Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant R01 GM104010. Takk for hjelp med fluorescens mikroskopi til Vytas Bindokas og Christine Labno på Integrated mikroskopi Core Facility, som er støttet av NIH-finansiert Cancer Center support Grant P30 CA014599.

1. forberedelse
<ol><li>Gjør nonfluorescent minimalt med NSD medium2. Fraværet av riboflavin ventes å redusere bakgrunnen intracellulære grønne fluorescens og tilhørende Phototoksisitet.</li>
	<li>Voks gjær belastningen over natten ved ~ 23 ° c til logaritmisk fase i 5 mL NSD i en 50 mL forbløffet kolbe med god lufting. Om 3-4 h før analyse, fortynne gjær kulturen i frisk NSD slik at den endelige OD600 vil være 0,5-0.8 på tidspunktet for Imaging.</li>
	<li>Forbered en 2 mg/mL oppløsn...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

4D konfokalmikroskopi avbildning av gjær organeller krever nøye tuning av flere parametre. Den store bekymringen er photobleaching og Phototoksisitet. En typisk 4D film innebærer å samle tusenvis av optiske seksjoner, slik at laser belysningen må holdes så lavt som mulig. Tandem fluorescerende protein koder kan brukes til å øke signalet uten å øke uttrykket av Tagged protein16,17. Å maksimere skannehastigheten bidrar til å begrense photoskade, og till...

Seksjoner av endomembrane systemet er i konstant forandring, og deres fulle karakterisering krever Live celle Imaging. Beskrevet her er en protokoll som sysselsetter 4D (time-lapse 3D) konfokalmikroskopi mikroskopi å visualisere fluorescensmerkete merket avdelinger i spirende gjær. Metoden ble utviklet for å spore dynamikken i sekretoriske rom i Pichia Pastoris og Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Denne protokollen fokuserer på S. cerevisiae, som har en arealdiagram Golgi der den enkelte cisternae er optisk kan løses4. Den uvanlige Golgi organisasjonen i S. cerevisiae aktivert demonstrasjonen av 4d mikroskopi at en Golgi Cisterna først etiketter med bosatt tidlig Golgi proteiner, og deretter mister disse proteinene mens anskaffe bosatt sent Golgi proteiner3 ,5. Denne overgangen kan bli visualisere ved å skape en belastning der tidlig Golgi protein Vrg4 er merket med GFP mens sent Golgi protein Sec7 er merket med en monomere rødt fluorescerende protein. Når individuelle cisternae spores, er modning observert som en grønn-til-rød konvertering3. Denne typen analyser kan gi verdifull informasjon om protein lokalisering og kupé identitet. For eksempel, to proteiner med litt offset ankomst og avgang kan noen ganger synes å merke forskjellige rom i statiske bilder, men kan sees i 4d filmer å merke det samme rommet på ulike tidspunkt poeng6,7 . Således, 4D mikroskopi avslører fenomener som ellers ikke ville være tydelig.
Informativ 4D mikroskopi av gjær rom kan oppnås med egnede prosedyrer og utstyr2. Når det er mulig, er fluorescerende protein merking utført av gen erstatning8 for å unngå overuttrykte gjenstander. Fordi intracellulære strukturer er ofte svært dynamiske, er 4D Imaging nødvendig for å sikre at en struktur spores pålitelig over tid. Protokollen som beskrives her benytter en laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop utstyrt med høy følsomhet detektorer. Med denne enheten, kan hele celle volumet av S. cerevisiae bli avbildet av konfokalmikroskopi mikroskopi omtrent hver 1-3 S, med 2 S intervaller som er typisk. Data kan samles inn for opptil 5-15 min avhengig av merkings tettheten til fluorophores og deres photophysical egenskaper. Det viktigste hinderet er å minimere photobleaching. For dette formålet er laser intensiteten holdt så lavt som mulig, konfokalmikroskopi skannehastigheten er maksimert, og de optiske parametrene er konfigurert til bildet på Nyquist grensen for å fange opp relevant informasjon og samtidig unngå overdreven lys eksponering. Disse innstillingene er også forventet å lindre Phototoksisitet, en faktor som ofte blir oversett under Live Cell Imaging9,10,11. Den resulterende støyende data behandles med blekemiddel korreksjon og deconvolution algoritmer for å lette kvantifisering av fluorescens intensitet.
Selv med høy kvalitet 4D filmer, er analysen vanskelig fordi gjær avdelinger tendens til å være mange, heterogene og mobil. På grunn av den iboende begrensninger av konfokalmikroskopi mikroskopi og de ikke-optimale innstillingene som kreves for langvarig 4D Imaging, fluorescerende strukturer som er nær hverandre er vanskelig å løse. Dette problemet kan være omgås ved å fokusere på det lille antallet av fluorescerende strukturer som forblir optisk kan løses for varigheten av merkingen perioden, med den forutsetning at disse strukturene er representative for hele befolkningen i merket Rom. Fluorescerende rom som kan spores på en pålitelig måte, identifiseres ved å se på filmer med projiserte Z-stabler og ved å lage en serie montasjer der de optiske seksjonene for hvert tids punkt er plassert på en dataskjerm. Denne analysen sysselsetter egendefinerte ImageJ12 plugins, som gjør at en enkelt struktur som skal spores i isolasjon.
Nyere metoder papirer dekket bruken av fluorescerende proteiner i gjær13 , samt teori og praktisering av 4d konfokalmikroskopi Imaging av gjærceller2. Denne protokollen fokuserer på de viktigste praktiske aspektene ved en 4D Imaging eksperiment. Den inneholder noen forbedringer av tidligere beskrevne prosedyrer, samt oppdaterte versjoner av ImageJ plugin-kode og dokumentasjon. Eksempelet vist fokuserer på Golgi dynamikk, men denne protokollen er like egnet for Imaging andre gjær-avdelinger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

Målet med denne protokollen er å karakterisere hvordan membran rom form og transformere i levende celler av spirende gjær. Mange intracellulære rom i gjær er dynamiske, og en full forståelse av deres egenskaper krever time-lapse Imaging. Multi-Color 4D konfokalmikroskopi fluorescens mikroskopi er en kraftfull metode for å spore atferden og sammensetningen av en intracellulære kupé på en tidsskala på 5-15 min. grundig analyse av kupé dynamikk krever fangst av tusenvis av optiske Deler. For å oppnå dette målet minimeres photobleaching og Phototoksisitet ved å skanne raskt ved svært lav laser effekt, og pikseldimensjonene og Z-trinns intervallene er satt til de største verdiene som er kompatible med prøvetaking av bildet i full oppløsning. Den resulterende 4D datasettene er bråkete, men kan glattet av deconvolution. Selv med data av høy kvalitet er analysefasen utfordrende fordi intracellulære strukturer ofte er mange, heterogene og mobile. For å møte dette behovet, tilpasset ImageJ plugins ble skrevet til array 4D data på en dataskjerm, identifisere strukturer av interesse, redigere data for å isolere enkelte strukturer, kvantifisere fluorescens tid kurs, og lage filmer av den projiserte Z-stabler. 4D-filmer er spesielt nyttige for å skille stabile rom fra forbigående rom som snur ved modning. Slike filmer kan også brukes til å karakterisere hendelser som kupé fusjon, og for å teste effekten av spesifikke mutasjoner eller andre forstyrrelser.

Eksempelet gitt her dokumenter og kvantifiserer modning av to gjær Golgi cisternae som visualisere av dual-farge 4D konfokalmikroskopi mikroskopi3. En gjær celle inneholder på rekkefølgen av 10-15 Golgi cisternae, som hver modnes over en tid løpet av ca 2-4 min. modning kan bli visualisere ved å tagge tidlig Golgi markør Vrg4 med GFP og ved å merke den avdøde Golgi markør Sec7 med en rød fluorescerende protein som mCherry eller mScarlet. En individuell C...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D mikroskopi av gjær

Denne protokollen beskriver analyse av fluorescensmerkete merket intracellulære rom i spirende gjær ved hjelp av multi-farge 4D (time-lapse 3D) konfokalmikroskopi mikroskopi. Bilde parametrene er valgt for å fange opp tilstrekkelige signaler samtidig som de begrenser photoskade. Tilpasset ImageJ plugins tillate merket strukturer som skal spores og kvantitativt analysert.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Denne metoden sporer strukturer i gjærceller i tre dimensjoner over mange minutter, slik at vi kan studere dynamikken i intracellulære organeller og rom. 4D-bildebehandling sikrer at vi kan trekke pålitelige konklusjoner om intracellulær dynamikk, spesielt for strukturer eller markører som kan være forbigående. Å demonstrere prosedyren vil være Natalie Johnson, en postdoktor fra laboratoriet mitt.Begynn med å dyrke en overnattingskultur av gjærstammen av interesse i fem milliliter av ikke-fluorescerende syntetisk definert, eller NSD, medium, i en 15 milliliter forvirret kolbe med god øl, ved 23 grader Celsius. Tre til fire timer før analysen, fortynne logaritmisk fase gjær kultur i frisk NSD medium, slik at den endelige optiske tettheten på 600 nanometer, eller OD600, vil være 0,5 til 0,8 på tidspunktet for bildebehandling. Minst en time før kulturen er klar, sentrifuge en aliquot av en to milligram per milliliter Concanavalin En løsning i fem minutter med full hastighet, for å pellet noen partikler, og legge til 250 mikroliter av supernatant i en ren 35 millimeter glass bunn mikroskopi parabolen.Etter 15 minutter vasker du parabolen to til tre ganger med to milliliter destillert vann per vask, og tilsett 250 mikroliter av gjærkulturen til Concanavalin A-belagt tallerken etter at den er tørket. Vent 10 minutter for å la cellene holde seg, før du forsiktig vasker parabolen to til tre ganger til med to milliliter friskt NSD-medium. Dekk deretter cellene med to milliliter frisk NSD.Hvis du vil se bort gjærcellene, velger du en 63X oljenedsenkingslinse med en numerisk blenderåpning på minst 1,4 på et konfokalt lysmikroskop. Her kan et objektivobjekt på 100 X også brukes i stedet for et objektivobjektiv på 63 X. Deretter plasserer du parabolen på objektivlinsen, oppdaget med nedsenkingsolje.Velg xyzt fra rullegardinmenyen i kategorien Anskaffelsesmodus. Under XY-fanen formaterer du rammestørrelsen til 256 bredde med 128 høyde. Bruk maksimal skannehastighet, som vanligvis er i rekkefølgen på åtte kilohertz.Slå på toveis X-skanning hvis den er tilgjengelig, og juster zoomfaktoren til ni, noe som vil resultere i en pikselstørrelse på ca. 80 nanometer. Hvis et mål på 100 X brukes, justerer du zoomfaktoren tilsvarende for å opprettholde en pikselstørrelse på ca. 80 nanometer. Sett deretter linjeakkumuleringen til fire eller seks.Sett pinhole til 1.2 Airy enheter, og slå på det hvite lys laser, hvis tilgjengelig. Sett deretter eksitasjonsbølgelengden og prosent laserkraft for hver fluorescenskanal. Hvis tilgjengelig, aktiverer du bruk av fotontellingsmodus under konfigurasjonsfanen ved å velge bort maksimal integreringstid.For hver fluorescenskanal tilordner du en høysensitiv detektor, angir utslippsbølgelengdeområdet og slår på fotontellingsmodus, hvis tilgjengelig. Sett tidsvinduet til 0,6 til 10 nanosekunder for hver fluorescenskanal, for å unngå å fange reflektert lys fra glassfatet. Deretter slår du på lys feltavbildning og velger lav følsomhetsdetektor for datainnsamlingen.Slå på live bildebehandlingsmodus, og skru opp forsterkningen i den lyse feltkanalen til cellene er tydelig synlige. Hvis du er i fotontellingsmodus, endrer du området med grå verdier fra manuell til automatisk for å vise fluorescerende signal. Sett Z-stakken til å bilde hele volumet av gjærceller og angi retningsbestemtheten til bildet slik at ned beveger seg mot dekselet slip.Sett Z-trinnsintervallet til 0,25 til 0,35 mikrometer for å få omtrent 20 til 25 optiske seksjoner per Z-stakk, og slå på Galvo Flow hvis den er tilgjengelig. For en typisk film angir du tidsintervallet mellom Z-stabler til to sekunder, og setter filmens varighet til fem til 10 minutter. Deretter lagrer du filmen som en LIF-fil.For filmoverføring, start et passende deconvolution-program som bruker den klassiske estimeringsalgoritmen for maksimal sannsynlighet, og åpner dataserien. Velg veiviser for overføring og redigeringsprogram for parameter for å bekrefte at bildeparameterne oppdages og vises riktig. Endre innebyggingsmediet brytningsindeksens verdi til 1,4 til omtrentlig gjærcytoplasma.Bruk deretter redigeringsprogrammet til å beregne følgeseddelposisjonen. Velg Angi alle bekreftede, og klikk Godta, og velg Angi veiviser. Klikk den neste pilen for å omgå valg av punktoppslagsfunksjon og beskjæring av forhåndsbehandlingsstadier, og fortsett gjennom veiviseren for overføring for hver fluorescenskanal.Velg funksjonen for logaritmisk vertikal tilordning av databehandling, og inspiser intensitetsprofilen for rådatafluorescens. Angi manuell som modus for bakgrunnsestimeringen, angi en bakgrunnsverdi, og klikk Godta. La maksimal iterasjonsverdi være på 40 og angi et estimert signal-til-støy-forhold.Slå deretter av blekemiddelkorrigeringen, og klikk Deconvolve. Velg Godta til neste kanal i resultatvinduet for overføring hvis støyen fjernes tilstrekkelig uten å eliminere den ekte fluorescensen fra de svake strukturene. Når alle de fluorescerende kanalene har blitt tilfredsstillende dekonvolvert, klikk Alle gjort og ordne den røde kanalen først, etterfulgt av de grønne, blå og lyse feltkanaler, for etterfølgende redigering i ImageJ.Lagre deretter bildesekvensen som en åtte-biters TIF-fil og velg en fil per kanal og kontraststrekk som konverteringsmodus. For blekemiddelkorreksjon importerer du de dekonvolverte bildesekvensene til ImageJ og klikker Bilde, Hyperstables og Stack til Hyperstack for å konvertere bildene til en hyperstakk. Velg xyzct fra rullegardinmenyen, og skriv inn antall kanaler, Z-stakksnitt og tidsrammer.Hvis du vil korrigere fluorescenskanalene for bleking av bilder, velger du Bilde, Farge, Delte kanaler og for fluorescerende kanaler velger du Plugins, EMBLtools, Bleach Correction og Eksponentiell tilpasning. Velg deretter Bilde-, farge- og slå sammen kanaler for å slå sammen det lyse feltet og blekemiddelkorrigerte fluorescenskanaler til en hyperstakk, og lagre dekonvolverte og blekemiddelkorrigerte hyperstakken for etterfølgende filmgenerering og redigering som en åtte-biters TIF-fil. Hvis du vil konvertere det dekonvolverte og blekemiddelopp korrigerte datasettet til en skalert montasje, velger du Plugins, IJ_Plugins og Make Montage Series, og velger den relevante åtte-biters hyperstakken.Klikk Åpne og OK for å godta at alle stykkene skal brukes til å opprette montasjen, og klikk OK på nytt for å godta den foreslåtte skalafaktorverdien. Lagre den opprinnelige montasjen som en åtte-biters TIF-fil, og velg Plugins, IJ_Plugins, Montage Series til Hyperstack og OK, for å opprette en 4D-hyperstakk fra den opprinnelige montasjen som inneholder alle tidsrammene. Hvis du vil generere den opprinnelige gjennomsnittlige projiserte filmen, velger du først Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack og OK for å godta standardparameterne for ZProjection.Lagre den gjennomsnittlige projiserte filmen som en åtte-biters TIF-fil og inspiser filmen for å identifisere individuelle strukturer som kan spores i løpet av merkeperioden. Å identifisere en struktur som kan spores pålitelig i løpet av filmen, og isolere denne strukturen for analyse, er de mest kritiske trinnene i prosedyren. Følg deretter instruksjonene i brukerhåndboken for plugin, for å isolere strukturer av interesse ved å redigere montasjen.Opprett en 4D-hyperstakk fra den redigerte montasjen for perioden, inkludert strukturer av interesse, og lagre den redigerte hyperstakken. Hvis du vil kvantifisere fluorescensintensiteten over tid for den isolerte strukturen i den redigerte 4D-hyperstakken, velger du Plugins, IJ_Plugins og Analyser redigert film, skriver inn tidsintervallet mellom Z-stabler og klikker OK. Hvis du vil opprette en endelig film av den isolerte strukturen, velger du Plugins, IJ_Plugins og Project Hyperstack, angir Z-stakksnittene som skal inkluderes, velger Gjennomsnittsintensitet som projeksjonstype og klikker OK. Hvis du vil opprette en 4D-hyperstakk med de opprinnelige dataene over de redigerte dataene, velger du programtillegg, IJ_Plugins, Slå sammen to hyperstakker og Plasser først over andre. Hvis du vil generere en film fra 4D-hyperstakken med de opprinnelige dataene over de redigerte dataene, velger du Programtillegg, IJ_Plugins og Project Hyperstack, angir Z-stakksnittene som skal inkluderes, velger Gjennomsnittsintensitet som projeksjonstype og klikker OK. Her kan den første rammen av en Z-stabelprojeksjon av rådata sammenlignes med de samme dekonvolverte og blekemiddelkorrigerte dataene.Disse rammene fra samme dekonvolverte og blekemiddel korrigerte film viser to sisterne som ble analysert, som første etikett med den grønne Vanadate motstand glykosylering protein 4 eller Vrg4 markør, og senere med den røde Sekretoriske 7 eller Sec7 gentransport protein markør. Denne montasjen, laget av en dekonvolvert og blekemiddel korrigert hyperstakk, viser alle de optiske seksjonene på et tidspunkt før og etter redigering, for å tillate isolering av signalet fra en av de valgte cisternae. I denne figuren vises flere rammer fra den endelige filmen av de projiserte Z-stablene med de opprinnelige projeksjonene øverst på figuren og redigerte projeksjoner nederst.Kvantifisering av de grønne og røde fluorescerende signalene fra den valgte Golgi-sisternen avslører at den grønne Vrg4-markøren kommer og vedvarer i ca 80 sekunder, hvorav den røde Sec7-markøren kommer og vedvarer i ca 60 sekunder, med en kort overlapping mellom de to markørene. Når du utfører denne prosedyren, er det viktig å identifisere strukturer som kan spores utvetydig gjennom hele levetiden. Samme type analyse kan utføres etter å ha gjort en mutasjon eller en annen type spesifikk perturbasjon.Denne teknikken har åpnet veien for å studere den dynamiske oppførselen til Golgi cisternae og endoplasmic reticulum exit nettsteder ved hjelp av gjær som et modellsystem.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiske Rensing av Highly Active gjær ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D Imaging of Protein Aggregation i levende celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analysere Kraniofacial Morphogenesis i sebrafisk ved hjelp av 4D konfokalmikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Surface Sprer og Farging av gjær Kromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopi av Fisjon gjær Seksuell Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...