Name: large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Gli autori ringraziano il gruppo di Heedeok Hong presso il dipartimento di chimica, Michigan State University, per gentilmente fornire le cellule di Escherichia coli per gli esperimenti. Gli autori ringraziano il sostegno del National Institute of General Medical Sciences, il National Institutes of Health (NIH) attraverso Grant R01GM118470 (per X. Liu) e Grant R01GM125991 (al L. sole e X. Liu).

1. preparazione del rivestimento di LPA sulla parete interna del capillare separazione
<ol><li>
Pretrattamento del capillare
	<ol>
<li>Svuotare un capillare di silice fusa (120 cm di lunghezza, 50 µm di diametro interno [ID], 360 µm di diametro esterno [od]) successivamente con 500 µ l di 1 M di idrossido di sodio, acqua deionizzata, acido cloridrico 1M, acqua deionizzata e LC-MS metanolo utilizzando una pompa a siringa.</li>
		<li>Asciugare il capillare con gas azoto (10 psi, ≥ 12 h) e riempire i...

<ol>
	<li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+proteoforms+are+there.">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics.">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li><li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome:+Membrane+Proteins,+Mitochondria,+and+Senescence.">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy.">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li><li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms.">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li><li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Zone+Electrophoresis.">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li><li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism.">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes.">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests.">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li><li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Mu&#241;oz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry.">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li><li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry.">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li><li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis.">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li><li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+strong+cation+exchange+monolith,+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution,+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes.">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+10,000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry.">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li><li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li><li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction.">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li><li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics:+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast.">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry.">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li><li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms.">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li><li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry:+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis.">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li><li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+(SCARAFT)+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry.">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries,+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry.">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li><li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. 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V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis.">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li><li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry.">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li><li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation.">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li></ol>

Qui forniamo un protocollo dettagliato per utilizzare CZE-MS/MS per la caratterizzazione ad alta risoluzione di proteoforms nei campioni della proteina semplice e per l'identificazione su grande scala di proteoforms in campioni complessi proteoma. Nella Figura 1è riportato un diagramma del sistema CZE-ESI-MS/MS. Ci sono quattro passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, la preparazione del rivestimento di LPA di alta qualità sulla parete interna della separazione capillare è estrema...

Top-down proteomica (TDP) si propone per la caratterizzazione su larga scala di proteoforms all'interno di un proteoma. TDP si basa sulla separazione liquido-fase effettiva di proteine intatte prima dell'analisi electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (ESI-MS/MS) a causa dell'elevata complessità e grande concentrazione gamma dinamica del proteoma1,2 ,3,4,5. L'elettroforesi capillare zonale (CZE) è una tecnica potente per la separazione di biomolecole basato sul loro rapporto dimensione-a-carica6. CZE è relativamente semplice, che richiede solo un'aperta tubolare fusi con silice capillare, un elettrolita di sfondo (BGE) e un alimentatore. Un campione di proteine intatte possa essere caricato in capillare mediante pressione o tensione e separazione viene avviato immergendo entrambe le estremità del capillare nel BGE e applicando una tensione elevata. CZE possibile approccio ultra-alta efficienza di separazione (> 1 milione piastre teoriche) per la separazione di biomolecole7. CZE-MS ha una sensibilità maggiore drasticamente rispetto ampiamente usato cromatografia liquida a fase inversa (RPLC)-MS per l'analisi di proteine intatte8. Anche se CZE-MS ha un grande potenziale per su larga scala discendente proteomica, sua ampia applicazione in proteomica ha stato ostacolato da diversi problemi, tra cui una bassa capacità di caricamento del campione e la finestra stretta separazione. Il campione tipico volume in CZE di carico è di circa l'1% del volume totale capillare, che di solito corrisponde a meno di 100 nL9,10,11. La finestra di separazione di CZE è solitamente meno di 30min a causa della forte elettroosmotico flusso (EOF)9,10. Questi problemi limitano il CZE-MS/MS per l'identificazione di un gran numero di proteoforms e proteoforms basso abbondante da un complesso proteome.
Molto sforzo è stato fatto per migliorare il volume di CZE tramite campioni online concentrazione metodi (ad esempio, solid-phase microextraction [SPME]12,13, campo-migliorato campione d'impilamento [FESS]9 di carico del campione , 11 , 14e dinamico pH junction15,16,17,18). È più semplice di SPME, richiedendo solo una differenza significativa tra il tampone e il BGE in conducibilità e pH FESS e dinamico pH junction. FESS impiega un tampone con molto minore conducibilità di BGE, portando a un accatastamento di analiti sul confine tra la zona di esempio e la zona BGE nel capillare. Giunzione pH dinamico utilizza una spina di esempio di base (ad es., bicarbonato di ammonio 50 mM, pH 8) e un acido BGE (ad es., acido acetico 5% [v/v], pH 2.4) su entrambi i lati della spina del campione. Su richiesta di un'alta tensione positiva alla fine iniezione del capillare, titolazione della spina esempio base si verifica, messa a fuoco gli analiti in una spina stretta prima di subire una separazione CZE. Recentemente, il gruppo di sole sistematicamente rispetto FESS e giunzione pH dinamico per l'impilamento online di proteine intatte, dimostrando quella giunzione pH dinamico potrebbe produrre prestazioni decisamente migliori rispetto a FESS per la concentrazione online di proteine intatte quando il volume di iniezione del campione era 25% del volume totale capillare19.
Capillari di separazione neutro rivestiti (ad es., poliacrilammide lineare [LPA]) sono stati impiegati per ridurre l'EOF nel capillare, rallentando la separazione CZE e ampliando la separazione finestra20,21. Recentemente, il gruppo Dovichi sviluppato una procedura semplice per la preparazione del rivestimento di LPA stabile sulla parete interna dei vasi capillari, che utilizzano ammonio persolfato (APS) come l'iniziatore e la temperatura (50 ° C) per la produzione di radicali liberi e polimerizzazione22 . Molto recentemente, il gruppo di sole impiegava la separazione rivestite con LPA capillare e il metodo di giunzione pH dinamico per la separazione di CZE di proteine intatte, raggiungendo un volume e una finestra di separazione 90 min19di carico del campione di microliter-scala. Questo sistema CZE apre la porta all'utilizzo di CZE-MS/MS per su larga scala discendente proteomica.
CZE-MS richiede un'interfaccia altamente robusta e sensibile alla coppia CZE a MS. Tre interfacce di CE-MS sono stati ben sviluppati e commercializzati nella storia della CE-MS, e sono la guaina co-axial-flow interfaccia23, l'interfaccia sheathless utilizzando una punta porosa come il ESI emettitore24e la electro-cineticamente guaina pompato flusso interfaccia25,26. La guaina-flow-interfaccia-based electro-cineticamente pompata CZE-MS/MS ha raggiunto un limite di basso zeptomole peptide rilevamento9, oltre 10.000 identificazioni del peptide (IDs) dal HeLa delle cellule proteoma in una singola eseguita14, una caratterizzazione veloce di proteine intatte11e le analisi altamente stabile e riproducibile di biomolecole26. Recentemente, il capillare di separazione LPA-rivestito, il metodo di giunzione pH dinamico e l'interfaccia di flusso elettro-cineticamente pompato guaina sono stati utilizzati per su larga scala discendente proteomica un proteoma di Escherichia coli (Escherichia coli)19 ,27. La piattaforma CZE-MS/MS si avvicinò oltre 500 proteoform ID in una singola esecuzione19 e quasi 6.000 proteoform ID tramite accoppiamento con cromatografia di esclusione dimensionale (SEC)-RPLC frazionamento27. I risultati mostrano chiaramente la capacità di CZE-MS/MS per proteomica su larga scala di alto verso il basso.
Qui, una procedura dettagliata dell'utilizzo di CZE-MS/MS per su larga scala discendente proteomica è descritto. CZE-MS/MS il sistema impiega il capillare LPA-rivestito per ridurre il EOF nel capillare, il metodo di giunzione pH dinamico per la concentrazione delle proteine, l'interfaccia di flusso guaina electro-cineticamente pompato per l'accoppiamento CZE per MS, un orbitrap online massa spettrometro per la raccolta degli spettri MS e MS/MS di proteine e un software TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificazione e caratterizzazione) per ricerca ID tramite database proteoform.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Fused silica capillary</td>
			<td style="width:117px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:147px;">1068150017</td>
			<td style="width:355px;">50 &#181;m i.d. 360 &#181;m o.d.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:117px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">7708-10</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LC-MS grade water</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SA48-1</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methanol</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A456-4</td>
			<td>Toxic, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M6514</td>
			<td>Moisture and heat sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">423805000</td>
			<td>Highy toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">164855000</td>
			<td>Toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A3678</td>
			<td>Health hazard, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">lysozyme</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Myoglobin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#223;-casein</td>
			<td style="width:117px;">Sgma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Carbonic anhydrase</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C3934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Urea</td>
			<td style="width:117px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:147px;">36428-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D0632</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">AC122270250</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A117-50</td>
			<td>Corrosive, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">C4 trap column</td>
			<td style="width:117px;">Sepax Technologies</td>
			<td style="width:147px;">110043-4001C</td>
			<td>3 &#181;m particles, 300 &#197; pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A998SK-4</td>
			<td>Toxic, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">1066-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Nalgene rapid-flow filters</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">126-0020</td>
			<td>0.2 &#181;m CN membrane, and 50 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">E. coli cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>K-12 MG1655</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">BCA assay</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">23250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A11-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HPLC system for protein desalting</td>
			<td style="width:117px;">Agilient</td>
			<td style="width:147px;">1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CE autosampler</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;">ECE-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Electro-kinetically pumped sheath flow interface</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sutter flaming/brown micropipette puller</td>
			<td style="width:117px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ultrasonic cell disruptor for cell lysis</td>
			<td style="width:117px;">Branson</td>
			<td align="right" style="width:147px;">101063196</td>
			<td>Model S-250A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Vaccum concentrator</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry

Zona capillare elettroforesi-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (CZE-ESI-MS/MS) è stata riconosciuta come uno strumento utile per proteomica di top-down che mira a caratterizzare proteoforms nel complessi proteomi. Tuttavia, l'applicazione di CZE-MS/MS per su larga scala discendente proteomica è stato ostacolato dalla scarsa capacità di caricamento del campione e stretta finestra di separazione di CZE. Qui, un protocollo è descritto usando CZE-MS/MS con un volume di caricamento del campione microliter-scala e una finestra di separazione 90 min per proteomica su larga scala di alto verso il basso. La piattaforma CZE-MS/MS è basata su un lineare poliacrilammide (LPA)-rivestito separazione capillare con flusso elettroosmotico estremamente basso, un metodo di concentrazione dinamica campioni online basati su pH-giunzione ad alta efficienza per l'impilamento della proteina, un interfaccia di flusso CE-MS Electro-cineticamente pompato guaina con sensibilità estremamente elevata e un trappola ionica spettrometro di massa ad alta risoluzione di massa e velocità di scansione. La piattaforma può essere utilizzata per la caratterizzazione ad alta risoluzione dei campioni semplice della proteina intatta e la caratterizzazione su larga scala di proteoforms in vari complessi proteomi. Ad esempio, una separazione altamente efficiente di una miscela di proteine standard e una rivelazione altamente sensibile di molte impurità utilizzando la piattaforma è dimostrata. Come altro esempio, questa piattaforma in grado di produrre oltre 500 proteoform ed eseguire 190 identificazioni di proteina da un proteoma di Escherichia coli in una singola CZE-MS/MS.

La figura 1 Mostra un diagramma del sistema dinamico di basati su pH-giunzione CZE-ESI-MS utilizzato nell'esperimento. Una lunga spina del campione in un buffer di base viene iniettata in una separazione rivestite con LPA capillare riempita con un acido BGE. Dopo l'applicazione di alte tensioni I e II, gli analiti nella zona di esempio sarà concentrato tramite il metodo di giunzione pH dinamico. Per valutare le prestazioni del sistema CZE-MS, una mi...

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Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Proteomica di Top-down su larga scala usando la spettrometria totale in Tandem elettroforesi capillare zona

Un protocollo dettagliato è descritto per la separazione, identificazione e caratterizzazione di proteoforms nei campioni della proteina mediante capillare zonale elettroforesi-electrospray ionizzazione-spettrometria di massa (CZE-ESI-MS/MS). Il protocollo può essere utilizzato per la caratterizzazione ad alta risoluzione di proteoforms nei campioni della proteina semplice e l'identificazione su grande scala di proteoforms in campioni complessi proteoma.

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Questo metodo può aiutare a migliorare la caratterizzazione su larga scala e ad alta risoluzione delle isoforme proteiche e delle modifiche post-trascizionali delle proteine nelle cellule. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la spettrometria di massa dell'elettroforesi a zona capillare offre una separazione altamente efficiente e un rilevamento altamente sensibile di proteine intatte. Per pre-trattare il capillare, asciugarlo con gas azoto a 10 psi per almeno 12 ore.Quindi, riempire il capillare con il 50% volume per volume di metacrilato di 3-propile in metanolo utilizzando una pompa per siringhe. Sigillare entrambe le estremità del capillare con gomma silicea. Dopo aver incubato a temperatura ambiente per almeno 24 ore, continuare con un rivestimento lineare in poliacrilammide sulla parete interna del capillare di separazione, come descritto nel protocollo di testo.Bruciare una porzione del capillare utilizzando una fiamma delicata per rimuovere il rivestimento esterno in poliammide a circa quattro centimetri di distanza da un'estremità del capillare. Pulire delicatamente la porzione bruciata del capillare pulendo per rimuovere completamente il rivestimento in poliammide. Praticare un piccolo foro alla fine di un tubo da 200 microliter delle stesse dimensioni del diametro esterno capillare per mantenere sufficientemente il capillare in posizione una volta infilato attraverso questo foro.Infilare l'estremità del capillare che è vicino alla porzione bruciata attraverso il foro fino a quando la porzione bruciata non è nel tubo. Quindi, aggiungere circa 150 microlitri di HF al tubo da 200 microlitri in modo che la soluzione HF sia circa a metà della porzione bruciata sul capillare. Incubare il capillare nella soluzione HF a temperatura ambiente per 90-100 minuti.Preparare la miscela proteica standard e il campione E.coli come descritto nel protocollo di testo. Per impostare l'elettroforesi della zona capillare, o sistema CZE, caricare il campione, l'elettrolita di fondo e il capillare di separazione nell'autocampatore CZE. Selezionare il carico di esempio nella pagina di controllo manuale del campionatore automatico CZE.Caricare il flaconcino elettrolita di sfondo nel vassoio tampone del campionatore automatico, notandone la posizione nel vassoio tampone. Quindi, caricare il flaconcino campione nel vassoio campione del campionatore automatico, notandone la posizione nel vassoio del campione. Posizionare il campionatore automatico nella posizione di allineamento utilizzando il controllo manuale.Ora, caricare il capillare di separazione nell'autocampcampatore CZE utilizzando l'estremità non incisa del capillare. Regolare l'altezza dell'estremità di iniezione del capillare se il volume del campione è inferiore a 50 microlitri. Passare al campionatore automatico in standby utilizzando il controllo manuale.Digitare la posizione del campione nel sistema e spostare il capillare nel campione. Spingere l'estremità di iniezione del capillare più in basso per raggiungere il fondo del flaconcino campione. Continuando a utilizzare il controllo manuale, sciacquare il capillare con l'elettrolita di fondo per 20 minuti utilizzando una pressione di 20 psi.Ora, monta un'interfaccia commerciale a flusso di focaia pompata elettrocineticamente nella parte anteriore dello spettrometro di massa. Riempire il serbatoio del tampone di karifica con un tampone contenente il 10% di metanolo volume-volume e lo 0,2% di acido formico volume-volume in acqua di grado LCMS. Sciacquare la T nell'interfaccia con il tampone della tona attraverso l'applicazione manuale della pressione con una siringa.Infilare l'estremità del diametro esterno di un millimetro di un emettitore elettrospray attraverso un tubo a maniche e collegare l'emettitore con una porta della T tramite un raccordo. Basta sciacquare manualmente la T con una siringa per riempire l'emettitore con il tampone della torcia. Regolare la distanza tra l'orifizio dell'emettitore e l'ingresso dello spettrometro di massa a circa due millimetri con l'aiuto della fotocamera che è arrivata con l'interfaccia.Applicare una tensione da due a 2,2 kilovolt alla fiala tampone di sheath per elettrospray. Quindi, regolare la tensione di spruzzatura per raggiungere un elettrospray stabile. Applicare una bassa pressione all'estremità di iniezione del capillare durante questo processo per assicurarsi che non ci siano bolle nel capillare.Spegnere la tensione di spruzzatura e infilare delicatamente l'estremità incisa del capillare di separazione attraverso la T nell'emettitore fino a quando non può essere spinta oltre. Dopo aver fermato la bassa pressione all'estremità di iniezione del capillare, sciacquare un po 'l'emettitore con tampone di torcia. Ancora una volta, applicare da due a 2,2 kilovolt di tensione di spruzzatura per testare lo spray.Selezionate un nuovo metodo nel menu a discesa file nella schermata principale dello strumento. Lì, selezionare l'ingresso come flaconcino del campione iniziale, il flaconcino del campione finale, il vassoio come campione, la pressione come cinque psi, i kilovolt come zero e la durata come 95 secondi per un'iniezione del campione. Quindi, impostare l'ingresso come fiala di ingresso, vassoio come tampone, pressione come zero psi, kilovolt come 30 e durata come 4.200 secondi per la separazione del campione standard di miscela proteica.Per la separazione del campione di proteoma E.coli, impostare l'ingresso come flaconcino di ingresso, vassoio come tampone, pressione come psi zero, kilovolt come 20 e durata come 6.600 secondi. Infine, selezionare l'ingresso come flaconcino di ingresso, vassoio come tampone, pressione come 10 psi, kilovolt come 30 e durata come 600 secondi per lo sciacquone capillare. Ora, imposta i parametri MS e MS /MS per l'analisi delle proteine intatte utilizzando uno spettrometro a maschera di trappola ionica quadrupla.Per regolare le impostazioni del file di sintonizzazione, attivare la modalità proteina intatta e utilizzare una pressione di abbondanza pari a 0,2. Impostare la temperatura capillare di trasferimento ionico a 320 gradi Celsius e il livello RF dell'obiettivo S su 55. Per eseguire l'esperimento MS/MS CZE, avviare il metodo di acquisizione dei dati nel computer dello spettrometro di massa, selezionando innanzitutto la sequenza di esecuzione.Quindi, avviare la sequenza di elettroforesi capillare sul computer autocampcampatore di elettroforesi capillare. Eseguire una ricerca nel database con TopPIC nella suite TopPIC e nell'interfaccia utente grafica TopPIC. Fare clic sul file di database e selezionare un database appropriato per la ricerca.Fare clic sul file di spettro e selezionare l'ms2 generato. msalign generato come input. Selezionate il file di funzionalità MS1 e scegliete il file di funzionalità generato.Impostare la cisteina carbamidometile C57 come modifica fissa a causa del trattamento con iodoacetamide. Selezionare la funzionalità del database di esca e, in Impostazioni di taglio, selezionare la velocità di individuazione falsa nel menu a discesa accanto al livello dello spettro. Impostare la velocità di individuazione falsa su 0,01 a livello di spettro.Lasciare la funzione generatrice deselezionata e impostare la tolleranza di errore su 15 parti per milione. Impostare la velocità di individuazione false su 0,05 a livello di proteoforma. In Parametri avanzati, selezionate due per il numero massimo di spostamenti di massa nel menu a discesa.Impostare lo spostamento massimo di massa di modifiche sconosciute su 500 dalton. Lasciare tutti gli altri parametri ai valori predefiniti e fare clic sul pulsante start in basso a destra dell'interfaccia utente grafica. Viene mostrato l'elettroferogramma rappresentativo per la miscela proteica standard.La miscela proteica standard viene tipicamente eseguita almeno in duplice copia per valutare l'efficienza di separazione e la riproducibilità del sistema. L'efficienza di separazione può essere valutata con il numero di placche teoriche di alcune proteine. La riproducibilità può essere valutata dalle deviazioni standard relative dell'intensità proteica e del tempo di migrazione.La piattaforma CZE MS/MS può essere utilizzata per la caratterizzazione su larga scala di proteoforme in vari proteomi complessi, identificando oltre 500 proteoformi e 190 proteine da un proteoma E.coli in una singola corsa ad alta confidenza. Qui, una vista ingrandita dell'elettroferogramma può essere utilizzata per valutare la finestra di separazione del sistema. Il bassissimo valore E e l'FDR spettrale suggeriscono l'elevata confidenza dell'ID proteoforme.L'elevato numero di ioni frammenti abbinati indica ulteriormente l'elevata confidenza dell'ID.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di infilare il capillare di separazione inciso nell'emettitore elettrospray lentamente e delicatamente.L'etichettatura stabile degli isotopi o i metodi senza etichette possono essere incorporati nella procedura CZE MS per determinare come l'abbondanza proteoforme cambia nelle cellule in varie condizioni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della proteomica dall'alto verso il basso per esplorare i ruoli delle proteoforme nella regolazione di vari processi biologici nelle cellule. Non dimenticare che lavorare con acido fluoridrico può essere estremamente pericoloso e precauzioni come adeguati dispositivi di protezione individuale e avere procedure di emergenza in atto dovrebbero sempre essere prese quando si esegue questa procedura.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

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Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

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Impostazione della spettrometria di massa al plasma accoppiata capillare (CE-ICP-MS) per la quantificazione delle specie di iron Redox (Fe(II), Fe(III))

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Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

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