Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH R01 GM104010. Спасибо за помощь с флуоресценцией микроскопии Витас Bindokas и Кристин Лабно на комплексной микроскопии Основной фонд, который поддерживается NIH финансируемых онкологический центр Поддержка Грант P30 CA014599.

1. Подготовка
<ol><li>Сделать нефлуоресцентный минимальный NSD средний2. Отсутствие рибофлавина, как ожидается, приведет к снижению фоновой внутриклеточной зеленой флуоресценции и связанной с ней фототоксичности.</li>
	<li>Выращивайте дрожжи на ночь при 23 градусах по Цельсию до логарифм...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

4D конфокальная визуализация дрожжевых органелл требует тщательной настройки нескольких параметров. Основной проблемой является фотоотбеление и фототоксичность. Типичный 4D фильм включает в себя сбор тысяч оптических секций, так что лазерное освещение должно быть как можно ниже. Танд?...

Сравнения эндомембранной системы находятся в постоянном движении, и их полная характеристика требует визуализации живых клеток. Описано здесь протокол, который использует 4D (замедленное 3D) конфокальной микроскопии для визуализации флуоресцентно помечены отсеков в подающих надежды дрожжей. Метод был разработан для отслеживания динамики секретных отсеков в Pichia pastoris и Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Этот протокол фокусируется на S. cerevisiae, который имеет нестоечный Golgi, вкотором отдельные цистерны оптически разрешимы4 . Необычная организация Golgi в S. cerevisiae позволила демонстрацию 4D микроскопией что цистерна Golgi первоначально маркирует с протеинами резидента предыдущих протеинов Golgi, и после этого теряет те протеины пока приобретающ резидента последние протеины Golgi3 ,5. Этот переход можно визуализировать, создавая штамм, в котором ранний белок Golgi Vrg4 помечен GFP, в то время как поздний белок Golgi Sec7 помечен мономерным красным флуоресцентным белком. Когда отдельные цистерны отслеживаются, созревание наблюдается как зелено-красное преобразование3. Этот тип анализа может предоставить ценную информацию о локализации белка и идентичности отсека. Например, два белка с слегка смещенным временем прибытия и отъезда иногда могут показаться, что они маркируют разные отсеки в статических изображениях, но их можно увидеть в 4D-фильмах, чтобы обозначить один и тот же отсек в разных временных точках6,7 . Таким образом, 4D микроскопия выявляет явления, которые в противном случае не были бы очевидны.
Информационная 4D микроскопия дрожжевых отсеков может быть достигнута с помощью соответствующих процедур и оборудования2. Когда это возможно, флуоресцентные пометки белка выполняется замена гена8, чтобы избежать переэкспрессии артефактов. Поскольку внутриклеточные структуры часто очень динамичны, 4D-изображение необходимо для обеспечения надежной обработки структуры с течением времени. В описанном здесь протоколе используется лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный детекторами высокой чувствительности. С помощью этого устройства, весь объем клеток S. cerevisiae может быть изображен конфокальной микроскопии примерно каждые 1-3 с, с 2 с интервалами является типичным. Данные могут быть собраны на срок до 5-15 мин в зависимости от плотности маркировки фторофоров и их фотофизических свойств. Основным препятствием является минимизация фотоотбелевания. Для этого интенсивность лазера сохраняется как можно ниже, скорость конфокального сканирования максимизируется, а оптические параметры настроены на изображение на пределе Nyquist, чтобы захватить соответствующую информацию, избегая при этом чрезмерного воздействия света. Эти настройки, как ожидается, также облегчить фототоксичность, фактор, который часто упускается из виду во время изображения живых клеток9,10,11. Полученные шумные данные обрабатываются с помощью алгоритмов коррекции отбеливателя и деконволюции для облегчения количественной оценки интенсивности флуоресценции.
Даже с высоким качеством 4D фильмов, анализ сложно, потому что дрожжевые отсеки, как правило, многочисленные, неоднородные, и мобильные. Из-за внутренних ограничений конфокальной микроскопии и неоптимальных настроек, необходимых для длительной 4D-визуализации, флуоресцентные структуры, которые находятся рядом друг с другом, трудно решить. Эту проблему можно обойти, сосредоточив внимание на небольшом количестве флуоресцентных структур, которые остаются оптически разрешимыми в течение периода маркировки, с предположением, что эти структуры являются репрезентативными для всей популяции маркированных Отделения. Флуоресцентные отсеки, которые можно надежно отслеживать, идентифицируются путем просмотра фильмов о проецируемом стеках и создания серии монтажей, в которых оптические секции для каждой временной точки выстраиваются на экране компьютера. В этом анализе используются пользовательские плагины ImageJ12, которые позволяют отслеживать индивидуальную структуру в изоляции.
Последние методы работы охватывает использование флуоресцентных белков в дрожжах13, а также теории и практики 4D конфокальной визуализации дрожжевых клеток2. Этот протокол фокусируется на ключевых практических аспектах эксперимента по визуализации 4D. Она включает в себя некоторые усовершенствования ранее описанных процедур, а также обновленные версии плагина ImageJ и документации. Показанный пример фокусируется на динамике Golgi, но этот протокол в равной степени подходит для визуализации других дрожжевых отсеков.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

Цель юристого протокола – охарактеризовать, как формируются и трансформируются в живые клетки подающих надежды дрожжей. Многие внутриклеточные отсеки в дрожжах динамичны, и полное понимание их свойств требует замедленной визуализации. Многоцветная 4D конфокальная флуоресценционная микроскопия является мощным методом отслеживания поведения и состава внутриклеточного отсека в временной шкале 5-15 мин. Строгий анализ динамики отсека требует захвата тысяч оптических Разделы. Для достижения этой цели фотоотбеление и фототоксичность сводятся к минимуму путем быстрого сканирования при очень низкой мощности лазера, а размеры пикселей и интервалы в шагах устанавливаются на самые большие значения, совместимые с выборкой изображения при полном разрешении. Полученные 4D наборы данных шумные, но могут быть сглажены путем деконволюции. Даже при высоком качестве данных, этап анализа является сложной задачей, поскольку внутриклеточные структуры часто многочисленны, неоднородны и мобильны. Для удовлетворения этой потребности, пользовательские плагины ImageJ были написаны для массива 4D данных на экране компьютера, определить структуры, представляющие интерес, отсеивать данные, чтобы изолировать отдельные структуры, количественно флуоресценции время курсы, и делать фильмы из прогнозируемых стеков. 4D-фильмы особенно полезны для различения стабильных отсеков от переходных отсеков, которые переворачиваются при созревании. Такие фильмы также могут быть использованы для характеристики таких событий, как слияние отсеков, и для проверки влияния конкретных мутаций или других возмущений.

Приведенный здесь пример документов и количественно созревания двух дрожжей Golgi цистерны, как визуализированы двойной цвет 4D конфокальной микроскопии3. Дрожжевой клетки содержит на заказ 10-15 Golgi cisternae, каждый из которых созревает в течение времени курс пр?...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D Микроскопия дрожжей

Этот протокол описывает анализ флуоресцентно помеченных внутриклеточных отсеков в подающих надежды дрожжей с помощью многоцветной 4D (промежуток времени 3D) конфокальной микроскопии. Параметры изображения выбираются для захвата адекватных сигналов, ограничивая при этом фотоповреждения. Пользовательские плагины ImageJ позволяют отслеживать и количественно анализировать помеченные структуры.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Этот метод отслеживает структуры дрожжевых клеток в трех измерениях в течение многих минут, что позволяет нам изучать динамику внутриклеточных органелл и отсеков. 4D-изображение гарантирует, что мы можем сделать надежные выводы о внутриклеточной динамике, особенно для структур или маркеров, которые могут быть переходными. Демонстрация процедуры будет Натали Джонсон, postdoc из моей лаборатории.Начните с выращивания ночной культуры дрожжей штамм интереса в пяти миллилитров нефлуоресцентных синтетических определены, или NSD, средний, в 15 миллилитров сбит с толку колбу с хорошей аэрации, при 23 градусов по Цельсию. За три-четыре часа до анализа разбавляют логаритмическую фазовую дрожжевую культуру в свежей среде NSD, так что окончательная оптическая плотность на 600 нанометров, или OD600, будет от 0,5 до 0,8 на момент визуализации. По крайней мере, за час до того, как культура будет готова, центрифуга алицита в два миллиграмма на миллилитр Конканавалина раствор в течение пяти минут на полной скорости, чтобы гранулировать любые частицы, и добавить 250 микролитров супернатанта в чистый 35-миллиметровый стеклянный нижний микроскопии блюдо.Через 15 минут, мыть блюдо два-три раза с двумя миллилитров дистиллированной воды на стирку, добавив 250 микролитров дрожжевой культуры в Concanavalin покрытием блюдо после того, как она высохнет. Подождите 10 минут, чтобы клетки придерживаться, прежде чем аккуратно мыть блюдо еще два-три раза с двумя миллилитров свежей среды NSD. Затем накройте клетки двумя миллилитров свежего NSD.Чтобы изображение дрожжевых клеток, выберите 63X масляное погружение объектив с численным отверстием не менее 1,4 на конфокальный световой микроскоп. Здесь объектив 100X также может быть использован вместо объектива 63X. Затем поместите блюдо на объектив цели, пятнистый с погружением нефти.Из меню высадки вкладки Режим приобретения выберите xyzt. Под вкладкой XY форматировать размер кадра до 256 ширины на 128 высот. Используйте максимальную скорость сканирования, которая, как правило, составляет порядка восьми килогерц.Включите двунаправленное X-сканирование, если оно доступно, и отрегулируйте коэффициент масштабирования до девяти, что приведет к размеру пикселя приблизительно 80 нанометров. Если используется цель 100X, соответствующим образом отрегулируйте коэффициент масштабирования, чтобы сохранить размер пикселя приблизительно 80 нанометров. Затем установите накопление линии до четырех или шести.Установите пинхол до 1,2 airy единиц, и включите белый свет лазера, если таковые имеются. Затем установите длину волны возбуждения и процентную мощность лазера для каждого канала флуоресценции. При наличии включить режим подсчета фотона под вкладкой конфигурации, отбирая максимальное время интеграции.Для каждого канала флуоресценции назначьте детектор высокой чувствительности, установите диапазон длин волн выбросов и включите режим подсчета фотона, если таковые имеются. Установите время gating окно 0,6 до 10 наносекунд для каждого канала флуоресценции, чтобы избежать захвата отраженного света от стеклянной тарелки. Затем включите яркие полевые изображения и выберите детектор низкой чувствительности для сбора данных.Включите режим живой визуализации и включите усиление в ярком полевом канале до тех пор, пока клетки не будут хорошо видны. Если в режиме подсчета фотона измените диапазон серых значений с ручных на автоматический для просмотра флуоресцентного сигнала. Установите стек для изображения всего объема дрожжевых клеток и укажите направленность изображения таким образом, чтобы вниз движется к крышке скольжения.Установите интервал в 0,25-0,35 микрометра, чтобы получить от 20 до 25 оптических секций на стек, и включите поток Galvo, если он доступен. Для типичного фильма установите интервал времени между стеками до двух секунд и установите продолжительность фильма до 5-10 минут. Затем сохраните фильм в качестве файла LIF.Для деконволюции фильма запустите соответствующую программу по деконволюции, которая использует классический алгоритм оценки максимальной вероятности, и откройте серию данных. Выберите мастера деконволюции и редактор параметров, чтобы подтвердить, что параметры изображения обнаружены и правильно отображаются. Измените значение среднего рефракционного индекса встраивания до 1,4, чтобы приблизиться к цитоплазме дрожжей.Затем используйте редактор для оценки положения скольжения обложки. Выберите установите все проверенные и нажмите Принять, и выберите Введите мастера. Нажмите на следующую стрелку, чтобы обойти выбор функции распространения тока и обрезку этапов предварительной обработки, и пройдите через мастер деконволюции для каждого канала флуоресценции.Выберите вычислительную функцию вертикального картирования и проинспектировать профиль интенсивности флуоресценции необработанных данных. Установите руководство в качестве режима для фоновой оценки введите фоновое значение и нажмите Кнопку Принять. Оставьте максимальное значение итераций на уровне 40 и введите расчетный сигнал к соотношению шума.Затем выключите коррекцию отбеливателя и нажмите Deconvolve. Выберите Принять к следующему каналу в окне результата деконволюции, если шум достаточно удален без устранения подлинной флуоресценции из тусклых структур. После того, как все флуоресцентные каналы были удовлетворительно deconvolved, нажмите Все сделано и организовать красный канал первый, а затем зеленый, синий и яркий каналы поля, для последующего редактирования в ImageJ.Затем сохраните последовательность изображений в качестве восьми битного файла TIF и выберите один файл на канал и контрастное растяжение в качестве режима преобразования. Для коррекции отбеливателя импортните деконвольные последовательности изображений в ImageJ и нажмите Image, Hyperstacks и Stack to Hyperstack, чтобы преобразовать изображения в гиперстаху. Выберите xyzct из меню высадки и введите количество каналов, срезов и таймфреймов.Чтобы исправить флуоресценции каналов для отбеливания фотографий, выберите изображение, цвет, сплит каналов, а также для флуоресцентных каналов, выберите плагины, EMBLtools, bleach коррекции, и экспоненциальный Fit. Затем выберите каналы Изображения, Цвета и Слияния, чтобы объединить яркое поле и отбеливатель, исправленные каналы флуоресценции в гиперстаху, и сохранить деконволюции и отбеливатель исправлены гиперстах для последующего генерации фильма и редактирования в качестве восьми битного файла TIF. Чтобы преобразовать деконвольированный и искорректированный набор данных в масштабированный монтаж, выберите Plugins, IJ_Plugins и Make Montage Series, а также выберите соответствующий восьмитысячий гиперстах.Нажмите Open и OK, чтобы признать, что все срезы будут использованы для создания монтажа, и нажмите OK еще раз, чтобы принять предложенное значение фактора масштаба. Сохранить оригинальный монтаж в качестве восьми битного файла TIF и выбрать Плагины, IJ_Plugins, Монтаж серии Hyperstack и OK, чтобы создать 4D гиперстаф из оригинального монтажа, который включает в себя все таймфреймы. Для создания исходного среднего проецируемого фильма сначала выберите Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack и OK, чтобы принять параметры по умолчанию .Projection.Сохраните средний прогнозируемый фильм в качестве восьми битного файла TIF и проинспектируете фильм, чтобы определить отдельные структуры, которые могут быть отслеированы в течение периода их маркировки. Определение структуры, которая может быть надежно отслеирована в течение всего фильма, и изоляция этой структуры для анализа, являются наиболее важными шагами процедуры. Затем следуйте инструкциям в руководстве пользователя плагина, чтобы изолировать структуры, представляющие интерес, редактируя монтаж.Создайте 4D гиперстак из отредактированного монтажа на период, включая структуры, представляющие интерес, и сохраните отредактированный гиперстах. Для количественной оценки интенсивности флуоресценции с течением времени для изолированной структуры в отредактированной 4D-гиперстаке, выберите Plugins, IJ_Plugins и Analyze Edited Movie, вяйте интервал времени между стеками и нажмите OK. Чтобы создать заключительный фильм изолированной структуры, выберите Plugins, IJ_Plugins и Hyperstack проекта, укажите нарезы стека, которые должны быть включены, выберите среднюю интенсивность в качестве типа проекции и нажмите OK. Для создания 4D-гиперстака с исходными данными по отредактированным данным выберите плагины, IJ_Plugins, Слияние двух гиперстафок и место первым выше секунды. Для создания фильма из 4D-гиперстака с исходными данными по отредактированным данным выберите Plugins, IJ_Plugins и Project Hyperstack, укажите на фрагменты стека, которые должны быть включены, выберите среднюю интенсивность в качестве типа проекции и нажмите OK. Здесь первый кадр проекции необработанных данных по стеку можно сравнить с теми же деконвольтными и исправленными данными отбеливателя.Эти кадры из того же deconvolved и отбеливатель исправлены фильм показать два цистерны, которые были проанализированы, которые сначала этикетки с зеленым Ванатадат сопротивления гликозиляции белка 4 или Vrg4 маркер, а затем с красным Secretory 7 или Sec7 гена транспорта белка маркера. Этот монтаж, созданный из deconvolved и отбеливатель исправлены гиперстах, показывает все оптические разделы в одно время точки до и после редактирования, чтобы изоляция сигнала от одного из выбранных цистерн. На этом рисунке показаны несколько кадров из финального фильма проецируемых стеков с исходными проекциями в верхней части фигуры и отредактированными проекциями внизу.Количественная оценка зеленых и красных флуоресцентных сигналов от выбранного Golgi cisternae показывает, что зеленый маркер Vrg4 прибывает и сохраняется около 80 секунд, после чего красный маркер Sec7 прибывает и сохраняется около 60 секунд, с кратким перекрытием между двумя маркерами. При выполнении этой процедуры важно определить структуры, которые можно однозначно отслеживать на протяжении всей их жизни. Такой же анализ может быть выполнен после мутации или какого-либо другого типа специфических возмущений.Этот метод открыл путь к изучению динамического поведения Golgi cisternae и эндоплазмических участков выхода стикулума с использованием дрожжей в качестве модельной системы.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Очистка Митохондрии из дрожжей Клетки

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Дрожжи колонии Вложение Метод

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Высокая пропускная способность дрожжей плазмиды экрана Сверхэкспрессия

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Хроматографической очистки высокоактивной рибосомы дрожжей

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Количественные живой клетки флуоресцентной микроскопии Анализ деления дрожжевой

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D изображений агрегации белков в живых клетках

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Поверхность Распространение и Иммуноокрашивание дрожжей хромосом

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Микроскопия делящихся дрожжей Жизненный цикл сексуальной

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...