Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH Grant R01 GM104010. Tack för hjälp med fluorescens mikroskopi till Vytas bindokas och Christine labno på den integrerade mikroskopi Core Facility, som stöds av NIH-finansierade Cancer Center stöd Grant P30 CA014599.

1. förberedelser
<ol><li>Gör icke fluorescerande minimal NSD medium2. Avsaknaden av riboflavin förväntas minska bakgrunden intracellulär grön fluorescens och tillhörande fototoxicitet.</li>
	<li>Odla jäststammen över natten vid ~ 23 ° c till logaritmisk fas i 5 mL NSD i en 50 mL förbryllad kolv med god luftning. Om 3-4 h före analys, späd jästkulturen i färskt NSD så att den slutliga OD600 kommer att vara 0,5-0,8 vid tidpunkten för avbildning.</li>
	<li>Bered en 2 mg/mL lösning a...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

4D konfokal avbildning av jäst organeller kräver noggrann trimning av flera parametrar. Det stora problemet är foto blekning och fototoxicitet. En typisk 4D-film innebär att samla tusentals optiska sektioner, så laser belysningen måste hållas så låg som möjligt. Tandem fluorescerande proteintaggar kan användas för att öka signalen utan att öka uttrycket av det taggade proteinet16,17. Maximera skanningshastigheten hjälper till att begränsa photodam...

Fack i endomembrane systemet är i konstant Flux, och deras fulla karakterisering kräver levande cell avbildning. Beskrivs här är ett protokoll som sysselsätter 4D (Time-lapse 3D) konfokal mikroskopi att visualisera överföras märkta fack i spirande jäst. Metoden utvecklades för att spåra dynamiken i sekretoriska fack i Pichia pastoris och Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Detta protokoll fokuserar på S. Cerevisiae, som har en nonstacked Golgi där enskilda cisternae är optiskt matchas4. Den ovanliga Golgi organisation i S. cerevisiae möjliggjort demonstration av 4D mikroskopi att en Golgi Cisterna initialt etiketter med hemvist tidigt Golgi proteiner, och sedan förlorar dessa proteiner samtidigt förvärva bosatt sent Golgi proteiner3 ,5. Denna övergång kan visualiseras genom att skapa en stam där den tidiga Golgi proteinet Vrg4 är märkt med GFP medan den sena Golgi protein Sec7 är märkt med en monomera rött fluorescerande protein. När enskilda cisternae spåras, mognad observeras som en grön-till-röd omvandling3. Denna typ av analys kan ge värdefull information om protein lokalisering och kupé identitet. Till exempel kan två proteiner med något offset ankomst-och avgångstider ibland visas för att märka olika fack i statiska bilder, men kan ses i 4D-filmer för att märka samma fack vid olika tidpunkter6,7 . Således avslöjar 4D mikroskopi fenomen som annars inte skulle vara uppenbara.
Informativ 4D mikroskopi av jäst fack kan uppnås med lämpliga förfaranden och utrustning2. När det är möjligt, fluorescerande protein märkning utförs av Gene Replacement8 för att undvika överuttryck artefakter. Eftersom intracellulära strukturer är ofta mycket dynamiska, 4D Imaging behövs för att säkerställa att en struktur spåras tillförlitligt över tiden. Det protokoll som beskrivs här sysselsätter en laserskanning konfokal Mikroskop utrustad med hög känslighet detektorer. Med denna enhet, hela cell volymen av S. cerevisiae kan avbildas av konfokal mikroskopi ungefär varje 1-3 s, med 2 S intervall är typiska. Data kan samlas in för upp till 5-15 min beroende på märkningen tätheter av fluoroforer och deras foto fysikaliska egenskaper. Det huvudsakliga hindret är att minimera photoblekning. För detta ändamål är laser intensiteterna hålls så låg som möjligt, den konfokala skanningshastigheten är maximerad, och de optiska parametrarna är konfigurerade för att bilden på Nyquist gränsen för att fånga relevant information och samtidigt undvika överdriven ljus exponering. Dessa inställningar förväntas också lindra fototoxicitet, en faktor som ofta förbises under levande cell avbildning9,10,11. Den resulterande bullriga data bearbetas med blekmedel korrigering och deconvolution algoritmer för att underlätta kvantifiering av fluorescens intensiteter.
Även med hög kvalitet 4D filmer, är analysen knepigt eftersom jästen fack tenderar att vara många, heterogena, och mobila. På grund av de inneboende begränsningarna av konfokalmikroskopi och de icke-optimala inställningar som krävs för långvarig 4D-avbildning, är fluorescerande strukturer som är nära varandra svåra att lösa. Detta problem kan kringgås genom att fokusera på det lilla antalet fluorescerande strukturer som förblir optiskt matchas under märknings perioden, med antagandet att dessa strukturer är representativa för hela populationen av märkta Fack. Fluorescerande fack som kan spåras på ett tillförlitligt sätt identifieras genom att visa filmer av projicerade Z-stackar och genom att skapa en serie montage där de optiska avsnitten för varje tidspunkt är klädd på en datorskärm. Denna analys sysselsätter anpassade ImageJ12 plugins, som tillåter en individuell struktur som ska spåras i isolering.
Nya metoder Papers omfattade användning av fluorescerande proteiner i jäst13 samt teori och praktik av 4D konfokala avbildning av jästceller2. Detta protokoll fokuserar på de viktigaste praktiska aspekterna av en 4D Imaging experiment. Den innehåller vissa förbättringar av tidigare beskrivna procedurer, samt uppdaterade versioner av ImageJ plugin-koden och dokumentation. Det exempel som visas fokuserar på Golgi dynamik, men detta protokoll är lika lämplig för avbildning andra jästfack.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

Målet med detta protokoll är att karakterisera hur membran avdelningar bildas och förvandlas i levande celler av spirande jäst. Många intracellulära fack i jäst är dynamiska, och en fullständig förståelse av deras egenskaper kräver tidsförlopp Imaging. Multi-Color 4D konfokal fluorescens mikroskopi är en kraftfull metod för att spåra beteendet och sammansättningen av ett intracellulärt fack på en tidsskala på 5-15 min. noggrann analys av utrymmets dynamik kräver avskiljning av tusentals optiska Sektioner. För att uppnå detta mål minimeras foto blekning och fototoxicitet genom att snabbt scanna med mycket låg lasereffekt, och pixeldimensionerna och Z-stegintervallen är inställda på de största värden som är kompatibla med sampling av bilden med full upplösning. De resulterande 4D datauppsättningarna är bullriga men kan utjämnas genom deconvolution. Även med hög kvalitet data, är analysfasen utmanande eftersom intracellulära strukturer är ofta många, heterogena, och mobila. För att tillgodose detta behov, anpassade ImageJ plugins skrevs till array 4D data på en datorskärm, identifiera strukturer av intresse, redigera data för att isolera enskilda strukturer, kvantifiera fluorescens tid kurser, och göra filmer av de projicerade Z-stackar. 4D-filmer är särskilt användbara för att särskilja stabila fack från övergående kupéer som förvandlas till mognad. Sådana filmer kan också användas för att karakterisera händelser som kupé fusion, och för att testa effekterna av specifika mutationer eller andra perturbations.

Det exempel som ges här dokument och kvantifierar mogningen av två jäst Golgi cisternae som visualiseras av Dual-Color 4D konfokalmikroskopi3. En jästcell innehåller på order av 10-15 Golgi cisternae, som alla mognar under en tidsperiod på cirka 2-4 min. mognad kan visualiseras genom att tagga den tidiga Golgi markör Vrg4 med GFP och genom att tagga den sena Golgi markören Sec7 med en röd fluorescerande protein som mCherry eller mScarlet. En individ Ciste...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

4D mikroskopi av jäst

Detta protokoll beskriver analysen av fluorescerande märkta intracellulära fack i spirande jäst med flera färger 4D (Time-lapse 3D) konfokal mikroskopi. Avbildnings parametrarna väljs för att fånga upp lämpliga signaler samtidigt som foto skador begränsas. Custom ImageJ plugins tillåta märkta strukturer spåras och kvantitativt analyseras.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Denna metod spårar strukturer i jästceller i tre dimensioner under många minuter, så att vi kan studera dynamiken i intracellulära organeller och fack. 4D-avbildning säkerställer att vi kan dra tillförlitliga slutsatser om intracellulär dynamik, särskilt för strukturer eller markörer som kan vara övergående. Demonstrera förfarandet kommer att Natalie Johnson, en postdoc från mitt laboratorium.Börja med att odla en övernattning kultur av jästen stam av intresse i fem milliliter av icke-fluorescerande syntetiska definieras, eller NSD, medium, i en 15 milliliter förbryllad kolv med god avering, vid 23 grader Celsius. Tre till fyra timmar före analysen, späd den logaritmiska fasjästkulturen i färskt NSD-medium, så att den slutliga optiska densiteten vid 600 nanometer, eller OD600, blir 0,5 till 0,8 vid tidpunkten för bildbehandling. Minst en timme innan kulturen är klar, centrifug en alikvot av en två milligram per milliliter Concanavalin En lösning i fem minuter med full hastighet, att pelleta några partiklar, och tillsätt 250 mikroliter av supernatant i en ren 35 millimeter glas botten mikroskopi skålen.Efter 15 minuter, tvätta skålen två till tre gånger med två milliliter destillerat vatten per tvätt, lägga till 250 mikroliter av jästkulturen till Concanavalin A-belagda skålen efter det torkas. Vänta i 10 minuter så att cellerna kan hålla sig, innan du försiktigt tvättar disken två till tre gånger med två milliliter färskt NSD-medium. Täck sedan cellerna med två milliliter färsk NSD.För att avbilda jästcellerna väljer du ett 63X oljebadlins med en numerisk bländare på minst 1,4 på ett konfokalt ljusmikroskop. Här kan en 100X objektivet också användas i stället för en 63X objektiv lins. Sedan, placera skålen på objektivet linsen, fläckig med nedsänkning olja.På dropdown-menyn på fliken Förvärvsläge väljer du xyzt. Under fliken XY formaterar du ramstorleken till 256 bredd med 128 höjd. Använd den maximala skanningshastigheten, som vanligtvis är i storleksordningen åtta kilohertz.Aktivera dubbelriktad X-skanning om den är tillgänglig, och justera zoomfaktorn till nio, vilket kommer att resultera i en pixelstorlek på cirka 80 nanometer. Om ett 100X-mål används, justera zoomfaktorn i enlighet med detta för att bibehålla en pixelstorlek på cirka 80 nanometer. Ställ sedan in linjeansamlingen på fyra eller sex.Ställ in tapphålet på 1,2 Luftiga enheter, och slå på den vita ljuslasern, om det finns tillgängligt. Ställ sedan in excitation våglängd och procent laserkraft för varje fluorescens kanal. Om det är tillgängligt aktiverar du användningen av läget för inventering av foton under fliken konfiguration genom att avmarkera maximal integrationstid.För varje fluorescenskanal tilldelar du en högkänslighetsdetektor, ställer in utsläppsvåglängdsområdet och aktiverar läget för fotograferingsräkning, om det finns tillgängligt. Ställ in tiden gating fönstret till 0,6 till 10 nanosekond för varje fluorescens kanal, för att undvika att fånga reflekterat ljus från glasfatet. Därefter aktiverar du ljusstark fältavbildning, och väljer låg känslighetsdetektor för datainsamlingen.Aktivera läget för live-avbildning, och vrid upp förstärkningen i den ljusa fältkanalen tills cellerna syns tydligt. Om i foton inventering läge, ändra intervallet för grå värden från manuell till automatisk för att visa lysrörssignalen. Ställ in Z-stacken på bild hela volymen av jästceller och ange riktningsbarheten för avbildningen så att nedåt rör sig mot omslagssnedsteget.Ställ in Z-steg-intervallet på 0,25 till 0,35 mikrometer för att erhålla ca 20 till 25 optiska sektioner per Z-stack, och slå på Galvo Flow om det är tillgängligt. För en typisk film ställer du in tidsintervallet mellan Z-stackar till två sekunder, och ställer in filmens varaktighet på fem till tio minuter. Spara sedan filmen som en LIF-fil.För film deconvolution, starta en lämplig deconvolution mjukvaruprogram som använder den klassiska maximal sannolikhet uppskattning algoritm, och öppna dataserien. Välj Avconvolution-guiden och parameterredigeraren för att bekräfta att avbildningsparametrarna identifieras och visas korrekt. Ändra inbäddningsmediet brytningsindexs värde till 1,4 för att approximera jästcytoplasman.Använd sedan editorn för att uppskatta höljets slipposition. Välj Ange alla verifierade och klicka på Acceptera och välj Guiden Ange. Klicka på nästa pil för att kringgå valet av punktspridningsfunktion och beskära förbearbetningsstadium, och fortsätt genom deconvolution-guiden för varje fluorescenskanal.Välj den compute logaritmiska vertikala mappningsfunktionen och inspektera profilen för rådatafluorescensintensitet. Ange manuell som läge för bakgrundsuppskattningen, ange ett bakgrundsvärde och klicka på Acceptera. Lämna värdet för maximala iterationer vid 40 och ange ett beräknat signal-brusförhållande.Stäng sedan av blekmedelskorrigeringen och klicka på Deconvolve. Välj Acceptera till nästa kanal i deconvolution resultatfönstret, om bruset är tillräckligt bort utan att eliminera den äkta fluorescens från dim strukturer. När alla de fluorescerande kanalerna har deconvolved tillfredsställande, klicka på Allt gjort och ordna den röda kanalen först, följt av den gröna, blå och ljusa fältkanaler, för efterföljande redigering i ImageJ.Spara sedan bildsekvensen som en åtta bitars TIF-fil och välj en fil per kanal och kontraststräckning som konverteringsläge. För blekmedel korrigering, importera de deconvolved bildsekvenser i ImageJ och klicka på Bild, Hyperstacks, och Stack till Hyperstack att omvandla bilderna till en hyperstack. Välj xyzct på dropdown-menyn och ange antalet kanaler, Z-stacksegment och tidsramar.Om du vill korrigera lysrörskanalerna för fotoblekning väljer du Bild, Färg, Dela kanaler och för lysrörskanaler genom att välja Insticksmoduler, EMBL-verktyg, Blekmedelskorrigering och Exponentiell passform. Välj sedan Bild, Färg och Sammanfoga kanaler för att slå samman det ljusa fältet och bleka korrigerade fluorescenskanaler till en hyperstack, och spara deconvolved och blekmedel korrigerade hyperstack för efterföljande filmgenerering och redigering som en åtta bitars TIF-fil. Om du vill konvertera de deconvolved och blekmedel korrigerade datamängden till ett skalat montage väljer du Plugins, IJ_Plugins och Make Montage Series och väljer relevant åtta bitars hyperstack.Klicka på Öppna och OK om du vill acceptera att alla segment kommer att användas för att skapa montaget och klicka på OK igen för att acceptera det föreslagna skalfaktorvärdet. Spara den ursprungliga montage som en åtta bitars TIF-fil och välj Plugins, IJ_Plugins, Montage Series till Hyperstack och OK, för att skapa en 4D hyperstack från den ursprungliga montage som omfattar alla de tidsramar. För att generera den ursprungliga genomsnittliga projicerade filmen, välj först Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack och OK, för att acceptera de ZProjection standardparametrar.Spara den genomsnittliga projicerade filmen som en åtta bitars TIF-fil och inspektera filmen för att identifiera enskilda strukturer som kan spåras under hela deras märkningsperiod. Att identifiera en struktur som kan spåras på ett tillförlitligt sätt under hela filmen, och isolera den strukturen för analys, är de mest kritiska stegen i proceduren. Följ sedan instruktioner i plugin användarhandboken, för att isolera strukturer av intresse genom att redigera montage.Skapa en 4D-hyperstack från det redigerade montaget för perioden inklusive strukturerna av intresse, och spara den redigerade hyperstacken. Om du vill kvantifiera fluorescensintensiteten över tiden för den isolerade strukturen i den redigerade 4D-hyperstack väljer du Plugins, IJ_Plugins och Analysera redigerad film, matar in tidsintervallet mellan Z-stackar och klickar på OK. Om du vill skapa en slutlig film av den isolerade strukturen väljer du Plugins, IJ_Plugins och Project Hyperstack, anger de Z-stacksegment som ska ingå, välj Medelintensitet som projektionstyp och klicka på OK. Om du vill skapa en 4D-hyperstack med de ursprungliga uppgifterna över de redigerade data väljer du plugins, IJ_Plugins, Merge Two Hyperstacks och Place first above second. Om du vill generera en film från hyperstacken i 4D med originaldata över de redigerade data väljer du Plugins, IJ_Plugins och Project Hyperstack genom att ange de Z-stacksegment som ska ingå, välj Genomsnittlig intensitet som projektionstyp och klicka på OK. Här kan den första ramen i en Z-stack projektion av rådata jämföras med samma deconvolved och blekmedel korrigerade data.Dessa ramar från samma deconvolved och blekmedel korrigeras filmen visar två cisternae som analyserades, som först etikett med den gröna Vanadat motstånd glykosylering protein 4 eller Vrg4 markör, och senare med den röda Secretory 7 eller Sec7 gen transport protein markör. Detta montage, som skapats från en deconvolved och blekmedel korrigeras hyperstack, visar alla av de optiska sektioner vid en enda tidpunkt före och efter redigering, för att tillåta isolering av signalen från en av de valda cisternae. I denna figur visas flera bildrutor från den slutliga filmen av de projicerade Z-stackarna med de ursprungliga projektionerna högst upp i figuren och redigerade projektioner längst ned.Kvantifiering av de gröna och röda fluorescerande signaler från den valda Golgi cisternae avslöjar att den gröna Vrg4 markören anländer och kvarstår i ca 80 sekunder, varefter, den röda Sec7 markören anländer och kvarstår i ca 60 sekunder, med en kort överlappning mellan de två markörerna. När du utför den här proceduren är det viktigt att identifiera strukturer som kan entydigt spåras under hela deras livstid. Samma typ av analys kan utföras efter att ha gjort en mutation eller någon annan typ av specifik perturbation.Denna teknik har öppnat vägen för att studera det dynamiska beteendet hos Golgi cisternae och endoplasmatiska reticulum exit platser med hjälp av jäst som modell system.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Rening av mitokondrier från jästceller

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Jäst Colony Bädda Metod

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

En fluorescensmikroskopi-analys för övervakning Mitophagy i jästen Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Med hög kapacitet Jäst Plasmid Överuttryck skärm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitativa levande celler fluorescens-mikroskopi Analys av fissionsjäst

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

4D avbildning av proteinaggregering i levande celler

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analysera Kraniofaciala Morphogenesis i Zebrafish Använda 4D konfokalmikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Ytspridning och immunfärgning av Jäst Kromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Mikroskopi av fissionsjäst Sexuell Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...