Name: fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes
Uploaded: 2018-11-28T13:00:00
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Los autores desean agradecer a compañía israelí "SION" para la inseminación artificial y cría (Hafetz Haim, Israel) por su ayuda y cooperación y la Sra. Li Na (IMV Technologies, L'Aigle, Francia) para obtener ayuda con la configuración del instrumento y entrenamiento.

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices israelíes de 1994 para el bienestar animal. Espermatozoides bovinos fue suministrado por empresa comercial israelí para la inseminación artificial y cría. Eyaculados de 11 toros fueron evaluados en este estudio.
1. preparación de muestras de esperma
Nota: El procedimiento se basa en protocolo1,3 del laboratorio Roth.
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	<li>Komsky-Elbaz, A., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+herbicide+atrazine+and+its+metabolite+DACT+on+bovine+sperm+quality.">Effect of the herbicide atrazine and its metabolite DACT on bovine sperm quality.</a> Reprod Toxicol. 67, 15-25 (2016).</li><li>G&#252;rler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cryopreservation+on+sperm+viability,+synthesis+of+reactive+oxygen+species,+and+DNA+damage+of+bovine+sperm.">Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm.</a> Theriogenology. 86 (2), 562-571 (2016).</li><li>Komsky-Elbaz, A., Saktsier, M., Roth, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+impairs+sperm+quality+and+fertilization+competence.">Aflatoxin B1 impairs sperm quality and fertilization competence.</a> Toxicology. 393, 42-50 (2018).</li><li>Beltr&#225;n, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ion+Channels+in+the+Sperm+Acrosome+Reaction.">Role of Ion Channels in the Sperm Acrosome Reaction.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 35-69 (2016).</li><li>Breitbart, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+in+sperm+capacitation+and+acrosome+reaction.">Signaling pathways in sperm capacitation and acrosome reaction.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 49 (3), 321-327 (2003).</li><li>Almadaly, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+factors+affecting+the+results+of+staining+frozen-thawed+fertile+and+subfertile+Japanese+Black+bull+spermatozoa+for+acrosomal+status.">Methodological factors affecting the results of staining frozen-thawed fertile and subfertile Japanese Black bull spermatozoa for acrosomal status.</a> Anim Reprod Sci. 136 (1-2), 23-32 (2012).</li><li>Jankovicov&#225;, J., Simon, M., Antal&#237;kov&#225;, J., Horovsk&#225;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrosomal+and+viability+status+of+bovine+spermatozoa+evaluated+by+two+staining+methods.">Acrosomal and viability status of bovine spermatozoa evaluated by two staining methods.</a> Vet Hung. 56 (1), 133-138 (2008).</li><li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa.">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histol Histopathol. 24 (8), 999-1007 (2009).</li><li>Whitfield, C. H., Parkinson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+fertility+of+bovine+semen+and+in+vitro+induction+of+acrosome+reactions+by+heparin.">Relationship between fertility of bovine semen and in vitro induction of acrosome reactions by heparin.</a> Theriogenology. 38 (1), 11-20 (1992).</li><li>Celeghini, E. C. C., de Arruda, R. P., de Andrade, A. F. C., Nascimento, J., Raphael, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+Techniques+for+Bovine+Sperm+Simultaneous+Fluorimetric+Assessment+of+Plasma,+Acrosomal+and+Mitochondrial+Membranes.">Practical Techniques for Bovine Sperm Simultaneous Fluorimetric Assessment of Plasma, Acrosomal and Mitochondrial Membranes.</a> Reprod Domest Anim. 42 (5), 479-488 (2007).</li><li>Ramalho-Santos, J., Varum, S., Amaral, S., Mota, P. C., Sousa, A. P., Amaral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functionality+in+reproduction:+from+gonads+and+gametes+to+embryos+and+embryonic+stem+cells.">Mitochondrial functionality in reproduction: from gonads and gametes to embryos and embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 15 (5), 553-572 (2009).</li><li>Eddy, E. M., O&#8217;Brien, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The spermatozoon. , (1994).</li><li>Gallon, F., Marchetti, C., Jouy, N., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functionality+of+mitochondria+differentiates+human+spermatozoa+with+high+and+low+fertilizing+capability.">The functionality of mitochondria differentiates human spermatozoa with high and low fertilizing capability.</a> Fertil Steril. 86 (5), 1526-1530 (2006).</li><li>Espinoza, J. a., Paasch, U., Villegas, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+disruption+pattern+in+human+sperm.">Mitochondrial membrane potential disruption pattern in human sperm.</a> Hum Reprod. 24 (9), 2079-2085 (2009).</li><li>H&#252;ttemann, M., Lee, I., Pecinova, A., Pecina, P., Przyklenk, K., Doan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+phosphorylation,+the+mitochondrial+membrane+potential,+and+their+role+in+human+disease.">Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease.</a> J Bioenerg Biomembr. 40 (5), 445-456 (2008).</li><li>Sellem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+combinations+of+in+vitro+quality+assessments+to+predict+fertility+of+bovine+semen.">Use of combinations of in vitro quality assessments to predict fertility of bovine semen.</a> Theriogenology. 84 (9), 1447-1454 (2015).</li><li>Odhiambo, J. F., Sutovsky, M., DeJarnette, J. M., Marshall, C., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+ubiquitin-PNA+based+sperm+quality+assay+for+semen+evaluation+by+a+conventional+flow+cytometer+and+a+dedicated+platform+for+flow+cytometric+semen+analysis.">Adaptation of ubiquitin-PNA based sperm quality assay for semen evaluation by a conventional flow cytometer and a dedicated platform for flow cytometric semen analysis.</a> Theriogenology. 76 (6), 1168-1176 (2011).</li><li>Barrier Battut, I., Kempfer, A., Becker, J., Lebailly, L., Camugli, S., Chevrier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+new+fertility+prediction+model+for+stallion+semen,+including+flow+cytometry.">Development of a new fertility prediction model for stallion semen, including flow cytometry.</a> Theriogenology. 86 (4), 1111-1131 (2016).</li></ol>

Potencial de fecundación de espermatozoides depende de múltiples factores que refleja su calidad. Una alta concentración de espermatozoides y una alta proporción de espermatozoides móviles altamente progresivamente podrían considerarse semen de alta calidad. Sin embargo, esa evaluación no toma en cuenta otros parámetros celulares y funcionales. El uso de la 'bancada' microcapillary citometría de flujo puede ser fácilmente adaptado a la evaluación de diferentes estructuras de esperma mediante sondas fluorescent...

Integridad y funcionalidad de las membranas del esperma son algunos de los factores que indica viabilidad espermática y la fertilización posible. La membrana plasmática actúa como una barrera entre los compartimientos intracelulares y extracelulares, manteniendo así el equilibrio osmótico celular1. Cualquier estrés que induce daño en la integridad de la membrana plasmática pueden la homeostasis, reducen la capacidad de viabilidad y fertilización e incrementar la muerte celular. Por ejemplo, criopreservación reduce la viabilidad espermática debido al daño a la membrana plasmática, como resultado de los cambios de temperatura y estrés osmótico2. Hemos divulgado previamente que exponer los espermatozoides de Toro para bajas concentraciones de contaminantes de los alimentos tales como la plaguicidas atrazina, su metabolito principal diaminochlorotriazine o la aflatoxina de micotoxina B1, reduce el esperma viabilidad1,3 . Esto fue determinado por el ADN de doble hebra con DAPI de etiquetado en combinación con PI, que se une al ADN de las células con una membrana de plasma dañada.
Reacción acrosómica (RA) consiste en la fusión de la membrana acrosómica externa y la membrana plasmática suprayacente resultando en la liberación de enzimas acrosómica4,5. Estos son eventos esenciales para la penetración de la zona pelúcida y fusión del espermatozoide con el ovocito6más. Por lo tanto, la evaluación de la integridad de la membrana acrosómica constituye un parámetro útil para evaluar la calidad del semen y la fertilidad masculina7,8,9. Varias técnicas fluorescentes son convenientes para la verificación de integridad del acrosoma, FITC-PNA o FITC-PSA8,10. En nuestros estudios anteriores, utilizando los patrones de FITC-PSA tinción1,3, proporciona las definiciones precisas para (i) acrosoma intacto, (ii) dañar la membrana del acrosoma y (iii) reacción acrosómica. En el informe actual, evaluar el estado del acrosoma mediante citometría de flujo de esperma dedicado y comparar los resultados a aquellos que utilizan la microscopía de fluorescencia.
Las mitocondrias son organelos multifuncionales involucrada en, entre otras cosas, ATP síntesis, producción de especies reactivas del oxígeno, señales de calcio y apoptosis. Disfunciones fisiológicas, incluyendo la infertilidad masculina y femenina, se asocian con alteración de la función mitocondrial11. Las mitocondrias del espermatozoide se arreglan en la midpiece y desempeñan un papel crucial en el esperma motilidad12. Es bien aceptado que el alto potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se asocia con motilidad normal y fertilización alta capacidad13. En cambio, ΔΨm bajo se asocia con un nivel elevado de especies reactivas de oxígeno y reducción de la tasa de fertilización14. Sin embargo, varios compuestos ambientales, por ejemplo los disruptores endocrinos, pueden inducir estrés celular y conducir a un aumento transitorio en hiperpolarización1,3, ΔΨm, aumento de la producción de radicales libres y eventualmente, 15de la apoptosis. La sonda fluorescente 5, 5', 6, 6'-tetra-cloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1) permite examinar por ejemplo, los efectos de las toxinas transmitidas por los alimentos en esperma ΔΨm1,3.
Espermogramas estándar, basadas en parámetros morfológicos y fisiológicos, no son lo suficientemente buenas como predecir la calidad del semen. Se requieren métodos más precisos para asegurar la calidad del esperma. Presentamos dos métodos posibles para determinar la calidad del esperma basada en evaluaciones de las membranas del esperma: coloración cuádruple simultánea con sondas fluorescentes específicas y microscopía de fluorescencia, descrito en nuestros estudios1,3 y citometría de flujo de esperma dedicado avanzado recientemente en nuestro laboratorio y ya siendo utilizado por otros16,17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Neubauer Germany</td>
			<td></td>
			<td>hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI (propidium iodide )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4170</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0770</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1 (5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)</td>
			<td>ENZOBiochem, New York, NY, USA</td>
			<td>ENZ52304</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V conjugated to FITC</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td>fluorescent probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V binding buffer 20X stock solution</td>
			<td>MACS, Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-820</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse, TE-2000-u</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nis Elements</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon DXM1200F</td>
			<td>Nikon, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td>digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guava EasyCyte Plus</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td></td>
			<td>microcapillary sperm flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoSoft</td>
			<td>Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffered solution for cytometry</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>023862</td>
			<td>buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability and concentration kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024708</td>
			<td>kit for viability assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitochondrial activity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>024864</td>
			<td>kit for mitochondrial activity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viability &#38; acrosome integrity kit</td>
			<td>IMV Technologies, L&#39;Aigle, France</td>
			<td>025293</td>
			<td>kit for acrosome integrity assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP-13</td>
			<td>SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine sperm</td>
			<td>&#34;SION&#34;, Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorimetric techniques for the assessment of sperm membranes

Espermogramas estándar que describe la calidad del esperma se basan principalmente en los parámetros fisiológicos y visuales, como el volumen de eyaculado y concentración, motilidad y motilidad progresiva, morfología espermática y viabilidad. Sin embargo, ninguna de estas evaluaciones es suficiente predecir la calidad del semen. Dado que el mantenimiento de viabilidad espermática y la fertilización potencial depende de la integridad de la membrana y función intracelular, evaluación de estos parámetros puede permitir una mejor predicción de la capacidad de fertilización del esperma. Aquí, Describimos tres métodos posibles para evaluar la calidad del esperma mediante sondas fluorescentes específicas combinadas con análisis de citometría de flujo o microscopia de fluorescencia. Análisis evaluaron la integridad de la membrana plasmática con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y yoduro de propidio (PI), integridad de la membrana acrosómica usando conjugados con isotiocianato de fluoresceína aglutinina de Pisum sativum (PSA-FITC) y integridad de la membrana mitocondrial con 5, 5', 6, 6'-tetra-cloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1). También se presentan combinaciones de estos métodos. Por ejemplo, el uso de anexina V combinado con PI fluorocromos permite evaluar apoptosis calcular la proporción de espermatozoides apoptóticos (índice de apoptosis). Creemos que estas metodologías, que se basan en el examen de las membranas del espermatozoide, son muy útiles para la evaluación de la calidad del esperma.

Figura 1 muestra fluorimétrico simultánea evaluación de membranas del esperma (plasma y acrosómica y mitocondrial) usando PI, DAPI y FITC-PSA JC-1. Evaluación de las membranas de espermatozoides utilizando tinción simultánea con cuatro puntas de prueba fluorescentes permite, por ejemplo, evaluar la proporción de espermatozoides en cada categoría: vivo y muerto; alta vs baja ΔΨm; intactos vs. dañado el acrosoma, simultán...

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Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Aquí, presentamos a metodologías para evaluar la integridad de la membrana de spermatozoan, una característica celular asociada con la capacidad de fertilización del esperma. Se describen tres técnicas para la evaluación de fluorimétrico de las membranas del esperma: coloración simultánea con sondas fluorescentes específicas, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo avanzada dedicado de esperma. También se presentan ejemplos de la combinación de las metodologías.

Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

El objetivo de estos procedimientos es evaluar la integridad de las membranas espermáticas utilizando sondas fluorescentes específicas combinadas con microscopía de fluorescencia o análisis de citometría de flujo. Estas técnicas podrían ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción, como la predicción del potencial de fertilización y la calidad de la muestra de espermatozoides. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten una evaluación precisa de múltiples membranas espermáticas que se sabe que se asocian con el potencial de fertilización de espermatozoides.Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia el diagnóstico de la calidad de la eyaculación, ya que permite una evaluación más precisa del plasma esperma y la integridad de la membrana acrosoma, así como el potencial de la membrana mitocondrial. Para comenzar este procedimiento, obtenga aproximadamente de uno a seis mililitros de semen de toro en un tubo de 15 mililitros a temperatura ambiente. Agregue seis mililitros de tampón NKM precalentados a 37 grados centígrados a cada mililitro de semen.Centrifugar a 600 veces g durante ocho minutos. Repita la centrifugación una o dos veces hasta que el sobrenadante esté limpio. Después de esto, deseche inmediatamente la mayor parte del sobrenadante, dejando aproximadamente un centímetro de sobrenadante por encima del pellet.Incline cuidadosamente los tubos en un ángulo de 30 grados en la incubadora y espere de 20 a 30 minutos para permitir que los espermatozoides naden hacia arriba. Usando una micropipeta, retire cuidadosamente el mililitro restante de sobrenadante que ahora contiene el espermatozoide móvil y transfiéralo a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Mantenga el esperma a 37 grados Celsius hasta que esté listo para usar.En primer lugar, prepare todas las soluciones de stock necesarias como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera 133 microlitros de los espermatozoides móviles a una concentración de 25 millones de espermatozoides por mililitro a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 17 microlitros de la solución de trabajo DAPI e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.Centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón NKM al pellet. A continuación, añada 50 microlitros de FITC-PSA, dos microlitros de JC-1 y tres microlitros de PI. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.Centrifugar a 1.000 g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 40 microlitros de tampón NKM. A continuación, transfiera 10 microlitros de la muestra a un portaobjetos de vidrio.Difuminar la muestra y añadir un cubreobjetos. Después de esto, comience inmediatamente a visualizar la muestra por microscopía de epifluorescencia con un objetivo 40X y un filtro triple como se describe en el protocolo de texto, utilizando una cámara digital para capturar una imagen separada para cada filtro. Utilice la opción de fusión en el software de la cámara para combinar las tres imágenes recibidas de los filtros, guardando el nuevo archivo en formato JPEG.Abra la imagen combinada con la herramienta de pintura y utilice la opción de pincel para marcar el espermatozoide. A continuación, clasificar los espermatozoides en función de la fluorescencia emitida por cada sonda, asegurándose de evaluar al menos 200 espermatozoides por diapositiva. Todas las celdas deben aparecer azules desde el DAPI.Contar las células muertas, que parecen púrpuras, para evaluar la viabilidad. A continuación, utilice los patrones de tinción de fluorescencia para evaluar el estado del acrosoma. Por último, evaluar el potencial de la membrana mitocondrial mediante la distinción de los espermatozoides con alto potencial de membrana mitocondrial que exhiben una mitad teñida de rojo de los espermatozoides con bajo potencial de membrana mitocondrial que exhiben una mitad teñida de verde.Cuente las piezas medias rojas y verdes por separado y calcule su relación. Para comenzar la evaluación de la integridad de la membrana plasmática, tome el número deseado de pozos del kit de viabilidad y concentración. Transfiera los pozos a la base de trabajo y cúbralos con una tapa flexible para protegerlos de la luz.Añadir 199 microlitros de solución tamponada para la citometría a cada pozo. Luego agregue un microlitro de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar por pipeteo. Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos.Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando el ajuste de viabilidad. Para comenzar a evaluar el potencial de la membrana mitocondrial, saque el número deseado de pozos del kit de actividad mitocondrial. Transfiéralos a la base de trabajo.Añadir 10 microlitros de etanol absoluto a cada pozo y utilizar una pipeta para resuspender el polvo presente dentro del pozo. Añadir 190 microlitros de PBS por pozo y homogeneizar por pipeteo. Añadir 0,75 microlitros de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar mediante pipeteo.Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando el ajuste de actividad mitocondrial. Para comenzar a evaluar la integridad de la membrana acrosomal, saque el número deseado de pozos del kit de viabilidad e integridad acrosome.Transfiera los pozos a la base de trabajo y cúbralos con una tapa flexible para protegerlos de la luz. Añadir 200 microlitros de solución almacenada en búfer para la citometría a cada pozo. Luego agregue 0,7 microlitros de semen homogéneo a una concentración de 57 millones de células por mililitro a cada pozo y homogeneizar por pipeteo.Cubra la placa con la tapa e incubar a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Después de esto, ejecute la muestra a través del citometro de flujo utilizando la configuración de información. En este estudio, la calidad del semen se evalúa utilizando diferentes técnicas, una de las cuales evaluó las membranas espermáticas utilizando sondas fluorométricas.Es posible evaluar las diferencias en la calidad de la muestra de espermatozoides en términos de integridad de la membrana. Por ejemplo, la eyaculación del toro número siete tenía un porcentaje relativamente bajo de células muertas, una baja proporción de espermatozoides con acrosoma pseudo-reaccionado y un mayor potencial de membrana mitocondrial en comparación con la eyaculación del toro número uno. A continuación, se evalúan las muestras para detectar la viabilidad y la actividad mitocondrial.Los histogramas de estos ejemplos representativos representan los espermatozoides no cerrados y los desechos y los espermatozoides cerrados. Estos histogramas también representan las células viables y muertas y la distribución de espermatozoides a membrana mitocondrial polarizada y despolarizada. La integridad del acromos se evalúa con un kit listo para usar y se lee con citometría de flujo, dividiendo el área en tres áreas marcadoras que representan células fluorescentes bajas insignificantes con acrooma intacto no manchado, células fluorescentes bajas con parte residual manchada del acrooma, y células altamente fluorescentes con acrooma alterado.Al intentar estos procedimientos, es importante asegurarse de preparar correctamente la muestra inicial de espermatozoides. Estas técnicas pueden proporcionar información sobre la evaluación de la calidad de los espermatozoides y se pueden aplicar a diversos organismos como bovino, aves de corral y humanos. La comparación entre las dos técnicas, la tinción cuádruple y la citometría de flujo indicaron que no había diferencias significativas para la viabilidad, el potencial de membrana mitocondrial y la integridad del acrooma que revelaba que las dos técnicas producían resultados coincidentes.

Research

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Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Manejo y tratamiento del hombre europeo anguilas (Anguilla anguilla) de maduración Hormonal y criopreservación de esperma

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Medición de la orientación y la motilidad del esperma dentro del tracto reproductivo de la Caenorhabditis elegans hermafrodita

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization

Evaluación del Estado de Fertilización mediante el seguimiento de la morfología nuclear de los espermatozoides en la doble fertilización de Arabidopsis

Flowering plants have a unique sexual reproduction system called &#8216;double fertilization&#39;,&#160;in which each of the sperm cells precisely fuses ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Aplicación de células madre embrionarias haploides partegenéticas del ratón como sustituto de los espermatozoides

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...