Name: digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Les auteurs aimeraient remercier les GI et les programmes système immunitaire innée de foie pour un soutien financier de ce projet. B.A.J.T. est également financé par R01 AI121209.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Colorado Campus médical d’Anschutz.
1. préparation des matériaux
<ol><li>Préparer une solution de 5 mg/mL de DNase I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Faire un mélange de digestion en ajoutant 5 000 U/mL de collagénase IV aux médias EHAA de clic.</li>
	<li>Réchauffer le mélange de dige...

<ol>
	<li>Tanaka, M., Iwakiri, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatics+in+the+liver.">Lymphatics in the liver.</a> Current Opinion in Immunology. 53, 137-142 (2018).</li><li>Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+vessel+expansion+and+function+in+the+development+of+hepatic+fibrosis+and+cirrhosis.">Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis.</a> The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).</li><li>Podgrabinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+lymphatic+endothelial+cells.">Molecular characterization of lymphatic endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation.">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li><li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerogenic+properties+of+lymphatic+endothelial+cells+are+controlled+by+the+lymph+node+microenvironment.">Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment.</a> PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).</li><li>Rouhani, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+lymphatic+endothelial+cells+expressing+peripheral+tissue+antigens+in+CD4+T-cell+tolerance+induction.">Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction.</a> Nature Communications. 6, 6771 (2015).</li><li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells.">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li><li>Dubrot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+stromal+cells+acquire+peptide-MHCII+complexes+from+dendritic+cells+and+induce+antigen-specific+CD4(+)+T+cell+tolerance.">Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).</li><li>Hirosue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steady-state+antigen+scavenging,+cross-presentation,+and+CD8++T+cell+priming:+a+new+role+for+lymphatic+endothelial+cells.">Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-C+promotes+immune+tolerance+in+B16+melanomas+and+cross-presentation+of+tumor+antigen+by+lymph+node+lymphatics.">VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics.</a> Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).</li><li>Lund, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+regulate+immune+microenvironments+in+human+and+murine+melanoma.">Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).</li><li>Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+roles+of+lymphatic+vessels+in+cancer+progression.">Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression.</a> Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).</li><li>Dietrich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+lymphatic+vessels,+not+blood+vessels,+primarily+mediate+immune+rejections+after+transplantation.">Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation.</a> Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).</li><li>Kedl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+Dendritic+Cells+acquire+archived+antigen+from+Lymphatic+Endothelial+Cells+for+antigen+presentation+during+lymph+node+contraction.">Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction.</a> Nature Communications. 8, 2034 (2017).</li><li>Kedl, R. M., Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+archiving+by+lymph+node+stroma:+A+novel+function+for+the+lymphatic+endothelium.">Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium.</a> European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).</li><li>Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+capture+and+archiving+by+lymphatic+endothelial+cells+following+vaccination+or+viral+infection.">Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection.</a> Nature Communications. 5, 3989 (2014).</li><li>Yokomori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+marker+podoplanin/D2-40+in+human+advanced+cirrhotic+liver--re-evaluations+of+microlymphatic+abnormalities.">Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities.</a> BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).</li><li>Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+murine+hepatic+sinusoidal+endothelial+cells+characterized+by+the+expression+of+hyaluronan+receptors.">Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).</li><li>Dudas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospero-related+homeobox+1+(Prox1)+is+a+stable+hepatocyte+marker+during+liver+development,+injury+and+regeneration,+and+is+absent+from+"oval+cells".">Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells".</a> Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).</li><li>Schrage, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CD146+is+widely+expressed+on+endothelial+cells+and+is+recognized+by+the+monoclonal+antibody+ME-9F1.">Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1.</a> Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).</li><li>Amatschek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+and+lymphatic+endothelial+cell-specific+differentiation+programs+are+stringently+controlled+by+the+tissue+environment.">Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment.</a> Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).</li><li>Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liver+eliminates+T+cells+undergoing+antigen-triggered+apoptosis+in+vivo.">The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo.</a> Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).</li><li>Shay, T., Kang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Genome+Project+and+systems+immunology.">Immunological Genome Project and systems immunology.</a> Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).</li><li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Mouse+Liver+Contains+Two+Distinct+Populations+of+Cholangiocytes.">Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).</li><li>Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphatic+System:+Integral+Roles+in+Immunity.">The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity.</a> Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).</li><li>Olszewski, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymphatic+system+in+body+homeostasis:+physiological+conditions.">The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions.</a> Lymphatic Research and Biology. 1 (1), 11-21 (2003).</li></ol>

L’importance des ESL dans l’homéostasie du système immunitaire et la régulation est récemment venu à lumière25. Une grande partie de la littérature publiée lymphatique se concentre sur la peau et les ganglions lymphatiques ; Cependant, vaisseaux lymphatiques sont trouvent partout dans le corps26 et, par conséquent, notre compréhension de leur importance dans les différents organes est nécessaire. Nous montrons ici une méthode dans laquelle les ESL dans le ...

Le rôle des vaisseaux lymphatiques et les ESL dans le foie n’est pas bien compris. Alors que les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte du foie1 et augmentent au cours de la maladie2, très peu est entendu au sujet de la fonction et du phénotype des ESL dans le foie. Avec la découverte de marqueurs que l'on trouve principalement sur ESL3, l’importance de ces cellules à l’intérieur des niches de différents tissus dans l’homéostasie et la maladie comblera une lacune importante dans notre compréhension. ESL ont un rôle majeur dans le maintien de la tolérance périphérique dans le ganglion lymphatique et dans des tumeurs métastatiques en interagissant directement avec les cellules des T4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. ESL dans le ganglion lymphatique peut favoriser l’immunité protectrice par l’intermédiaire de leurs interactions avec les cellules dendritiques migrateurs14,15,16. Par conséquent, il y a des rôles multiples pour les ESL qui peut-être être spécifiques à des tissus et des interactions dans lesquelles ils sont présents. Toutefois, très peu est comprise sur ESL l’interaction avec les cellules immunitaires dans les tissus ou le fonctionnement des ESL dans différents organes ; ainsi, évaluer ESL sur une base par cellule dans le foie ou d’autres organes peut-être entraîner avances dans comment ESL programmer l’immunité tissulaire spécifique. Alors qu’une grande partie de la littérature qui se concentre sur l’ESL dans le foie utilise la microscopie pour visualiser les ESL à l’aide d’un ou deux marqueurs et morphologie17, très peu a été fait afin d’évaluer plus précisément ESL sur une base de la cellule par cellule à l’aide de cytométrie en flux, si une étude a fait évaluer les différences entre cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (LSECs) et ESL18. Être capable d’analyser les populations ESL dans le foie par cytométrie en flux permet l’étude approfondie du phénotype LEC pendant homéostasie normale ou d’une maladie.
Evaluer ESL par cytométrie en flux, plusieurs marqueurs de surface sont nécessaires. En général, ESL sont visualisées par l’expression de prospero liés boîte homéotique 1 (Prox-1), le récepteur acide hyaluronique endothéliale de vaisseau lymphatique 1 (LYVE1) ou le récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 3 (VEGFR3) à l’aide de la microscopie. Toutefois, dans le foie, l’expression de ces marqueurs n’est pas limitée aux ESL. Prox-1 est largement exprimée par les hépatocytes pendant le développement du foie, régénération et blessures19, et LYVE1 et VEGFR3 sont exprimés par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques18. Dans le ganglion lymphatique, ESL sont identifiés comme des grappes de différenciation (CD) à l’aide de cytométrie CD45, CD31 + et podoplanin + (PDPN)16. Cependant, cette approche est trop minime pour isoler les ESL dans le foie comme cellules CD45 - CD31 + capturera les cellules endothéliales, et la population prédominante des cellules endothéliales vasculaires dans le foie est LSECs. Ainsi, les autres marqueurs sont nécessaires pour distinguer la population ESL rare de la population de LSEC abondante. CD16/32 (exprimées par mature LSECs18) et CD146 (un cellule endothéliale vasculaire marqueur commun qui est principalement exprimé dans les sinusoïdes du foie par les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques20 avec peu ou aucune expression de lymphatique les cellules endothéliales21) ont été les marqueurs candidats.
Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour isoler et visualisation des ESL dans le foie aide ci-dessus marqueurs, CD45, CD31, CD146, CD16/32 et PDPN pour la cytométrie en flux. Nous décrivons l’utilisation de collagénase IV, DNase 1 et séparation mécanique pour la digestion du tissu hépatique en une suspension de cellules individuelles. Nous décrivons également l’utilisation de gradient de densité d’iodixanol pour l’isolement de cellules non parenchymateuses (NPC) et d’éliminer les débris cellulaires. Enfin, à l’aide de plusieurs marqueurs, nous déterminons la stratégie de blocage de cytométrie en flux flux optimal pour identifier des ESL du foie avec PDPN comme marqueur prédominant.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Clicks/EHAA media</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington Biochemical corporation</td>
			<td>LS002145</td>
			<td>Deoxyribonuclease 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Density Gradient Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>562232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>134706</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31( clone 390)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102420</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127410</td>
			<td>Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti mouse CD16/32 (clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101306</td>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32( clone 93)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101324</td>
			<td>Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ghost red 780 viability dye</td>
			<td>TONBO biosceinces</td>
			<td>3-0865-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC syrian hamster IgG (clone SHG-1)</td>
			<td>Biolegened</td>
			<td>402102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>400531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC rat IgG2 (clone eBR2a)</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>1-4321-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse LYVE1 (clone 223322)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>FAB2125A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>MCA497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (fraction V)</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E177</td>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>A687-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>P184-500</td>
			<td>for RBC Lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather</td>
			<td>2975#21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100um cell strainer</td>
			<td>Fischer</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2</td>
			<td>in house/ATCC</td>
			<td>ATCC HB-197</td>
			<td>FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical</td>
			<td>Truline</td>
			<td>TR2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-2721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1110-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l pipete tip</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td>1111-3700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 10ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>607107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>seriological 5ml pipete</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>606107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell incubator</td>
			<td>Fischer</td>
			<td></td>
			<td>Heracell 160i</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FacsCanto II flow cytometer</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clinical Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td></td>
			<td>model X-14R</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells

Dans le foie, les vaisseaux lymphatiques sont trouvent dans l’espace porte et leur fonction décrite consiste à éliminer le liquide interstitiel du foie vers les ganglions lymphatiques où les débris cellulaires et les antigènes peuvent être interrogés. Nous sommes très désireux de comprendre comment le système vasculaire lymphatique peut-être être impliqué dans l’inflammation et la fonction des cellules immunitaires dans le foie. Cependant, très peu a été publié d’établir des protocoles de digestion pour l’isolement des cellules endothéliales lymphatiques (ESL) du foie ou des marqueurs spécifiques qui peuvent servir à évaluer le foie ESL sur une base par cellule. Par conséquent, nous avons optimisé une méthode pour la digestion et du foie de coloration afin d’évaluer la population de l’ESL dans le foie. Nous sommes convaincus que la méthode décrite ici vous sera utile pour l’identification et l’isolement des ESL le foie et permettra de renforcer notre compréhension de comment ESL répondent au microenvironnement du foie.

Des études analysant les vaisseaux lymphatiques du foie ont principalement utilisé immunohistochemistry pour quantifier la fréquence et le diamètre des vaisseaux lymphatiques dans le foie. Cependant, cette méthode ne permet pas pour l’évaluation d’ESL sur une base de la cellule par cellule, ou pour l’expression de multiples marqueurs, cytokines, chimiokines ou des facteurs de transcription. Par conséquent, nous avons demandé si foie ESL pouvait être isolées du foie et éva...

Watch this Scientific Journal Video about Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells at JoVE.com

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestion du foie murin pour une cytométrie de cellules endothéliales lymphatiques

Ce protocole vise à identifier les populations de cellules endothéliales lymphatiques dans le foie à l’aide de marqueurs décrits. Nous utilisons la collagénase IV et DNase et un hachage doux de tissu, combiné à la cytométrie en flux, afin d’identifier une population distincte de cellules endothéliales lymphatiques.

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines lymphatiques et hépatiques, tels que la façon dont les cellules endothéliales lymphatiques, ou LEC, répondent à des stimuli spécifiques et comment cela contribue à la pathogénie de la maladie. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons évaluer le phénotype et la fonction des cellules endothéliales lymphatiques hépatiques sur une base par cellule, et peut être utilisé pour des applications en cours d’eau après le tri cellulaire. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la biologie lymphatique du foie, elle peut également être utilisée pour évaluer les cellules endothéliales lymphatiques de différents tissus, tels que la peau et la glande mammaire.Jeffrey Finlon, assistant de recherche professionnel de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour préparer une suspension à cellule unique à partir de cellules hépatiques isolées, commencez par pulvériser la souris avec soixante-dix pour cent d’éthanol, et en sécurisant les pattes à un tableau de dissection. Utilisez des ciseaux de dissection pour couper la peau à environ un centimètre au-dessus de l’anus et utilisez des forceps denté pour soulever la peau loin du corps.Insérez les pointes de ciseaux entre la peau et le péritoine et ouvrez les ciseaux pour séparer les tissus avant de poursuivre l’incision cutanée jusqu’au cou. Fixez la peau à la planche de dissection sous chaque membre antérieur et au-dessus de chaque limite postérieure, et tirez le sac péritonéal vers le haut pour étendre l’incision vers le cou. Saisir les lobes du foie et couper juste en dessous du sternum pour permettre la dissection autour du foie.Ensuite, transférez l’organe en quatre millilitres du milieu EHAA de Click. Utilisez le scalpel pour couper le foie en morceaux d’environ un millimètre de diamètre et digérer les morceaux en cinq cents microlitres de solution de digestion fraîchement préparée et cinq cents microlitres de DNase 1. Après quinze minutes à trente-sept degrés Celsius, utiliser un tuyau de cinq cents millilitres pour bien mélanger les tissus et retourner le récipient à l’incubateur pendant encore quinze minutes.À la fin de l’incubation, transférer l’échantillon digéré à travers une passoire de cent microns dans un tube conique de cinquante millilitres et utiliser le piston à partir d’une seringue d’un millilitre pour presser doucement les morceaux de tissu restants à travers le maillage. Lavez le filtre avec cinq millilitres de tampon d’isolement et appuyez doucement sur tout tissu restant à travers la passoire. Recueillir les cellules hépatiques isolées par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille en quatre millilitres de tampon de lyse des globules rouges.Après cinq minutes à température ambiante, laver les cellules en dix millilitres de tampon d’isolement et compter les cellules sur l’hémocytomètre pour déterminer le nombre total de foies. Suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres d’iodixanol de vingt pour cent et superposer la suspension cellulaire avec un millilitre de PBS. Séparez les cellules par séparation du gradient de densité et récoltez la couche entre le PBS et l’iodixanol.Filtrez ensuite les cellules à travers une passoire de cent micromètres dans un nouveau tube conique de cinquante millilitres. Lavez les cellules en dix millilitres de tampon d’isolement frais et suspendez la pastille résultante dans cinq cents microlitres de PBS, complétées par le sérum bovin foetal de deux pour cent, ou FBS. Après comptage, aliquot environ cinq fois dix à la sixième cellules non parenchymales dans chaque puits de contrôle et expérimental d’une plaque de puits de quatre-vingt-dix-six pour centrifugation et de suspendre à nouveau les granulés dans quatre-vingt-dix microlitres de PBS plus FBS par puits.Ajoutez les cocktails d’anticorps primaires expérimentaux et de contrôle appropriés à chaque puits et entacher tous les puits avec un marqueur de viabilité approprié. L’étape la plus importante de cette procédure est la titration appropriée des anticorps et l’utilisation de contrôles de type glace et de contrôles de fluorescence-1 pour valider la coloration. Après trente minutes à quatre degrés Celsius, centrifugeuse laver les cellules avec une centaine de microlitres de PBS plus FBS par puits et transférer les cellules de chaque puits dans des tubes individuels de cytométrie à fond rond de cinq millilitres à un volume final de quatre cents microlitres de PBS plus FBS par tube.Ensuite, utilisez un petit volume de cellules pour régler le laser et les paramètres de compensation sur le cytomètre d’écoulement et lire tous les événements pour chaque tube. Lorsque tous les tubes ont été lus, importez les données dans un programme approprié d’analyse de cytométrie de débit. Porte sur les cellules vivantes en fonction du colorant marqueur de viabilité où l’expression négative est considérée comme vivante.Porte sur les cellules vivantes en fonction de la taille et de la granularité des cellules ainsi que de leur expression de colorant marqueur de viabilité, suivie d’un gating sur la population de cellules CD31 négatives CD31 en utilisant les données appropriées sur le contrôle de l’isotype et la fluorescence-1 pour déterminer les populations positives et négatives. Ensuite, portez les cellules cd31 négatives CD45 positives selon leur CD16/32 et l’expression podoplanine pour permettre l’identification du CD31 négatif CD45 positif, CD16/32 négatif podoplanine positive lymphatic endothelial, et CD45 négatif CD31 positif, CD16/32 positif podoplanin négatif foie sinusoïdien populations de cellules endotheliales. Les cellules endothéliales emphatiques expriment le vaisseau lymphatique et l’hyaluronan endothélial, mais pas CD146.Les cellules positives CD16/32 positives isolées par CD31 isolées comme démontré sont également cd146 positives et podoplanin positives, tandis que les cellules négatives CD16/32 positives cd31 sont principalement négatives cd146 et soit podoplanine positives ou négatives. La positivité a été déterminée basée sur la coloration de fluorescence-1. Les cellules endothéliales lymphatiques hépatiques sont négatives cd146 et PDPN positives.Ni l’endothélium vasculaire ni les macrophages hépatiques murins n’expriment la podoplanine. La coloration à la podoplanine peut également être utilisée pour distinguer les cholangiocytes des vaisseaux lymphatiques en fonction des structures nucléaires distinctes des canaux biliaires ainsi que de la coloration de la cytokératine 7. Comme seules les cellules endothéliales lymphatiques co-expriment le récepteur vasculaire du facteur de croissance endothéliale 3 et la protéine Prospero homeobox 1 dans le foie, ces marqueurs peuvent être utilisés pour confirmer la pureté de la population de cellules endothéliales lymphatiques du foie triés.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de travailler rapidement et de garder les cellules sur la glace. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme le tri des débits des populations de LEC peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, telles que le profilage transcriptionnel des LEC. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie lymphatique spécifique au foie pour explorer l’impact lymphatique des maladies hépatiques chez les souris et les humains.Généralement, les individus nouveaux à cette méthode lutteront parce que les cellules endothéliales lymphatiques sont une population peu fréquente et graduelle dans un foie et la méthode doit être exécutée rapidement.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Débit analyse par cytométrie de cellules immunitaires dans aortes murin

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Recherche

Immunologie et infection

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Isolation par cytométrie en flux des cellules primaires murins épithéliales alvéolaires de type II pour les études fonctionnelles et moléculaires

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

Non invasive d&#39;imagerie optique du système vasculaire lymphatique d&#39;une souris

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolement et analyse par cytométrie en flux des cellules immunitaires du cerveau ischémique souris

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

L&#39;isolement et la cytométrie en flux analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

L&#39;isolement et la caractérisation par cytométrie en flux de l&#39;intestin grêle Lymphocytes murine

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Cytométrie en flux Analyse des cellules tueuses naturelles lytique Activité dans le sang humain

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Infection de Pneumococcus des cellules endothéliales humaines primaires dans le flux constant

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Blocking Lymph Flow by Suturing Afferent Lymphatic Vessels in Mice

Blocage du flux lymphatique par suturing vaisseaux lymphatiques afferent chez la souris

Lymphatic vessels are critical in maintaining tissue fluid balance and optimizing immune protection by transporting antigens, cytokines, and cells to ...