי לזהות מבנים בודדים שניתן לעקוב אחריהם למשך תקופת התיוג שלהם. זיהוי מבנה שניתן לעקוב אחריו באופן אמין למשך הסרט, ולבודד מבנה זה לצורך ניתוח, הם השלבים הקריטיים ביותר של ההליך. לאחר מכן בצע את ההוראות במדריך למשתמש תוסף, כדי לבודד מבנים של עניין על ידי עריכת montage.צור היפרסטאק 4D מהמונטאז' הערוך לתקופה הכוללת את מבני העניין, ושמור את ההיפר-סטאק הערוך. כדי לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן עבור המבנה המבודד בהגזמה הדו-מימדית הערוכה, בחר תוספים, IJ_Plugins ונתח סרט ערוך, הזן את מרווח הזמן בין ערימות Z ולחץ על אישור. ליצירת סרט אחרון של המבנה המבודד, בחרו 'תוספים', 'IJ_Plugins' ו'היפרסטאק של פרוייקט', ציינו את פרוסות מחסנית Z שיש לכלול, בחרו 'עוצמה ממוצעת' כסוג ההקרנה ולחצו על הלחצן 'אשר'. כדי ליצור היפרסטאק 4D עם הנתונים המקוריים מעל הנתונים הערוכים, בחר תוספים, IJ_Plugins, מזג שני היפרסטאקים ומקם ראשון מעל השני. להפקת סרט מגזע ה-4D עם הנתונים המקוריים על הנתונים הערוכים, בחרו 'תוספים', 'IJ_Plugins' ו'היפרסטאק של פרוייקט', ציינו את פרוסות מחסנית Z שיש לכלול, בחרו 'עוצמה ממוצעת' כסוג ההקרנה ולחצו על הלחצן 'אשר'. כאן, ניתן להשוות את המסגרת הראשונה של הקרנת מחסנית Z של נתונים גולמיים לאותם נתונים מנופלים ונתונים מתוקנים מלבין.מסגרות אלה מאותו סרט מנומק ותיקון אקונומיקה להראות שני cisternae שנותחו, אשר תווית ראשונה עם חלבון גליקוזילציה עמידות ונדאט ירוק 4 או סמן Vrg4, ומאוחר יותר עם הפרשת אדום 7 או Sec7 סמן חלבון הובלת גנים. מונטאז' זה, שנוצר מהיפרסטאק מנומק ואקונומיקה מתוקן, מציג את כל החלקים האופטיים בנקודת זמן אחת לפני ואחרי העריכה, כדי לאפשר בידוד של האות מאחד מהמצוות שנבחרו. בנתון זה, מספר מסגרות מהסרט הסופי של ערימות Z המוקרנות מוצגות עם ההקרנות המקוריות בחלק העליון של הדמות והקרנות ערוכות בתחתית.כימות אותות הפלואורסצנט הירוקים והאדום מהססטרנה הגולגית שנבחרה מגלה כי סמן Vrg4 הירוק מגיע ונמשך כ-80 שניות, ולאחר מכן מגיע סמן ה-Sec7 האדום ונמשך כ-60 שניות, עם חפיפה קצרה בין שני הסמנים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזהות מבנים שניתן לעקוב אחריהם באופן חד משמעי לאורך כל חייהם. אותו סוג של ניתוח יכול להתבצע לאחר ביצוע מוטציה או סוג אחר של הפרעה ספציפית.טכניקה זו פתחה את הדרך לחקר ההתנהגות הדינמית של אתרי יציאה מרטיקוליום Golgi ו- endoplasmic באמצעות שמרים כמערכת מודל.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...