Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela concessão de NIH R01 GM104010. Agradecimentos para o auxílio com a microscopia de fluorescência a Vytas Bindokas e a Christine Labno na facilidade integrada do núcleo da microscopia, que é apoiada pela concessão do apoio do centro do cancer do NIH-financiado p30 CA014599.

1. preparação
<ol><li>Faça o meio NSD mínimo não fluorescente2. Espera-se que a ausência de riboflavina reduza a fluorescência verde intracelular de fundo e a fototoxicidade associada.</li>
	<li>Cresça a tensão da levedura durante a noite em ~ 23 ° c à fase logarítmica em 5 mL de NSD em um balão perplexo de 50 mL com boa aeração. Aproximadamente 3-4 h antes da análise, diluir a cultura do fermento em NSD fresco de modo que o OD final600 seja 0.5-0.8 na altura da imagem latente.</li...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

a imagem latente de 4D confocal de organelas do fermento exige o ajuste cuidadoso de parâmetros múltiplos. A maior preocupação é o fotobranqueamento e a fototoxicidade. Um típico filme 4D envolve a coleta de milhares de seções ópticas, de modo que a iluminação do laser deve ser mantido o mais baixo possível. As etiquetas fluorescentes em tandem da proteína podem ser usadas para impulsionar o sinal sem aumentar a expressão da proteína etiquetada16,17</sup...

Os compartimentos do sistema do endomembranas estão no fluxo constante, e sua caracterização cheia exige a imagem latente viva da pilha. É descrito aqui um protocolo que emprega a microscopia confocal de 4D (lapso de tempo 3D) para visualizar compartimentos cDNAs etiquetados em leveduras de brotamento. O método foi desenvolvido para rastrear a dinâmica dos compartimentos secretores em Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Este protocolo centra-se sobre S. Centrume, que tem um Golgi nonempilhados em que os cisternae individuais são opticamente resolvíveis4. A organização incomun de Golgi em S. cerevisiae permitiu a demonstração pela microscopia 4D que um cisterna de Golgi etiqueta inicialmente com as proteínas adiantadas do Golgi do residente, e perde então aquelas proteínas ao adquirir proteínas atrasadas residentes do Golgi3 ,5. Esta transição pode ser visualizada através da criação de uma cepa em que o início da proteína Golgi Vrg4 é rotulado com GFP, enquanto o final da proteína Golgi Sec7 é rotulado com uma proteína monomérica vermelha fluorescente. Quando as cisternas individuais são controladas, a maturação é observada como uma conversão verde-a-vermelha3. Este tipo de análise pode fornecer informações valiosas sobre a localização de proteínas e a identidade do compartimento. Por exemplo, duas proteínas com tempos de chegada e partida ligeiramente compensados podem, às vezes, aparecer para rotular diferentes compartimentos em imagens estáticas, mas podem ser vistos em filmes 4D para rotular o mesmo compartimento em diferentes pontos de tempo6,7 . Assim, a microscopia 4D revela fenômenos que, de outra forma, não seriam evidentes.
A microscopia 4D informativa de compartimentos do fermento pode ser conseguida com procedimentos e equipamento apropriados2. Sempre que possível, a marcação de proteínas fluorescentes é realizada pela substituição do gene8 para evitar artefatos de superexpressão. Porque as estruturas intracelular são frequentemente muito dinâmicas, a imagem latente 4D é precisada assegurar-se de que uma estrutura esteja controlada confiantemente sobre o tempo. O protocolo descrito aqui emprega um microscópio confocal da exploração do laser equipado com os detectores elevados da sensibilidade. Com este dispositivo, o volume inteiro da pilha de s. cerevisiae pode ser imaged pela microscopia confocal aproximadamente cada 1-3 s, com os intervalos de 2 s que são típicos. Os dados podem ser coletados por até 5-15 min, dependendo das densidades de rotulagem dos fluoróforos e suas propriedades fotofísicas. O obstáculo principal é minimizar o fotobranqueamento. Para esta finalidade, as intensidades do laser são mantidas tão baixas como possível, a velocidade Confocal da varredura são maximizadas, e os parâmetros óticos são configurados à imagem no limite de Nyquist a fim capturar a informação relevante ao evitar a exposição clara excessiva. Essas configurações também são esperadas para aliviar a fototoxicidade, um fator que muitas vezes é negligenciado durante a imagem de célula viva9,10,11. Os dados ruidosos resultantes são processados com correção de lixívia e algoritmos de desvolução para facilitar a quantificação das intensidades de fluorescência.
Mesmo com filmes 4D de alta qualidade, a análise é complicada porque os compartimentos de levedura tendem a ser numerosos, heterogêneos e móveis. Devido às limitações intrínsecas da microscopia confocal e dos ajustes não-óptimos exigidos para a imagem latente 4D prolongada, as estruturas fluorescentes que são perto de se são duras de resolver. Este problema pode ser contornado centrando-se no pequeno número de estruturas fluorescentes que permanecem opticamente resolvíveis durante o período de rotulagem, com a suposição de que essas estruturas são representativas de toda a população de rotulados Compartimentos. Os compartimentos fluorescentes que podem ser controlados confiantemente são identificados visualizando filmes de pilhas Z projetadas e criando uma série de montagens em que as seções óticas para cada ponto de tempo são vestiu em uma tela de computador. Essa análise emprega plugins personalizados do ImageJ12 , que permitem que uma estrutura individual seja rastreada isoladamente.
Os trabalhos recentes dos métodos cobriram o uso de proteínas fluorescentes no fermento13 assim como a teoria e a prática da imagem latente confocal 4D de pilhas de fermento2. Este protocolo centra-se sobre os principais aspectos práticos de um experimento de imagem 4D. Ele inclui alguns aprimoramentos para procedimentos descritos anteriormente, bem como versões atualizadas do código e da documentação do plug-in do ImageJ. O exemplo mostrado centra-se sobre a dinâmica de Golgi, mas este protocolo é ingualmente apropriado para imagens outros compartimentos do fermento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

O objetivo deste protocolo é caracterizar como os compartimentos da membrana se formam e se transformam em células ao vivo de levedura brotamento. Muitos compartimentos intracelular no fermento são dinâmicos, e uma compreensão cheia de suas propriedades exige a imagem latente do tempo-lapso. A microscopia de fluorescência confocal 4D multi-color é um método poderoso para controlar o comportamento e a composição de um compartimento intracelular em uma escala de tempo de 5-15 minutos. a análise rigorosa da dinâmica do compartimento requer a captura de milhares de Seções. Para atingir esse objetivo, o fotobranqueamento e a fototoxicidade são minimizados através da digitalização rápida a uma potência de laser muito baixa, e as dimensões de pixel e os intervalos Z-Step são definidos para os maiores valores que são compatíveis com a amostragem da imagem em resolução total. Os conjuntos de dados 4D resultantes são ruidosos, mas podem ser suavizados pela desvolução. Mesmo com dados de alta qualidade, a fase de análise é desafiadora porque as estruturas intracelulares são muitas vezes numerosas, heterogêneas e móveis. Para atender a essa necessidade, os plugins personalizados do ImageJ foram gravados em dados de matriz 4D em uma tela de computador, identificam estruturas de interesse, editam os dados para isolar estruturas individuais, quantificam os cursos de tempo de fluorescência e fazem filmes das pilhas Z projetadas. os filmes 4D são particularmente úteis para distinguir compartimentos estáveis de compartimentos transitórios que se transformam por maturação. Esses filmes também podem ser usados para caracterizar eventos como a fusão do compartimento, e para testar os efeitos de mutações específicas ou outras perturbações.

O exemplo dado aqui documenta e quantifica a maturação de duas cisternas de Golgi do fermento como visualizadas pela microscopia confocal 4D da duplo-cor3. Uma célula de levedura contém na ordem de 10-15 Golgi cisternae, cada um dos quais amadurece ao longo de um curso de tempo de aproximadamente 2-4 min. a maturação pode ser visualizada através da marcação do marcador Golgi precoce Vrg4 com GFP e marcando o marcador final do Golgi Sec7 com um fluorescente...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D microscopia de levedura

Este protocolo descreve a análise de compartimentos intracelular cDNAs etiquetados no fermento de brotamento usando a microscopia confocal 4D (Time-Lapse 3D) multi-color. Os parâmetros de imagem são escolhidos para capturar sinais adequados, limitando o Fotodano. Os plugins personalizados do ImageJ permitem que as estruturas rotuladas sejam rastreadas e analisadas quantitativamente.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Este método rastreia estruturas em células de leveduras em três dimensões ao longo de muitos minutos, permitindo-nos estudar a dinâmica das organelas e compartimentos intracelulares. A imagem 4D garante que podemos tirar conclusões confiáveis sobre a dinâmica intracelular, particularmente para estruturas ou marcadores que podem ser transitórios. Demonstrando o procedimento será Natalie Johnson, uma pós-doutora do meu laboratório.Comece cultivando uma cultura noturna da variedade de leveduras de interesse em cinco mililitros de sintéticos não fluorescentes definidos, ou NSD, médio, em um frasco de 15 mililitros perplexos com boa aeração, a 23 graus Celsius. Três a quatro horas antes da análise, diluir a cultura de levedura fase logarítmica em meio NSD fresco, de modo que a densidade óptica final em 600 nanômetros, ou OD600, será de 0,5 a 0,8 no momento da imagem. Pelo menos uma hora antes da cultura estar pronta, centrífugue uma alíquota de dois miligramas por mililitro Concanavalin Uma solução por cinco minutos a toda velocidade, para pelotar quaisquer partículas, e adicionar 250 microlitres do supernatante em um prato de microscopia de vidro limpo de 35 milímetros.Após 15 minutos, lave o prato duas a três vezes com dois mililitros de água destilada por lavagem, adicionando 250 microliters da cultura da levedura ao prato revestido de Concanavalina A depois de seco. Aguarde 10 minutos para permitir que as células aderam, antes de lavar suavemente o prato mais duas ou três vezes com dois mililitros de meio NSD fresco. Em seguida, cubra as células com dois mililitros de NSD fresco.Para imaginar as células de levedura, selecione uma lente de imersão em óleo 63X com uma abertura numérica de pelo menos 1,4 em um microscópio de luz confocal. Aqui, uma lente objetiva de 100X também pode ser usada em vez de uma lente objetiva 63X. Em seguida, coloque o prato na lente objetiva, manchado com óleo de imersão.No menu suspenso da guia Modo de Aquisição, selecione xyzt. Sob a aba XY, formata o tamanho do quadro para 256 largura por 128 de altura. Use a velocidade máxima de varredura, que normalmente está na ordem de oito quilohertz.Ligue a varredura X bidirecional se estiver disponível e ajuste o fator de zoom para nove, o que resultará em um tamanho de pixel de aproximadamente 80 nanômetros. Se um objetivo de 100X for usado, ajuste o fator de zoom de acordo para manter um tamanho de pixel de aproximadamente 80 nanômetros. Em seguida, definir o acúmulo de linha para quatro ou seis.Coloque o orifício em 1.2 Unidades arejadas e ligue o laser de luz branca, se disponível. Em seguida, defina o comprimento de onda de excitação e porcentagem de potência laser para cada canal de fluorescência. Se estiver disponível, habilite o uso do modo de contagem de fótons na guia de configuração, desmarcando o tempo máximo de integração.Para cada canal de fluorescência, atribua um detector de alta sensibilidade, defina o intervalo de comprimento de onda de emissão e ligue o modo de contagem de fótons, se disponível. Defina a janela de gating de tempo para 0,6 a 10 nanossegundos para cada canal de fluorescência, para evitar capturar a luz refletida do prato de vidro. Em seguida, adique imagens de campo brilhante e selecione detector de baixa sensibilidade para a coleta de dados.Ligue o modo de imagem ao vivo e apareçam o ganho no canal de campo brilhante até que as células estejam claramente visíveis. Se no modo de contagem de fótons, altere a faixa de valores cinzas de manual para automático para visualizar o sinal fluorescente. Defina a pilha Z para a imagem de todo o volume de células de levedura e especifique a direcionalidade da imagem de tal forma que para baixo se move em direção ao deslizamento da tampa.Defina o intervalo de passo Z para 0,25 a 0,35 micrômetros para obter cerca de 20 a 25 seções ópticas por pilha Z e ligue o Galvo Flow se estiver disponível. Para um filme típico, defina o intervalo de tempo entre z-stacks para dois segundos, e definir a duração do filme para cinco a 10 minutos. Em seguida, salve o filme como um arquivo LIF.Para a desconvolução de filmes, lance um programa de software de desconvolução apropriado que usa o clássico algoritmo de estimativa de probabilidade máxima e abra a série de dados. Selecione o assistente de desconvolução e o editor de parâmetros para confirmar que os parâmetros de imagem são detectados e exibidos corretamente. Altere o valor do índice de refração média de incorporação para 1,4 para aproximar o citoplasma da levedura.Em seguida, use o editor para estimar a posição de deslizamento de cobertura. Selecione Definir todos verificados e clique em Aceitar e selecione Entrar no assistente. Clique na próxima seta para contornar a seleção da função de spread de ponto e etapas de pré-processamento de corte, e proceda através do assistente de desconvolução para cada canal de fluorescência.Selecione a função de mapeamento vertical logarítmico de computação e inspecione o perfil de intensidade de fluorescência de dados brutos. Defina manual como o modo para a estimativa de fundo, digite um valor de fundo e clique em Aceitar. Deixe o valor máximo das iterações em 40 e digite uma relação sinal-ruído estimado.Em seguida, desligue a correção do alvejante e clique em Desconvolver. Selecione Aceitar o próximo canal na janela de resultados de desconvolução, se o ruído for suficientemente removido sem eliminar a fluorescência genuína das estruturas fracas. Uma vez que todos os canais fluorescentes tenham sido satisfatoriamente desconvolvizados, clique em Tudo feito e organize o canal vermelho primeiro, seguido pelos canais de campo verde, azul e brilhante, para posterior edição no ImageJ.Em seguida, salve a sequência de imagem como um arquivo TIF de oito bits e selecione um arquivo por canal e o estiramento de contraste como o modo de conversão. Para correção de alvejante, importe as sequências de imagens desconvolved em ImageJ e clique em Image, Hyperstacks e Stack to Hyperstack para converter as imagens em um hyperstack. Selecione xyzct no menu suspenso e digite o número de canais, fatias de pilha Z e prazos.Para corrigir os canais de fluorescência para branqueamento de fotos, selecione Imagem, Cor, Canais Divididos e para canais fluorescentes, selecione Plugins, EMBLtools, Bleach Correction e Exponential Fit. Em seguida, selecione Canais de imagem, cor e mesclagem para mesclar os canais de fluorescência corrigidos por campo brilhante e branqueamento em um hipersedor, e salvar o hipersedor corrigido e desconvolvado para a geração e edição de filme subsequentes como um arquivo TIF de oito bits. Para converter o conjunto de dados corrigidos desconvolved e branqueamento em uma montagem dimensionada, selecione Plugins, IJ_Plugins e Make Montage Series e selecione o hipersedor de oito bits relevante.Clique em Abrir e OK para aceitar que todas as fatias serão usadas para criar a montagem e clique em OK novamente para aceitar o valor do fator de escala sugerido. Salve a montagem original como um arquivo TIF de oito bits e selecione Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack e OK, para criar um hiperstack 4D da montagem original que inclui todos os prazos. Para gerar o filme original médio projetado, selecione primeiro Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack e OK, para aceitar os parâmetros padrão ZProjection.Salve o filme projetado médio como um arquivo TIF de oito bits e inspecione o filme para identificar estruturas individuais que podem ser rastreadas durante o período de rotulagem. Identificar uma estrutura que pode ser rastreada de forma confiável durante a duração do filme, e isolar essa estrutura para análise, são as etapas mais críticas do procedimento. Em seguida, siga as instruções no guia do usuário do plugin, para isolar estruturas de interesse editando a montagem.Crie um hiperseto 4D a partir da montagem editada para o período, incluindo as estruturas de interesse, e salve o hiperseco editado. Para quantificar a intensidade da fluorescência ao longo do tempo para a estrutura isolada no hipersepa 4D editado, selecione Plugins, IJ_Plugins e Analyze Edited Movie, insira o intervalo de tempo entre pilhas Z e clique em OK. Para criar um filme final da estrutura isolada, selecione Plugins, IJ_Plugins e Project Hyperstack, especifique as fatias de pilha Z que devem ser incluídas, selecione Intensidade Média como o tipo De projeção e clique em OK. Para criar um hipersepilado 4D com os dados originais sobre os dados editados, selecione plugins, IJ_Plugins, Mescla Dois Hyperstacks e Coloque em primeiro lugar acima do segundo. Para gerar um filme a partir do hipersedor 4D com os dados originais sobre os dados editados, selecione Plugins, IJ_Plugins e Project Hyperstack, especifique as fatias de pilha Z que devem ser incluídas, selecione Intensidade Média como o tipo de projeção e clique em OK. Aqui, o primeiro quadro de uma projeção de pilha de Z de dados brutos pode ser comparado com os mesmos dados corrigidos desconvolvados e branqueados.Estes quadros do mesmo filme desconvolvado e branqueado corrigido mostram duas cisternas que foram analisadas, que primeiro rótulo com a proteína de glicoslação de resistência vanadate verde 4 ou marcador Vrg4, e mais tarde com o marcador de proteína de transporte genético Secretory 7 ou Sec7 vermelho. Esta montagem, criada a partir de um hipersedor corrigido desconvolved e branqueamento, mostra todas as seções ópticas em um único ponto de tempo antes e depois da edição, para permitir o isolamento do sinal de uma das cisternas escolhidas. Nesta figura, vários quadros do filme final das pilhas Z projetadas são mostrados com as projeções originais no topo da figura e projeções editadas na parte inferior.A quantificação dos sinais fluorescentes verde e vermelho da cisternae Golgi escolhida revela que o marcador Vrg4 verde chega e persiste por cerca de 80 segundos, depois disso, o marcador Sec7 vermelho chega e persiste por cerca de 60 segundos, com uma breve sobreposição entre os dois marcadores. Ao realizar esse procedimento, é importante identificar estruturas que podem ser inequivocamente rastreadas ao longo de suas vidas. O mesmo tipo de análise pode ser realizada após fazer uma mutação ou algum outro tipo de perturbação específica.Esta técnica abriu caminho para estudar o comportamento dinâmico dos locais de saída de cisternae golgi e endoplasmáticos usando levedura como sistema modelo.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Biologia

Yeast Colony Embedding Method

Levedura Método Embedding Colony

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Um Ensaio de microscopia de fluorescência para Mitophagy Monitoramento no fermento Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Purificação cromatográfica de Ribossomos Yeast Highly Active

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...