Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R01 GM104010. Grazie per l'assistenza con la microscopia a fluorescenza a Vytas Bindokas e Christine Labno presso l'Integrated Microscopy Core Facility, supportato dal Cancer Center Support Grant P30 CA30 CA30 CA30 CA30 CA30 CA30.

1. Preparazione
<ol><li>Rendere non fluorescente minimo NSD medium2. L'assenza di riboflavina dovrebbe ridurre la fluorescenza verde di fondo e la fototossicità associata.</li>
	<li>Far crescere il ceppo di lievito durante la notte a 23 gradi centigradi fino alla fase logaritmica in 5 mL NSD in una fiaschetta sconcertata da 50 mL con buona aerazione. Circa 3-4 h prima dell'analisi, diluire la coltura del lievito in NSD fresco in modo che l'ultimo OD600 sarà 0.5-0.8 al momento dell'imaging.</li>
...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

L'imaging confocale 4D degli organelli di lievito richiede un'attenta messa a punto di più parametri. La preoccupazione principale è il fotosbiancamento e la fototossicità. Un tipico filmato 4D prevede la raccolta di migliaia di sezioni ottiche, quindi l'illuminazione laser deve essere mantenuta il più bassa possibile. I tag proteici fluorescenti Tandem possono essere utilizzati per aumentare il segnale senza aumentare l'espressione della proteina marcata16,17</sup...

I compartimenti del sistema di endomembrana sono in costante flusso, e la loro caratterizzazione completa richiede l'imaging delle cellule vive. Descritto qui è un protocollo che impiega la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D) per visualizzare scomparti etichettati fluorescentmente in lieviti in erba. Il metodo è stato sviluppato per monitorare la dinamica dei compartimenti secretorici in Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Questo protocollo si concentra su S. cerevisiae, che ha un Golgi non impilato in cui le singole cisterne sono otticamente risolvibili4. L'insolita organizzazione Golgi a S. cerevisiae ha permesso la dimostrazione di microscopia 4D che una cisterna Golgi inizialmente etichetta con proteine Golgi precoci residenti, e poi perde quelle proteine mentre acquisisce proteine residenti tardo Golgi3 ,5. Questa transizione può essere visualizzata creando un ceppo in cui la proteina Predicità Golgi Vrg4 è etichettata con GFP mentre la proteina Sec7 tardo Golgi è etichettata con una proteina fluorescente rossa monomerica. Quando le singole cisterne vengono tracciate, la maturazione viene osservata come conversione da verde a rosso3. Questo tipo di analisi può fornire informazioni preziose sulla localizzazione delle proteine e sull'identità del compartimento. Ad esempio, due proteine con orari di arrivo e partenza leggermente sfalsati potrebbero talvolta sembrare etichettare scomparti diversi in immagini statiche, ma possono essere viste nei film 4D per etichettare lo stesso vano in punti temporali diversi6,7 . Così, la microscopia 4D rivela fenomeni che altrimenti non sarebbero evidenti.
La microscopia 4D informativa dei compartimenti lievito può essere ottenuta con procedure e attrezzature appropriate2. Quando possibile, l'etichettatura delle proteine fluorescenti viene eseguita mediante la sostituzione genica8 per evitare artefatti di sovraespressione. Poiché le strutture intracellulari sono spesso molto dinamiche, l'imaging 4D è necessario per garantire che una struttura venga tracciata in modo affidabile nel tempo. Il protocollo qui descritto utilizza un microscopio confocale a scansione laser dotato di rilevatori ad alta sensibilità. Con questo dispositivo, l'intero volume cellulare di S. cerevisiae può essere immaginato mediante microscopia confocale circa ogni 1-3 s, con intervalli di 2 s tipici. I dati possono essere raccolti fino a 5-15 min a seconda delle densità di etichettatura dei fluorofori e delle loro proprietà fotofisiche. L'ostacolo principale è quello di ridurre al minimo il fotosbiancamento. A tale scopo, le intensità laser vengono mantenute il più basse possibile, la velocità di scansione confocale viene massimizzata e i parametri ottici sono configurati per l'immagine al limite di Nyquist al fine di catturare le informazioni pertinenti evitando un'eccessiva esposizione alla luce. Queste impostazioni sono anche tenuti ad alleviare la fototossicità, un fattore che viene spesso trascurato durante l'imaging delle cellule vive9,10,11. I dati rumorosi risultanti vengono elaborati con la correzione della candeggina e algoritmi di deconvoluzione per facilitare la quantificazione delle intensità di fluorescenza.
Anche con film 4D di alta qualità, l'analisi è difficile perché i compartimenti di lievito tendono ad essere numerosi, eterogenei e mobili. A causa delle limitazioni intrinseche della microscopia confocale e delle impostazioni non ottimali necessarie per l'imaging 4D prolungato, le strutture fluorescenti che sono vicine tra loro sono difficili da risolvere. Questo problema può essere risolto concentrandosi sul piccolo numero di strutture fluorescenti che rimangono otticamente risolvibili per tutta la durata del periodo di etichettatura, partendo dal presupposto che tali strutture siano rappresentative dell'intera popolazione di persone etichettate Scomparti. I compartimenti fluorescenti che possono essere tracciati in modo affidabile sono identificati visualizzando filmati di stack di z proiettati e creando una serie di montaggi in cui le sezioni ottiche per ogni punto temporale sono schierate sullo schermo di un computer. Questa analisi impiega plugin personalizzati ImageJ12, che permettono di tracciare una struttura individuale in isolamento.
Recenti studi di metodi riguardavano l'uso di proteine fluorescenti nel lievito13, nonché la teoria e la pratica dell'imaging confocale 4D delle cellule di lievito2. Questo protocollo si concentra sugli aspetti pratici chiave di un esperimento di imaging 4D. Include alcuni miglioramenti alle procedure descritte in precedenza, nonché le versioni aggiornate del codice e della documentazione del plug-in ImageJ. L'esempio mostrato si concentra sulla dinamica di Golgi, ma questo protocollo è ugualmente adatto per l'imaging di altri compartimenti di lievito.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare come i compartimenti della membrana si formano e si trasformano in cellule vive di lievito in erba. Molti compartimenti intracellulari nel lievito sono dinamici e una piena comprensione delle loro proprietà richiede l'imaging time-lapse. La microscopia a fluorescenza confocale 4D multicolore 4D è un metodo potente per monitorare il comportamento e la composizione di un compartimento intracellulare su una scala temporale di 5-15 min. L'analisi rigorosa della dinamica del compartimento richiede la cattura di migliaia di Sezioni. Per raggiungere questo obiettivo, il fotosbiancamento e la fototossicità vengono ridotti al minimo mediante la scansione rapida a bassissima potenza laser, e le dimensioni dei pixel e gli intervalli di passo z vengono impostati sui valori più grandi compatibili con il campionamento dell'immagine a piena risoluzione. I set di dati 4D risultanti sono rumorosi, ma possono essere levigati dalla deconvoluzione. Anche con dati di alta qualità, la fase di analisi è impegnativa perché le strutture intracellulari sono spesso numerose, eterogenee e mobili. Per soddisfare questa esigenza, i plugin ImageJ personalizzati sono stati scritti per mettere in rete dati 4D sullo schermo di un computer, identificare le strutture di interesse, modificare i dati per isolare le singole strutture, quantificare i corsi temporali di fluorescenza e fare filmati degli stack di z proiettati. I film 4D sono particolarmente utili per distinguere i compartimenti stabili dai compartimenti transitori che girano per maturazione. Tali filmati possono anche essere utilizzati per caratterizzare eventi come la fusione dei compartimenti e per testare gli effetti di mutazioni specifiche o altre perturbazioni.

L'esempio qui riportato documenta e quantifica la maturazione di due lieviti Golgi cisterne come visualizzato dalla microscopia confocale 4D a doppio colore3. Una cella di lievito contiene nell'ordine di 10-15 Cisternae Golgi, ognuna delle quali matura in un corso temporale di circa 2-4 min. La maturazione può essere visualizzata etichettando il marcatore Golgi Vrg4 con GFP e etichettando il tardo marcatore Golgi Sec7 con un fluorescente rosso proteine come mCherr...

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4D Microscopy of Yeast

Microscopia 4D del lievito

Questo protocollo descrive l'analisi dei compartimenti intracellulari etichettati fluorescentmente in lievito in erba utilizzando la microscopia confocale 4D (time-lapse 3D). I parametri di imaging vengono scelti per catturare segnali adeguati limitando i fotodanni. I plug-in Custom ImageJ consentono di tenere traccia delle strutture etichettate e di analizzarle quantitativamente.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Questo metodo tiene traccia delle strutture nelle cellule di lievito in tre dimensioni in molti minuti, permettendoci di studiare la dinamica degli organelli e compartimenti intracellulari. L'imaging 4D ci consente di trarre conclusioni affidabili sulla dinamica intracellulare, in particolare per strutture o marcatori che possono essere transitori. A dimostrare la procedura sarà Natalie Johnson, una postdoc del mio laboratorio.Inizia coltivando una coltura notturna del ceppo di lievito di interesse in cinque millilitri di sintetico non fluorescente definito, o NSD, medio, in un pallone sconcertato da 15 millilitri con una buona aerazione, a 23 gradi Celsius. Da tre a quattro ore prima dell'analisi, diluire la coltura del lievito di fase logaritmica in mezzo NSD fresco, in modo che la densità ottica finale a 600 nanometri, o OD600, sia da 0,5 a 0,8 al momento dell'imaging. Almeno un'ora prima che la coltura sia pronta, centrifugare un'aliquota di due milligrammi per millilitro Concanavalin Una soluzione per cinque minuti a tutta velocità, pellettare eventuali particelle e aggiungere 250 microlitri del supernatante in un piatto di microscopia inferiore in vetro pulito da 35 millimetri.Dopo 15 minuti, lavare il piatto da due a tre volte con due millilitri di acqua distillata per lavaggio, aggiungendo 250 microlitri della coltura del lievito al piatto rivestito con Concanavalin A dopo che è stato asciugato. Attendere 10 minuti per consentire alle cellule di aderire, prima di lavare delicatamente il piatto da due a tre volte con due millilitri di mezzo NSD fresco. Quindi coprire le cellule con due millilitri di NSD fresco.Per immagini le cellule di lievito, selezionare una lente ad immersione dell'olio 63X con un'apertura numerica di almeno 1,4 su un microscopio a luce confocale. Qui, è anche possibile utilizzare un obiettivo 100X al posto di un obiettivo 63X. Quindi, posizionare il piatto sulla lente oggettiva, macchiato con olio ad immersione.Nel menu a discesa della scheda Modalità acquisizione selezionare xyzt. Sotto la scheda XY, formatta le dimensioni del fotogramma a 256 larghezza per 128 altezza. Utilizzare la velocità massima di scansione, che in genere è dell'ordine di otto kilohertz.Attivare la scansione X bidirezionale se disponibile e regolare il fattore di zoom su nove, che si tradurrà in una dimensione in pixel di circa 80 nanometri. Se si utilizza un obiettivo 100X, regolare il fattore di zoom di conseguenza per mantenere una dimensione in pixel di circa 80 nanometri. Quindi impostare l'accumulo di linea su quattro o sei.Impostare il foro stenopeica su 1,2 unità Airy e accendere il laser a luce bianca, se disponibile. Quindi impostare la lunghezza d'onda di eccitazione e la potenza laser percentuale per ogni canale di fluorescenza. Se disponibile, abilitare l'uso della modalità di conteggio dei fotoni nella scheda di configurazione deselezionando il tempo massimo di integrazione.Per ogni canale di fluorescenza, assegnare un rilevatore ad alta sensibilità, impostare l'intervallo di lunghezze d'onda di emissione e attivare la modalità di conteggio dei fotoni, se disponibile. Impostare la finestra di gating del tempo su 0,6-10 nanosecondi per ogni canale di fluorescenza, per evitare di catturare la luce riflessa dal piatto di vetro. Attivare quindi l'imaging a campo luminoso e selezionare rilevatore a bassa sensibilità per la raccolta dei dati.Attivare la modalità di imaging dal vivo e aumentare il guadagno nel canale dei campi luminosi fino a quando le celle non sono chiaramente visibili. Se in modalità di conteggio dei fotoni, modificare l'intervallo di valori grigi da manuale a automatico per visualizzare il segnale fluorescente. Impostate la pila Z per immaginare l'intero volume delle cellule di lievito e specificate la direzionalità dell'imaging in modo che verso il basso si muova verso lo slittamento del coperchio.Impostare l'intervallo z-step su 0,25-0,35 micrometri per ottenere da 20 a 25 sezioni ottiche per Z-stack e attivare il flusso Galvo se disponibile. Per un filmato tipico, impostate l'intervallo di tempo tra z-stack su due secondi e impostate la durata del filmato su cinque a 10 minuti. Quindi salvare il filmato come file LIF.Per la deconvoluzione dei film, avviare un programma software di deconvoluzione appropriato che utilizza il classico algoritmo di stima della massima verosimiglianza e aprire la serie di dati. Selezionare la Procedura guidata di deconvoluzione e l'editor di parametri per verificare che i parametri di imaging siano rilevati e visualizzati correttamente. Modificare il valore dell'indice di rifrazione medio incorporante in 1,4 per approssimare il citoplasma del lievito.Quindi utilizzare l'editor per stimare la posizione dello slittamento di copertura. Selezionare Imposta tutto verificato e fare clic su Accetta e selezionare Invio guidato. Fare clic sulla freccia successiva per ignorare la selezione della funzione di diffusione del punto e le fasi di pre-elaborazione del ritaglio e procedere attraverso la procedura guidata di deconvoluzione per ogni canale di fluorescenza.Selezionare la funzione di mappatura verticale logaritmica di calcolo e ispezionare il profilo di intensità della fluorescenza dei dati grezzi. Impostare manual come modalità per la stima in background, immettere un valore di sfondo e fare clic su Accetta. Lasciare il valore massimo delle iterazioni a 40 e immettere un rapporto segnale/rumore stimato.Quindi disattivare la correzione della candeggina e fare clic su Deconvolvi. Selezionate Accetta al canale successivo nella finestra dei risultati della deconvoluzione, se il rumore viene rimosso a sufficienza senza eliminare la fluorescenza reale dalle strutture fioche. Una volta che tutti i canali fluorescenti sono stati deconvolti in modo soddisfacente, fare clic su Tutto fatto e disporre prima il canale rosso, seguito dai canali verde, blu e campo luminoso, per il successivo editing in ImageJ.Quindi salvare la sequenza di immagini come file TIF a otto bit e selezionare un file per canale e allungare il contrasto come modalità di conversione. Per la correzione della candeggina, importate le sequenze di immagini deconvolte in ImageJ e fate clic su Immagine (Image), Hyperstacks e Stack in Hyperstack per convertire le immagini in un hyperstack. Selezionate xyzct dal menu a discesa e immettete il numero di canali, sezioni z-stack e tempi.Per correggere i canali di fluorescenza per lo sbiancamento delle foto, selezionare Immagine, Colore, Canali divisi e, per i canali fluorescenti, selezionare Plugin, EMBLtools, Correzione candeggina e Adattamento esponenziale. Quindi selezionate Immagine, Colore e Unisci canali per unire il campo luminoso e i canali di fluorescenza corretti per la candeggina in un hyperstack, quindi salvate l'iperstack deconvolto e corretto per la successiva generazione e modifica di film come file TIF a otto bit. Per convertire il set di dati deconvoluto e corretto per la candeggina in un montaggio ridimensionato, selezionate Plugin, IJ_Plugins e Make Montage Series e selezionate l'iperstack a otto bit pertinente.Fare clic su Apri e su OK per accettare che tutte le sezioni verranno utilizzate per creare il montaggio e quindi di nuovo su OK per accettare il valore del fattore di scala suggerito. Salvare il montaggio originale come file TIF a otto bit e selezionare Plugin, IJ_Plugins, Montage Series in Hyperstack e OK, per creare un hyperstack 4D dal montaggio originale che include tutti i tempi. Per generare il filmato proiettato medio originale, selezionare Innanzitutto Plug-in, IJ_Plugins, Project Hyperstack e OK, per accettare i parametri predefiniti di ZProjection.Salvare il filmato proiettato medio come file TIF a otto bit e ispezionare il filmato per identificare le singole strutture che possono essere tracciate per tutta la durata del periodo di etichettatura. Identificare una struttura che può essere tracciata in modo affidabile per tutta la durata del filmato e isolare tale struttura per l'analisi sono i passaggi più critici della procedura. Quindi segui le istruzioni nella guida dell'utente del plug-in, per isolare le strutture di interesse modificando il montaggio.Creare un hyperstack 4D dal montaggio modificato per il periodo, incluse le strutture di interesse, e salvare l'iperstack modificato. Per quantificare l'intensità della fluorescenza nel tempo per la struttura isolata nell'iperstack 4D modificato, selezionate Plugin, IJ_Plugins e Analizza filmato modificato, immettete l'intervallo di tempo tra gli stack Z e fate clic su OK. Per creare un filmato finale della struttura isolata, selezionate Plugin, IJ_Plugins e Project Hyperstack, specificate le sezioni dello stack Z da includere, selezionate Intensità media come tipo di proiezione e fate clic su OK. Per creare un hyperstack 4D con i dati originali sui dati modificati, selezionare plugin, IJ_Plugins, Unire due hyperstack e posizionarsi al primo posto al secondo posto. Per generare un filmato dall'iperstack 4D con i dati originali sui dati modificati, selezionare Plugin, IJ_Plugins e Project Hyperstack, specificare le sezioni dello stack Z da includere, selezionare Intensità media come tipo di proiezione e fare clic su OK. Qui, il primo fotogramma di una proiezione Z-stack di dati grezzi può essere confrontato con gli stessi dati deconvolti e corretti per la candeggina.Questi fotogrammi dello stesso film deconvolto e corretto per la candeggina mostrano due cisterne che sono state analizzate, che prima etichettano con il marcatore di proteina di glicosilazione di resistenza Vanadate verde 4 o Vrg4, e in seguito con il marcatore proteico di trasporto genico Secretory 7 o Sec7 rosso. Questo montaggio, creato da un iperstack sconvoluto e corretto per candeggina, mostra tutte le sezioni ottiche in un unico punto di tempo prima e dopo la modifica, per consentire l'isolamento del segnale da una delle cisterne scelte. In questa figura, diversi fotogrammi del filmato finale delle pile Z proiettate vengono visualizzati con le proiezioni originali nella parte superiore della figura e le proiezioni modificate nella parte inferiore.La quantificazione dei segnali fluorescenti verdi e rossi delle cisterne Golgi scelte rivela che il marcatore Vrg4 verde arriva e persiste per circa 80 secondi, dopodi clic, il marcatore Sec7 rosso arriva e persiste per circa 60 secondi, con una breve sovrapposizione tra i due marcatori. Quando si esegue questa procedura, è importante identificare strutture che possono essere tracciate in modo inequivocabile per tutta la vita. Lo stesso tipo di analisi può essere eseguita dopo aver effettuato una mutazione o qualche altro tipo di perturbazione specifica.Questa tecnica ha aperto la strada allo studio del comportamento dinamico delle cisterne golgi e dei siti di uscita del reticolo endoplasmatico utilizzando il lievito come sistema modello.

Research

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