Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por la subvención NIH R01 GM104010. Gracias por la ayuda con la microscopía de fluorescencia a Vytas Bindokas y Christine Labno en Integrated Microscopy Core Facility, que cuenta con el apoyo de la subvención de apoyo a cancercenteros P30 CA014599, financiada por NIH.

1. Preparación
<ol><li>Hacer no fluorescentes mínimos NSD medio2. Se espera que la ausencia de riboflavina reduzca la fluorescencia verde intracelular de fondo y la fototoxicidad asociada.</li>
	<li>Cultivar la cepa de levadura durante la noche a 23 oC en fase logarítmica en 5 ml de NSD en un matraz desfofado de 50 ml con buena aireación. Aproximadamente 3-4 h antes del análisis, diluir el cultivo de levadura en NSD fresco para que la OD final600 será 0.5-0.8 en el momento de la toma de imá...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

La toma de imágenes confocales 4D de los orgánulos de levadura requiere una afinación cuidadosa de múltiples parámetros. La principal preocupación es el fotoblanqueo y la fototoxicidad. Una película 4D típica implica la recopilación de miles de secciones ópticas, por lo que la iluminación láser debe mantenerse lo más baja posible. Las etiquetas de proteínas fluorescentes tándem se pueden utilizar para aumentar la señal sin aumentar la expresión de la proteína etiquetada16,</...

Los compartimentos del sistema de endomembrana están en flujo constante, y su caracterización completa requiere imágenes celulares vivas. Aquí se describe un protocolo que emplea la microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) para visualizar compartimentos etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes. El método fue desarrollado para rastrear la dinámica de los compartimentos secretores en Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Este protocolo se centra en S. cerevisiae, que tiene un Golgi no apilado en el que las cisternae individuales son ópticamente resolubles4. La inusual organización Golgi en S. cerevisiae permitió la demostración por microscopía 4D que una Golgi cisterna etiqueta inicialmente con proteínas Golgi tempranas residentes, y luego pierde esas proteínas mientras adquiere proteínas Golgi tardías residentes3 ,5. Esta transición se puede visualizar mediante la creación de una cepa en la que la proteína Golgi vrg4 temprano está etiquetada con GFP, mientras que la proteína Golgi tardía Sec7 está etiquetada con una proteína fluorescente roja monomérica. Cuando se realiza un seguimiento de cisternae individuales, se observa la maduración como una conversión de verde a rojo3. Este tipo de análisis puede proporcionar información valiosa sobre la localización de proteínas y la identidad del compartimiento. Por ejemplo, dos proteínas con tiempos de llegada y salida ligeramente compensados a veces pueden parecer etiquetar diferentes compartimentos en imágenes estáticas, pero se pueden ver en películas 4D para etiquetar el mismo compartimento en diferentes puntos de tiempo6,7 . Por lo tanto, la microscopía 4D revela fenómenos que de otra manera no serían evidentes.
La microscopía 4D informativa de los compartimentos delevadura se puede lograr con los procedimientos y equipos adecuados 2. Siempre que sea posible, el etiquetado de proteínas fluorescentes se realiza mediante reemplazo genético8 para evitar artefactos de sobreexpresión. Debido a que las estructuras intracelulares son a menudo muy dinámicas, se necesitan imágenes 4D para garantizar que una estructura se rastree de forma fiable a lo largo del tiempo. El protocolo descrito aquí emplea un microscopio confocal de escaneo láser equipado con detectores de alta sensibilidad. Con este dispositivo, todo el volumen celular de S. cerevisiae se puede escanear mediante microscopía confocal aproximadamente cada 1-3 s, con intervalos de 2 s siendo típicos. Los datos se pueden recopilar durante un máximo de 5-15 minutos dependiendo de las densidades de etiquetado de los fluoróforos y sus propiedades fotofísicas. El principal obstáculo es minimizar el fotoblanqueo. Para ello, las intensidades láser se mantienen lo más bajas posible, se maximiza la velocidad de escaneo confocal y los parámetros ópticos se configuran para crear imágenes en el límite de Nyquist con el fin de capturar la información relevante evitando una exposición excesiva a la luz. Estos ajustes también se espera que alivien la fototoxicidad,un factor que a menudo se pasa por alto durante las imágenes de células vivas 9,10,11. Los datos de ruidoso resultantes se procesan con algoritmos de corrección de lejía y desconvolución para facilitar la cuantificación de las intensidades de fluorescencia.
Incluso con películas 4D de alta calidad, el análisis es complicado porque los compartimentos de levadura tienden a ser numerosos, heterogéneos y móviles. Debido a las limitaciones intrínsecas de la microscopía confocal y los ajustes no óptimos necesarios para la toma de imágenes 4D prolongada, las estructuras fluorescentes que están cerca unas de otras son difíciles de resolver. Este problema puede eludirse centrándose en el pequeño número de estructuras fluorescentes que permanecen fijamente resueltas ópticamente durante el período de etiquetado, suponiendo que esas estructuras son representativas de toda la población de Compartimientos. Los compartimentos fluorescentes que se pueden rastrear de forma fiable se identifican mediante la visualización de películas de pilas Z proyectadas y mediante la creación de una serie de montajes en los que las secciones ópticas para cada punto de tiempo se agrupan en una pantalla de ordenador. Este análisis emplea plugins personalizados de ImageJ12, que permiten realizar un seguimiento de una estructura individual de forma aislada.
Los documentos de métodos recientes cubrieron el uso de proteínas fluorescentes en la levadura13, así como la teoría y práctica de la imagen confocal 4D de células de levadura2. Este protocolo se centra en los aspectos prácticos clave de un experimento de imágenes 4D. Incluye algunas mejoras a los procedimientos descritos anteriormente, así como versiones actualizadas del código y documentación del plugin ImageJ. El ejemplo mostrado se centra en la dinámica de Golgi, pero este protocolo es igualmente adecuado para la toma de imágenes de otros compartimentos de levadura.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

El objetivo de este protocolo es caracterizar cómo se forman y transforman los compartimentos de membrana en células vivas de levadura en ciernes. Muchos compartimentos intracelulares en la levadura son dinámicos, y una comprensión completa de sus propiedades requiere imágenes de lapso de tiempo. La microscopía de fluorescencia confocal 4D multicolor es un método potente para rastrear el comportamiento y la composición de un compartimiento intracelular en una escala de tiempo de 5-15 min. El análisis riguroso de la dinámica del compartimiento requiere la captura de miles de Secciones. Para lograr este objetivo, el fotoblanqueo y la fototoxicidad se minimizan escaneando rápidamente a muy baja potencia láser, y las dimensiones en píxeles y los intervalos de paso en Z se establecen en los valores más grandes que son compatibles con el muestreo de la imagen a resolución completa. Los conjuntos de datos 4D resultantes son ruidosos, pero se pueden suavizar mediante la desconvolución. Incluso con datos de alta calidad, la fase de análisis es difícil porque las estructuras intracelulares son a menudo numerosas, heterogéneas y móviles. Para satisfacer esta necesidad, los plugins personalizados de ImageJ se escribieron en datos 4D de matriz en una pantalla de computadora, identificar estructuras de interés, editar los datos para aislar estructuras individuales, cuantificar los cursos de tiempo de fluorescencia y hacer películas de las pilas Z proyectadas. Las películas 4D son particularmente útiles para distinguir compartimentos estables de compartimentos transitorios que se vuelcan por maduración. Estas películas también se pueden utilizar para caracterizar eventos como la fusión de compartimentos, y para probar los efectos de mutaciones específicas u otras perturbaciones.

El ejemplo dado aquí documenta y cuantifica la maduración de dos levaduras Golgi cisternae visualizadas por la microscopía confocal 4D de doble color3. Una célula de levadura contiene en el orden de 10-15 Golgi cisternae, cada uno de los cuales madura en un curso de tiempo de aproximadamente 2-4 min. La maduración se puede visualizar etiquetando el marcador Golgi temprano Vrg4 con GFP y etiquetando el marcador Golgi tardío Sec7 con un fluorescente rojo fluore...

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4D Microscopy of Yeast

Microscopía 4D de levadura

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Este método rastrea las estructuras de las células de levadura en tres dimensiones durante muchos minutos, lo que nos permite estudiar la dinámica de los orgánulos y compartimentos intracelulares. Las imágenes 4D aseguran que podamos sacar conclusiones confiables sobre la dinámica intracelular, particularmente para estructuras o marcadores que pueden ser transitorios. Demostrando el procedimiento estará Natalie Johnson, un postdoctorado de mi laboratorio.Comience por cultivar un cultivo nocturno de la cepa de levadura de interés en cinco mililitros de sintético no fluorescente definido, o NSD, medio, en un matraz desconcertado de 15 mililitros con buena aireación, a 23 grados centígrados. De tres a cuatro horas antes del análisis, diluir el cultivo de levadura de fase logarítmica en medio NSD fresco, de modo que la densidad óptica final a 600 nanómetros, o OD600, será de 0,5 a 0,8 en el momento de la toma de imágenes. Al menos una hora antes de que el cultivo esté listo, centrifugar una alícuota de dos miligramos por mililitro de Concanavalina Una solución durante cinco minutos a toda velocidad, para peletizar cualquier partícula, y añadir 250 microlitros del sobrenadante en una placa de microscopía de fondo de vidrio limpio de 35 milímetros.Después de 15 minutos, lave el plato de dos a tres veces con dos mililitros de agua destilada por lavado, añadiendo 250 microlitros del cultivo de levadura al plato recubierto de Concanavalin A después de que se seque. Espere 10 minutos para permitir que las células se adhieran, antes de lavar suavemente el plato dos o tres veces más con dos mililitros de medio NSD fresco. Luego cubra las células con dos mililitros de NSD fresco.Para tomar imágenes de las células de levadura, seleccione una lente de inmersión de aceite 63X con una apertura numérica de al menos 1,4 en un microscopio de luz confocal. Aquí, también se puede utilizar una lente objetivo 100X en lugar de una lente objetivo 63X. A continuación, coloque el plato en la lente objetivo, manchado con aceite de inmersión.En el menú desplegable de la pestaña Modo de adquisición, seleccione xyzt. En la pestaña XY, formatee el tamaño del marco a 256 de ancho por 128 de altura. Utilice la velocidad máxima de escaneo, que suele estar en el orden de ocho kilohercios.Active el escaneo bidireccional X si está disponible y ajuste el factor de zoom a nueve, lo que dará como resultado un tamaño de píxel de aproximadamente 80 nanómetros. Si se utiliza un objetivo 100X, ajuste el factor de zoom en consecuencia para mantener un tamaño de píxel de aproximadamente 80 nanómetros. A continuación, establezca la acumulación de línea en cuatro o seis.Ajuste el agujero a 1.2 unidades Airy y encienda el láser de luz blanca, si está disponible. A continuación, establezca la longitud de onda de excitación y el porcentaje de potencia láser para cada canal de fluorescencia. Si está disponible, habilite el uso del modo de recuento de fotones en la pestaña de configuración anulando la selección del tiempo máximo de integración.Para cada canal de fluorescencia, asigne un detector de alta sensibilidad, establezca el rango de longitud de onda de emisión y active el modo de recuento de fotones, si está disponible. Establezca la ventana de medición de tiempo en 0,6 a 10 nanosegundos para cada canal de fluorescencia, para evitar capturar la luz reflejada de la placa de vidrio. A continuación, active las imágenes de campo brillante y seleccione un detector de baja sensibilidad para la recopilación de datos.Active el modo de imágenes en vivo y active la ganancia en el canal de campo brillante hasta que las celdas sean claramente visibles. Si está en modo de recuento de fotones, cambie el rango de valores grises de manual a automático para ver la señal fluorescente. Establezca la pila Z para que imagine todo el volumen de las celdas de levadura y especifique la direccionalidad de la imagen de manera que hacia abajo se mueva hacia el resbalón de la cubierta.Establezca el intervalo del paso Z en 0,25 a 0,35 micrómetros para obtener aproximadamente 20 a 25 secciones ópticas por pila Z y encienda el flujo galvo si está disponible. Para una película típica, establezca el intervalo de tiempo entre las pilas Z en dos segundos y establezca la duración de la película en cinco a 10 minutos. A continuación, guarde la película como un archivo LIF.Para la desconvolución de película, inicie un programa de software de desconvolución adecuado que utilice el algoritmo clásico de estimación de máxima verosimilitud y abra la serie de datos. Seleccione el asistente de desconvolución y el editor de parámetros para confirmar que los parámetros de imagen se detectan y se muestran correctamente. Cambie el valor del índice de refracción del medio de incrustación a 1,4 para aproximar el citoplasma de levadura.A continuación, utilice el editor para estimar la posición del deslizamiento de la cubierta. Seleccione Establecer todo verificado y haga clic en Aceptar y seleccione Entrar asistente. Haga clic en la flecha siguiente para omitir la selección de la función de propagación de puntos y las etapas de preprocesamiento de recorte, y continúe con el asistente de desconvolución para cada canal de fluorescencia.Seleccione la función de mapeo vertical logarítmico de cálculo e inspeccione el perfil de intensidad de fluorescencia de datos sin procesar. Establezca manual como modo para la estimación de fondo, introduzca un valor de fondo y haga clic en Aceptar. Deje el valor máximo de las iteraciones en 40 e introduzca una relación señal/ruido estimada.A continuación, desactive la corrección de lejía y haga clic en Deconvolve. Seleccione Aceptar al siguiente canal en la ventana de resultados de desconvolución, si el ruido se elimina lo suficiente sin eliminar la fluorescencia genuina de las estructuras tenues. Una vez que todos los canales fluorescentes se hayan desconvolucionado satisfactoriamente, haga clic en Todo hecho y organice primero el canal rojo, seguido de los canales de campo verde, azul y brillante, para su posterior edición en ImageJ.A continuación, guarde la secuencia de imágenes como un archivo TIF de ocho bits y seleccione un archivo por canal y el estiramiento de contraste como modo de conversión. Para la corrección de lejía, importe las secuencias de imágenes desconvolucionadas en ImageJ y haga clic en Imagen, Hyperstacks y Apilar en Hyperstack para convertir las imágenes en una hiperapila. Seleccione xyzct en el menú desplegable e introduzca el número de canales, sectores de pila Z y marcos de tiempo.Para corregir los canales de fluorescencia para el blanqueo fotográfico, seleccione Imagen, Color, Canales divididos y para canales fluorescentes, seleccione Plugins, EMBLtools, Corrección de lejía y Ajuste exponencial. A continuación, seleccione Imagen, Color y Canales de fusión para fusionar el campo brillante y blanquear los canales de fluorescencia corregidos en una hiperapila, y guarde la hiperapila corregida desconvolucionada y blanqueadora para la posterior generación y edición de películas como un archivo TIF de ocho bits. Para convertir el conjunto de datos corregidos desconvolucionados y blanqueadores en un montaje a escala, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Make Montage Series y seleccione la hiperapilante de ocho bits correspondiente.Haga clic en Abrir y Aceptar para aceptar que todos los sectores se utilizarán para crear el montaje y haga clic en Aceptar de nuevo para aceptar el valor de factor de escala sugerido. Guarde el montaje original como un archivo TIF de ocho bits y seleccione Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack y OK, para crear una hiperapila 4D a partir del montaje original que incluye todos los marcos de tiempo. Para generar la película proyectada promedio original, primero seleccione Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack y OK, para aceptar los parámetros predeterminados de ZProjection.Guarde la película proyectada promedio como un archivo TIF de ocho bits e inspeccione la película para identificar estructuras individuales que se pueden realizar un seguimiento durante su período de etiquetado. Identificar una estructura que se puede rastrear de forma fiable durante la duración de la película y aislar esa estructura para su análisis son los pasos más críticos del procedimiento. A continuación, siga las instrucciones de la guía del usuario del plugin, para aislar las estructuras de interés mediante la edición del montaje.Cree una hiperapila 4D a partir del montaje editado para el período, incluidas las estructuras de interés, y guarde la hiperpilar editada. Para cuantificar la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo para la estructura aislada en la hiperapila 4D editada, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Analizar película editada, introduzca el intervalo de tiempo entre pilas Z y haga clic en Aceptar. Para crear una película final de la estructura aislada, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Project Hyperstack, especifique los sectores de la pila Z que se deben incluir, seleccione Intensidad media como tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Para crear una hiperapilante 4D con los datos originales sobre los datos editados, seleccione plugins, IJ_Plugins, Combinar dos hiperpilas y Colocar primero encima del segundo. Para generar una película a partir de la hiperapila 4D con los datos originales sobre los datos editados, seleccione Plugins, IJ_Plugins y Project Hyperstack, especifique los sectores de pila Z que se deben incluir, seleccione Intensidad media como tipo de proyección y haga clic en Aceptar. Aquí, el primer fotograma de una proyección de pila Z de datos sin procesar se puede comparar con los mismos datos corregidos desconvolucionados y blanqueadores.Estos marcos de la misma película desconvolucionada y corregida por lejía muestran dos cisternas que fueron analizadas, que primero etiquetan con la proteína de glicosilación de resistencia Vanadate verde 4 o marcador Vrg4, y más tarde con el marcador rojo de proteína de transporte de genes Secretory 7 o Sec7. Este montaje, creado a partir de una hiperapila desconvolucionada y corregida por lejía, muestra todas las secciones ópticas en un solo punto de tiempo antes y después de la edición, para permitir el aislamiento de la señal de una de las cisternas elegidas. En esta figura, varios fotogramas de la película final de las pilas Z proyectadas se muestran con las proyecciones originales en la parte superior de la figura y proyecciones editadas en la parte inferior.La cuantificación de las señales fluorescentes verdes y rojas del Golgi cisternae elegido revela que el marcador Verde Vrg4 llega y persiste durante unos 80 segundos, después de lo cual, el marcador rojo Sec7 llega y persiste durante unos 60 segundos, con una breve superposición entre los dos marcadores. Al realizar este procedimiento, es importante identificar las estructuras que se pueden realizar un seguimiento inequívoco a lo largo de su vida útil. El mismo tipo de análisis se puede realizar después de hacer una mutación o algún otro tipo de perturbación específica.Esta técnica ha abierto el camino al estudio del comportamiento dinámico de Golgi cisternae y endoplasmático retículo retículo sitios utilizando la levadura como sistema modelo.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

Biología

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