Name: 4d microscopy of yeast
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

Bu çalışma NıH Grant R01 GM104010 tarafından desteklenmektedir. Vytas Bindokas ve Christine Labno, NıH destekli Kanser Merkezi Destek Grant P30 CA014599 tarafından desteklenen entegre mikroskobik çekirdek tesisi, floresans mikroskopisi ile yardım için teşekkürler.

1. hazırlık
<ol><li>Floresan olmayan minimal NSD orta2olun. Riboflavin yokluğunda arka plan hücre içi yeşil floresans ve ilişkili fototoksisite azaltmak için bekleniyor.</li>
	<li>Bir gece ~ 23 °C ' de 5 mL NSD 'de Logaritmik faza, 50 mL 'Lik iyi havalandırmaya sahip bir şişlik ile mantar Gerinmesi büyütün. Yaklaşık 3-4 h önce analiz, taze NSD içinde Maya kültürü seyreltilebilir böylece son OD600 görüntüleme sırasında 0.5-0.8 olacaktır.</li>
	<li>Hazırlamak a 2 mg/mL ...

<ol>
	<li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris.">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li><li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles.">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li><li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast.">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li><li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Golgi+apparatus:+insights+and+mysteries.">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li><li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation.">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li><li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system.">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li><li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi.">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232 (2015).</li><li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting,+disruption,+replacement,+and+allele+rescue:+integrative+DNA+transformation+in+yeast.">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li><li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy.">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li><li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging.">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast.">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li><li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals.">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787 (2017).</li><li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation.">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, 250-257 (2014).</li><li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin,+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li><li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization.">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li><li>Genov&#233;, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins.">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics.">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy.">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li><li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi.">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , (2019).</li></ol>

Maya organelleri 4D Konfokal görüntüleme çoklu parametrelerin dikkatli ayarlama gerektirir. Büyük endişe fotobleaching ve fototoksisite. Tipik bir 4D film binlerce optik bölüm toplama içerir, böylece lazer aydınlatma mümkün olduğunca düşük tutulması gerekir. Tandem floresan protein etiketleri etiketli protein ifadesi artan olmadan sinyali artırmak için kullanılabilir16,17. Tarama hızını maksimize etmek, photodam sınırlamak için yardım...

Endomembran sisteminin bölmeleri sürekli Flux ve tam karakterizasyonu canlı hücre görüntüleme gerektirir. Burada açıklanan 4D (zaman atlamalı 3D) konfetit mikroskopu kullanan bir protokoldür Mayalar tomurcuklanmış floresan etiketli bölmeleri görselleştirmek için. Yöntem Pichia pastoris ve Saccharomyces cerevisiae1,2,3' te salgı bölmeler dinamiklerini izlemek için geliştirilmiştir. Bu protokol, bireysel sarnılının optik olarak çözülebilir olduğu yığılmış olmayan bir Golgi olan S. cerevisiae 'ye odaklanır4. S. cerevisiae 'de olağandışı Golgi organizasyonu, bir Golgi sarnıçında başlangıçta ikamet eden erken Golgi proteinleriyle etiketleyerek 4d mikroskobu ile gösterimi etkinleştirmiş ve daha sonra Resident Late Golgi proteinlerini alırken bu proteinlerin kaybettiği3 ,5. Bu geçiş, geç Golgi proteini Sec7 monomerik kırmızı floresan protein ile etiketlenirken, erken Golgi protein Vrg4 GFP ile etiketlendiği bir gerginlik oluşturarak görselleştirilebilir. Bireysel sarnıt takip edildiğinde, olgunlaşma yeşil-kırmızı dönüşüm olarak görülür3. Bu tür analizler protein lokalizasyonu ve bölme kimliği hakkında değerli bilgiler verebilir. Örneğin, biraz uzaklık geliş ve kalkış süreleri ile iki protein bazen statik görüntülerde farklı bölmeleri etiketlemek için görünebilir, ancak 4d filmleri farklı zaman noktalarında aynı bölme etiket için görülebilir5/6 . Böylece, 4D mikroskopisi aksi belirgin olmazdı olayları ortaya çıkarır.
Maya bölmeler bilgilendirici 4D mikroskopisi uygun prosedürler ve ekipmanlar ile elde edilebilir2. Mümkün olduğunda, floresan protein etiketleme gen replasman tarafından gerçekleştirilir8 ekspresyonu eserler önlemek için. Hücre içi yapılar genellikle çok dinamik olduğundan, bir yapının zaman içinde güvenilir bir şekilde izlendiğinden emin olmak için 4D görüntüleme gereklidir. Burada açıklanan protokol, yüksek hassasiyet dedektörleri ile donatılmış bir lazer tarama Konfokal mikroskop kullanır. Bu cihaz ile, s. cerevisiae tüm hücre hacmi yaklaşık her 1-3 s, 2 s aralıklarla tipik olan konfokk mikroskopisi tarafından görüntülenmiş olabilir. Fluoropoerlerin ve fotofizik özelliklerinin etiketleme yoğunluklarına bağlı olarak 5-15 dakika kadar veri toplanabilir. Ana engel fotobleaching en aza indirmek için. Bu amaçla, lazer yoğunlukları mümkün olduğunca düşük tutulur, konfet tarama hızı maksimize edilir, ve optik parametreler aşırı ışık pozlama kaçınarak ilgili bilgileri yakalamak için Nyquist sınırına görüntü olarak yapılandırılır. Bu ayarların aynı zamanda fototoksisite hafifletmek için bekleniyor, genellikle canlı hücre görüntüleme sırasında gözardı edilen bir faktör9,10,11. Ortaya çıkan gürültülü veriler, floresan yoğunluklarını ölçmek için çamaşır suyu düzeltmesi ve deconvolution algoritmaları ile işlenir.
Yüksek kaliteli 4D filmler bile, Maya bölmeleri çok, heterojen ve mobil olma eğilimindedir çünkü analiz zordur. Konfokal mikroskopinin içsel sınırlamaları ve uzun süreli 4D görüntüleme için gerekli olmayan optimum ayarları nedeniyle, birbirlerine yakın olan floresan yapıları çözmek zordur. Bu sorun, etiketleme döneminin süresi için optik olarak çözülebilir kalır floresan yapıların az sayıda odaklanarak, bu yapıların etiketli tüm nüfusun temsilcisi olduğunu varsayımı ile kaçınılabilir Bölme. Güvenilir bir şekilde izlenebilir floresan bölmeleri, öngörülen Z yığınlarının filmleri görüntüleyerek ve her zaman noktası için optik bölümlerin bir bilgisayar ekranında dizilen bir dizi editörü oluşturarak tanımlanır. Bu analiz özel ımagej12 eklentileri kullanır ve bu da tek bir yapının izolasyonda izlenmesini sağlar.
Son Yöntemler kağıtları Maya floresan proteinleri kullanımı kapsanan13 yanı sıra teori ve Maya hücrelerinin 4d Konfokal görüntüleme uygulaması2. Bu protokol, 4D görüntüleme deneyinin temel pratik yönlerini üzerinde duruluyor. Daha önce açıklanan yordamların yanı sıra ımagej eklentisi kodunun ve belgelerinin güncelleştirilmiş sürümlerinin bazı geliştirmeleri içerir. Gösterilen örnek Golgi dinamiklerine odaklanır, ancak bu protokol diğer Maya bölmeleri görüntüleme için eşit derecede uygundur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:587px;" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">35 mm glass bottom dishes No. 1.5</td>
			<td style="width:85px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P35G-0.170-14-C</td>
			<td style="width:167px;">Imaging dishes</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Concanavalin A powder</td>
			<td style="width:85px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Trolox</td>
			<td style="width:85px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">CB-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica SP8 confocal microscope</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite X&#160;</td>
			<td style="width:85px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Huygens Essential software, version 17.04</td>
			<td style="width:85px;">Scientific Volume Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Deconvolution software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:85px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Image processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy of yeast

Bu protokolün amacı, membran bölmeler nasıl şekillendirmek ve tomurcuklanan Maya canlı hücrelerde dönüşümü karakterize etmektir. Maya 'daki birçok hücre içi bölme dinamiktir ve özelliklerinin tam olarak anlaşılması zaman aşımı görüntüleme gerektirir. Çok renkli 4D konfoksel floresan mikroskopisi, 5-15 min. bir zaman ölçeğinde bir hücre içi bölme davranışını ve bileşimi izlemek için güçlü bir yöntemdir. bölme dinamiklerinin titiz analizi, binlerce optik Bölüm. Bu amaca ulaşmak için, fotobleaching ve fototoksisite çok düşük lazer gücüyle hızla tarama yaparak minimize edilir ve piksel boyutları ve Z-Step aralıkları, görüntüyü tam çözünürlükte örnekleme ile uyumlu olan en büyük değerlere ayarlanır. Ortaya çıkan 4D veri setleri gürültülü ancak deconvolution tarafından düzeltilebilir. Yüksek kaliteli verilerle bile, hücre içi yapıları genellikle çok sayıda, heterojen ve mobil olduğundan analiz aşaması zordur. Bu ihtiyacı karşılamak için, özel ımagej eklentileri bir bilgisayar ekranında dizi 4D veri yazılmıştır, ilgi yapıları belirlemek, bireysel yapıları izole etmek için verileri düzenlemek, floresan zaman kursları ölçmek, ve yansıtılan Z-yığınları film yapmak. 4D filmler özellikle olgunlaşma tarafından teslim geçici bölmeler kararlı bölmeleri ayırt etmek için yararlıdır. Bu tür filmler de bölme Fusion gibi olayları karakterize etmek ve belirli mutasyonlar veya diğer perturbations etkilerini test etmek için kullanılabilir.

Örnek olarak burada verilen belgeler ve iki Maya Golgi sarnıkında olgunlaşma çift renkli 4D konfokk mikroskobu tarafından görselleştirilen olarak quantifies3. Bir Maya hücresi 10-15 Golgi sarnısı, her biri yaklaşık 2-4 dk bir zaman ders üzerinde olgunlaşır sırasını içerir. olgunlaşma, GFP ile erken Golgi Marker Vrg4 etiketleme ve kırmızı bir floresan ile geç Golgi Marker Sec7 etiketleme tarafından görselleştirilebilir mCherry veya mScarl...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy of Yeast at JoVE.com

4D Microscopy of Yeast

Maya 4D mikroskopisi

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Bu yöntem, maya hücrelerindeki yapıları birkaç dakika boyunca üç boyutlu olarak izleyerek hücre içi organellerin ve bölmelerin dinamiklerini incelememizi sağlar. 4D görüntüleme, özellikle geçici olabilecek yapılar veya belirteçler için hücre içi dinamikler hakkında güvenilir sonuçlar çıkarabildiğimizi sağlar. Prosedürü gösteren Natalie Johnson, laboratuvarımdan bir doktora sonrası.23 santigrat derece, iyi havalandırma ile 15 mililitre baffled şişesinde floresan olmayan sentetik tanımlı veya NSD, orta, beş mililitre ilgi maya suşu bir gecede kültür büyüyerek başlayın. Analizden üç ila dört saat önce, logaritmik faz maya kültürünü taze NSD ortamında seyreltin, böylece 600 nanometre veya OD600'deki son optik yoğunluk görüntüleme sırasında 0,5 ila 0,8 olacaktır. Kültür hazır olmadan en az bir saat önce, mililitre Concanavalin Bir çözelti santigrat iki miligram bir aliquot tam hızda beş dakika için, herhangi bir partikül pelet ve temiz bir 35 milimetre cam alt mikroskobik çanak içine supernatant 250 mikrolitre ekleyin.15 dakika sonra, çanak yıkama başına iki mililitre distile su ile 2-3 kez yıkayın, kuruduktan sonra Concanavalin A kaplı çanak maya kültürünün 250 mikrolitre ekleyerek. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için 10 dakika bekleyin, yavaşça taze NSD orta iki mililitre ile çanak 2-3 kez daha yıkamadan önce. Sonra taze NSD iki mililitre ile hücreleri kaplayın.Maya hücrelerini görüntülemek için, konfokal ışık mikroskobunda en az 1,4 sayısal diyafram açıklığına sahip 63X yağ daldırma lensi seçin. Burada, 100X objektif lens yerine 63X objektif lens de kullanılabilir. Sonra, daldırma yağı ile benekli objektif lens, çanak yerleştirin.Edinme Modu sekmesinin açılır menüsünden xyzt'yi seçin. XY sekmesialtında, çerçeve boyutunu 128 yüksekliğe göre 256 genişliğe biçimlendirin. Genellikle sekiz kilohertz sırasına göre maksimum taramalar hızını kullanın.Varsa çift yönlü X taramasını açın ve yaklaşık 80 nanometre piksel boyutuyla sonuçlanacak yakınlaştırma faktörünü dokuza ayarlayın. 100X hedefi kullanılırsa, yaklaşık 80 nanometrelik bir piksel boyutunu korumak için yakınlaştırma faktörünün buna göre ayarını ayarlayın. Sonra hat birikimini dört ya da altı olarak ayarlayın.İğne deliğini 1,2 Havadar ünitelere ayarlayın ve varsa beyaz ışık lazerini açın. Daha sonra her floresan kanalı için uyarma dalga boyu ve yüzde lazer gücü ayarlayın. Varsa, maksimum tümleştirme süresini seçerek yapılandırma sekmesi altında foton sayma modunun kullanımını etkinleştirin.Her floresan kanalı için yüksek hassasiyetli bir dedektör atayın, emisyon dalga boyu aralığını ayarlayın ve varsa foton sayma modunu açın. Cam çankırıdaki yansıyan ışığı yakalamamak için her floresan kanalı için zaman gating penceresini 0,6 ila 10 nanosaniye olarak ayarlayın. Ardından, parlak alan görüntülemeyi açın ve veri toplama için düşük hassasiyet lidedektörünü seçin.Canlı görüntüleme modunu açın ve hücreler açıkça görülene kadar parlak alan kanalındaki kazancı açın. Foton sayma modundaysanız, floresan sinyalini görüntülemek için gri değerlerin aralığını manuelden otomatike değiştirin. Maya hücrelerinin tüm hacmini görüntülemek için Z yığınını ayarlayın ve aşağı kapak kayma doğru hareket eder gibi görüntüleme yönlülüğünü belirtin.Z-stack başına yaklaşık 20 ila 25 optik kesit elde etmek için Z adım aralığını 0,25 ila 0,35 mikrometreye ayarlayın ve varsa Galvo Akışını açın. Tipik bir film için, Z yığınları arasındaki zaman aralığını iki saniyeye ayarlayın ve film süresini beş ila 10 dakikaolarak ayarlayın. Ardından filmi LIF dosyası olarak kaydedin.Film deconvolution için, klasik maksimum olasılık tahmin algoritması kullanan uygun bir deconvolution yazılım programı başlatın ve veri serisini açın. Görüntüleme parametrelerinin algılanıp doğru görüntülendiğini doğrulamak için deconvolution sihirbazını ve parametre düzenleyicisini seçin. Katıştırma orta kırılma indeksinin değerini maya sitoplazmasını yaklaşık olarak 1,4 olarak değiştirin.Daha sonra kapak kayma konumunu tahmin etmek için editörü kullanın. Doğrulanmış tümünü ayarla'yı seçin ve Kabul Et'i tıklatın ve sihirbazı girin'i seçin. Nokta yayma işlevi seçimini atlamak ve ön işleme aşamalarını kırpmak için sonraki oku tıklatın ve her floresan kanalı için deconvolution sihirbazı ile devam edin.İşlem logaritmik dikey eşleme işlevini seçin ve ham veri floresan yoğunluğu profilini inceleyin. Kılavuzu arka plan tahmini modu olarak ayarlayın, bir arka plan değeri girin ve Kabul et'i tıklatın. Maksimum yineleme değerini 40'ta bırakın ve tahmini bir sinyali gürültü oranına girin.Sonra çamaşır suyu düzeltme kapatın ve Deconvolve tıklatın. Ses loş yapılardaki gerçek floresan ortadan kaldırılmadan gürültü yeterince kaldırılırsa, deconvolution sonuç penceresinde bir sonraki kanala kabul et'i seçin. Floresan kanalların tümü tatmin edici bir şekilde deconvolved edildikten sonra, Tüm yapılanı tıklatın ve kırmızı kanalı ilk olarak düzenleyin, ardından imagej'de sonraki düzenleme için yeşil, mavi ve parlak alan kanalları takip edin.Ardından görüntü dizisini sekiz bitlik tif dosyası olarak kaydedin ve kanal başına bir dosya seçin ve dönüştürme modu olarak kontrast uzantısı. Ağartıcı düzeltme için, dekonvolved görüntü dizilerini ImageJ'e aktarın ve görüntüleri bir hiper yığına dönüştürmek için Resim, Hyperstack ve Stack'i Hyperstack'e tıklayın. Açılan menüden xyzct'i seçin ve kanal sayısını, Z yığını dilimlerini ve zaman dilimlerini girin.Fotoğraf beyazlatma için floresan kanallarını düzeltmek için Görüntü, Renk, Split Kanalları ve floresan kanallar için Eklentiler, EMBLtools, Bleach Düzeltme ve Üstel Sığdır'ı seçin. Ardından, parlak alanı birleştirmek ve floresan kanallarını bir hiperyığında birleştirmek için Görüntü, Renk ve Birleştirme Kanalları'nı seçin ve sonraki film oluşturma ve düzenleme için deconvolved ve beyazlatma düzeltilmiş hiperyığını sekiz bitlik TIF dosyası olarak kaydedin. Deconvolved ve ağartılmış düzeltilmiş veri kümesini ölçekli bir montaja dönüştürmek için Eklentiler, IJ_Plugins ve Montaj Serisi Yapın'ı seçin ve ilgili sekiz bitlik hyperstack'i seçin.Tüm dilimlerin montaj oluşturmak için kullanılacağını kabul etmek için Aç ve Tamam'ı tıklatın ve önerilen ölçek faktörü değerini kabul etmek için yeniden Tamam'ı tıklatın. Orijinal montajı sekiz bitlik TIF dosyası olarak kaydedin ve tüm zaman dilimlerini içeren orijinal montajdan 4D hyperstack oluşturmak için Eklentiler, IJ_Plugins, Montaj Serilerinden Hyperstack ve Tamam'a seçin. Orijinal ortalama öngörülen filmi oluşturmak için, ZProjection varsayılan parametrelerini kabul etmek için önce Eklentileri, IJ_Plugins, Project Hyperstack'i ve Tamam'ı seçin.Yansıtılan ortalama filmi sekiz bitlik TIF dosyası olarak kaydedin ve etiketleme süreleri boyunca izlenebilen tek tek yapıları belirlemek için filmi inceleyin. Film boyunca güvenilir bir şekilde izlenebilen bir yapının tanımlanması ve bu yapının analiz için yalıtılması yordamın en kritik adımlarıdır. Daha sonra eklenti kullanım kılavuzundaki yönergeleri uygulayın, montajı düzenleyerek ilgi yapılarını yalıtın.İlgi yapıları da dahil olmak üzere dönem için düzenlenmiş montajdan bir 4B hyperstack oluşturun ve düzenlenen hyperstack kaydedin. Düzenlenen 4B hiperyığının yalıtılmış yapısı için zaman içinde floresan yoğunluğunu ölçmek için Eklentiler, IJ_Plugins ve Düzenlenmiş Filmi Çözümle'yi seçin, Z yığınları arasındaki zaman aralığını girdive Tamam'ı tıklatın. Yalıtılmış yapının son filmini oluşturmak için Eklentiler, IJ_Plugins ve Project Hyperstack'i seçin, eklenmesi gereken Z yığını dilimlerini belirtin, Projeksiyon türü olarak Ortalama Yoğunluk'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Düzenlenen verilerin üzerinde orijinal verilerle birlikte bir 4B hiperyığın oluşturmak için eklentileri seçin, IJ_Plugins, İki Hyperstack'i birleştirin ve ikincinin üstünde birinciyi yerleştirin. Düzenlenen verilerin üzerinde orijinal verilerle birlikte 4B hiper yığınından bir film oluşturmak için Eklentiler, IJ_Plugins ve Project Hyperstack'i seçin, eklenmesi gereken Z yığını dilimlerini belirtin, projeksiyon türü olarak Ortalama Yoğunluk'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Burada, ham verilerin Z-stack projeksiyonunun ilk karesi, aynı dekonvolved ve ağartıcı düzeltilmiş verilerle karşılaştırılabilir.Aynı deconvolved ve çamaşır suyu düzeltilmiş film bu çerçeveler analiz edildi iki sarnıç göstermek, yeşil Vanadate direnci glikozilasyon proteini ile ilk etiket 4 veya Vrg4 marker, ve daha sonra kırmızı Secretory 7 veya Sec7 gen taşıma protein belirteci ile. Deconvolved ve çamaşır suyu düzeltilmiş hiperyığının oluşturduğu bu montaj, seçilen sarnıktan birinin sinyalinin izolasyonuna izin vermek için, düzenlemeden önce ve sonra tüm optik bölümleri tek bir zaman noktasında gösterir. Bu şekilde, yansıtılan Z-yığınlarının son filmine ait birkaç kare, figürün üst kısmındaki orijinal projeksiyonlar ve alttaki düzenlenmiş projeksiyonlarla gösterilir.Seçilen Golgi sarnıçyeşil ve kırmızı floresan sinyalleri quantification yeşil Vrg4 marker geldi ve yaklaşık 80 saniye boyunca devam ettiğini ortaya koymaktadır, sonra, kırmızı Sec7 marker geldi ve yaklaşık 60 saniye boyunca devam, iki belirteçarasında kısa bir örtüşme ile. Bu yordamı gerçekleştirirken, yaşamları boyunca kesin olarak izlenebilen yapıları belirlemek önemlidir. Aynı tür analiz, mutasyon veya başka bir spesifik tedirginlik türü yapıldıktan sonra yapılabilir.Bu teknik, mayayı model sistem olarak kullanarak Golgi sarnıç ve endoplazmik retikulum çıkış yerlerinin dinamik davranışlarını incelemenin yolunu açmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Maya hücreleri Mitokondri saflaştırılması

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Yeast Colony Embedding Method

Maya Colony Gömme Yöntemi

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Yüksek Aktif Maya Ribozomlar Kromatografik Arıtma

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

4D konfokal mikroskopi kullanılarak Zebra balığı Kranyofasiyel morfogenez Analizi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Bölünme Maya Cinsel Yaşam Döngüsü Mikroskopi

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...