Name: large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Los autores agradecen a grupo de Heedeok Hong en el Departamento de química, Universidad Estatal de Michigan, por proporcionar amablemente las células de Escherichia coli para los experimentos. Los autores agradecen el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General, los institutos nacionales de salud (NIH) a través de Grant R01GM118470 (a X. Liu) y Grant R01GM125991 (a l el sol y X. Liu).

1. preparación de la capa de LPA en la pared interior del tubo capilar de separación
<ol><li>
Tratamiento previo del tubo capilar
	<ol>
<li>Ras un capilar de sílice fundida (120 cm de longitud, 50 μm en diámetro interno [identificación], 360 μm en diámetro exterior [verde oliva]) con 500 μl de hidróxido de sodio de 1 M, agua desionizada, 1 M de ácido clorhídrico, agua desionizada y LC-MS metanol de grado usando una bomba de jeringa.</li>
		<li>Secar el capilar con el gas del nitrógeno (10 ...

<ol>
	<li>Aebersold, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+proteoforms+are+there.">How many proteoforms are there.</a> Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics.">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).</li><li>Catherman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Top-down+Proteomics+of+the+Human+Proteome:+Membrane+Proteins,+Mitochondria,+and+Senescence.">Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).</li><li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Proteomics+of+Large+Proteins+up+to+223+kDa+Enabled+by+Serial+Size+Exclusion+Chromatography+Strategy.">Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy.</a> Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).</li><li>Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Top-Down+Proteomics+and+the+Analysis+of+Proteoforms.">Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).</li><li>Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Zone+Electrophoresis.">Capillary Zone Electrophoresis.</a> Science. 222 (4621), 266-272 (1983).</li><li>Keithley, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+electrophoresis+with+three-color+fluorescence+detection+for+the+analysis+of+glycosphingolipid+metabolism.">Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism.</a> Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-Line+Separation+by+Capillary+Electrophoresis+Prior+to+Analysis+by+Top-Down+Mass+Spectrometry+Enables+Sensitive+Characterization+of+Protein+Complexes.">In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+and+Fast+Bottom-up+Analysis+of+Femtogram+Amounts+of+Complex+Proteome+Digests.">Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).</li><li>Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Mu&#241;oz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Peptide+Detection+Toward+Single-Neuron+Proteomics+by+Reversed-Phase+Fractionation+Capillary+Electrophoresis+Mass+Spectrometry.">Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).</li><li>Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+Top-Down+Intact+Protein+Characterization+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization+Tandem+Mass+Spectrometry.">Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).</li><li>Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+comprehensiveness+and+sensitivity+of+sheathless+capillary+electrophoresis-tandem+mass+spectrometry+for+proteomic+analysis.">Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).</li><li>Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+strong+cation+exchange+monolith,+integrated+with+capillary+zone+electrophoresis+and+coupled+with+pH+gradient+elution,+produces+improved+sensitivity+and+numbers+of+peptide+identifications+during+bottom-up+analysis+of+complex+proteomes.">Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over+10,000+peptide+identifications+from+the+HeLa+proteome+by+using+single-shot+capillary+zone+electrophoresis+combined+with+tandem+mass+spectrometry.">Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).</li><li>Aebersold, R., Morrison, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dilute+peptide+samples+by+capillary+zone+electrophoresis.">Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis.</a> Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).</li><li>Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Focusing+of+Catecholamines+and+Weakly+Acidic+Compounds+by+Capillary+Electrophoresis+Using+a+Dynamic+pH+Junction.">Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction.</a> Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).</li><li>Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+Capillary+Zone+Electrophoresis+to+a+Q+Exactive+HF+Mass+Spectrometer+for+Top-down+Proteomics:+580+Proteoform+Identifications+from+Yeast.">Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast.</a> Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-Up+Proteomics+of+Escherichia+coli.+Using+Dynamic+pH+Junction+Preconcentration+and+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry.">Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).</li><li>Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Shot+Top-Down+Proteomics+with+Capillary+Zone+Electrophoresis-Electrospray+Ionization-Tandem+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nearly+600+Escherichia+coli+Proteoforms.">Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms.</a> Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).</li><li>Busnel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+capacity+capillary+electrophoresis-electrospray+ionization+mass+spectrometry:+coupling+a+porous+sheathless+interface+with+transient-isotachophoresis.">High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).</li><li>Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Confined+Aqueous+Reversible+Addition-Fragmentation+Chain+Transfer+(SCARAFT)+Polymerization+Method+for+Preparation+of+Coated+Capillary+Leads+to+over+10+000+Peptides+Identified+from+25+ng+HeLa+Digest+by+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry.">Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).</li><li>Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally-initiated+free+radical+polymerization+for+reproducible+production+of+stable+linear+polyacrylamide+coated+capillaries,+and+their+application+to+proteomic+analysis+using+capillary+zone+electrophoresis-mass+spectrometry.">Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry.</a> Talanta. 146, 839-843 (2016).</li><li>Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Electrospray+Ionization+Interface+for+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry.">Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).</li><li>Moini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+CE-MS+Operation.+2.+Interfacing+Low-Flow+Separation+Techniques+to+Mass+Spectrometry+Using+a+Porous+Tip.">Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip.</a> Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).</li><li>Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+capillary+electrophoresis+nanospray+sheath-flow+interface+for+high+efficiency+and+sensitive+peptide+analysis.">Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).</li><li>Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Third-Generation+Electrokinetically+Pumped+Sheath-Flow+Nanospray+Interface+with+Improved+Stability+and+Sensitivity+for+Automated+Capillary+Zone+Electrophoresis-Mass+Spectrometry+Analysis+of+Complex+Proteome+Digests.">Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests.</a> Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).</li><li>McCool, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Top-Down+Proteomics+Using+Capillary+Zone+Electrophoresis-Tandem+Mass+Spectrometry:+Identification+of+5700+Proteoforms+from+the+Eschericia+coli+Proteome.">Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).</li><li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProteoWizard:+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development.">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li><li>Kou, Q., Xun, L., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopPIC+:+a+software+tool+for+top-down+mass+spectrometry-based+proteoform+identification+and+characterization.">TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization.</a> Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).</li><li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry.">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li><li>Ansong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+proteomics+reveals+a+unique+protein+S-thiolation+switch+in+Salmonella+Typhimurium+in+response+to+infection-like+conditions.">Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+ultrahigh-pressure+long+column+reversed-phase+liquid+chromatography+for+top-down+proteomics.">High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics.</a> Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-energy+C-trap+dissociation+for+peptide+modification+analysis.">Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.</a> Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).</li><li>Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+protein+sequence+analysis+by+electron+transfer+dissociation+mass+spectrometry.">Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).</li><li>Shaw, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+Protein+Characterization+Using+Top-Down+Mass+Spectrometry+and+Ultraviolet+Photodissociation.">Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).</li></ol>

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para utilizar CZE-MS/MS para la caracterización de alta resolución de proteoforms en las muestras de proteína simple y para la identificación a gran escala de proteoforms en muestras complejas del proteoma. En la figura 1muestra un diagrama del sistema CZE-ESI-MS/MS. Hay cuatro pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la preparación de recubrimiento de alta calidad LPA en la pared interior de separación capilar es muy importante. Una...

Proteómica de arriba hacia abajo (TDP) tiene como objetivo para la caracterización a gran escala de proteoforms dentro de un proteoma. TDP se basa en la separación de fase líquida efectiva de proteínas intactas antes de análisis de electrospray spectrometry total en tándem de ionización (ESI-MS/MS) debido a la alta complejidad y un rango dinámico de gran concentración del proteoma1,2 ,3,4,5. Electroforesis capilar de zona (CZE) es una técnica poderosa para la separación de biomoléculas basados en sus relaciones de tamaño de la carga6. CZE es relativamente simple, requiriendo sólo un abierto tubular fundido silicona capilar, un electrolito de fondo (BGE) y una fuente de alimentación. Una muestra de proteínas intactas se puede cargar en el capilar mediante presión o tensión, y separación se inicia sumergiendo ambos extremos del tubo capilar en el BGE y aplicando un alto voltaje. CZE puede acercarse a ultra alta eficacia de separación (> 1 millón de platos teóricos) para la separación de biomoléculas7. CZE-MS tiene una sensibilidad considerablemente mayor que la cromatografía líquida de fase inversa utilizada (RPLC)-MS para el análisis de proteínas intactas8. Aunque CZE-MS tiene un gran potencial para gran escala proteómica de arriba hacia abajo, su amplia aplicación en la proteómica ha sido impedido por varios asuntos, incluyendo una baja capacidad de carga de muestra y separación estrecha ventana. La muestra típica carga de volumen en CZE es alrededor del 1% del total del volumen capilar, que corresponde generalmente a menos de 100 nL9,10,11. La ventana de separación de CZE es generalmente menos de 30 minutos debido a la fuerte electroosmotic flujo (EF)9,10. Estos problemas limitan el CZE-MS/MS para la identificación de un gran número de proteoforms y bajo proteoforms abundante de un proteoma complejo.
Se ha realizado mucho esfuerzo para mejorar la muestra de carga volumen de CZE via online muestra concentración métodos (e.g., microextracción en fase sólida [SPME]12,13, muestra mayor campo apilando [tarifas]9 , 11 , 14y pH dinámico salida15,16,17,18). FESS y cruce de pH dinámicos son más simples que la SPME, requiriendo sólo una diferencia significativa entre el tampón y el BGE en conductividad y pH. FESS emplea un tampón con mucho menor conductividad que el BGE, llevando a un apilamiento de analitos en el límite entre la zona de muestra y la zona BGE en el capilar. Cruce de pH dinámica utiliza un enchufe básico muestra (p. ej., bicarbonato de amonio 50 mM, pH 8) y un ácido BGE (p. ej., ácido acético al 5% [v/v], pH 2.4) a ambos lados de la toma de muestra. Aplicación de un alto voltaje positivo al final de la inyección del tubo capilar, valoración de la toma de la muestra básica ocurre, concentrando los analitos en un tapón apretado antes de someterse a una separación de CZE. Recientemente, el grupo sol sistemáticamente en comparación con FESS y cruce de pH dinámico para el apilamiento en línea de proteínas intactas, demostrar ese cruce de pH dinámica podría producir mucho mejor rendimiento que las tarifas para la línea concentración de proteínas intactas cuando el volumen de inyección de muestra fue de 25% del volumen capilar total19.
Separación neutral revestido capilares (p. ej., poliacrilamida lineal [LPA]) han sido empleados para reducir la EF en los capilares, ralentizando la separación CZE y ampliar la ventana de separación20,21. Recientemente, el grupo de primaria desarrollado un procedimiento simple para la preparación de la capa estable de LPA en la pared interior de los capilares, utilizando persulfato de amonio (APS) como el iniciador y la temperatura (50 ° C) para la producción de radicales libres y polimerización22 . Muy recientemente, el grupo sol emplea la separación recubierto de LPA capilar y el método de cruce de pH dinámico para la separación de CZE de proteínas intactas, llegando a una muestra de microlitro escala carga de volumen y una separación de 90 min ventana19. Este sistema CZE abre la puerta al uso de CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo.
CZE-MS requiere una interfaz altamente robusta y sensible a pareja CZE a MS. Tres interfaces de CE-MS han sido bien desarrollados y comercializados en la historia de la EM de la CE, y son la vaina co-axial-flow interfaz23, la interfaz de sheathless usando una punta porosa como el ESI emisor24y el electro-cinéticamente bombeado de la envoltura de flujo interfaz25,26. El electro-cinéticamente bombeada vaina-flujo-basada en interfaz CZE-MS/MS ha alcanzado una baja zeptomoles péptido detección límite9, más 10.000 identificaciones del péptido (IDs) de la HeLa proteoma en un solo funcionamiento14, una caracterización rápida de la célula de proteínas intactas11y muy estables y reproducibles de análisis de biomoléculas26. Recientemente, el capilar de separación LPA-revestido, el método de cruce de pH dinámico y la interfaz de flujo de bombeo electro-cinéticamente vaina fueron destinados a gran escala proteómica de arriba hacia abajo de un proteoma de Escherichia coli (e. coli)19 ,27. La plataforma de CZE-MS/MS acercaron más de 500 proteoform IDs en un solo funcionamiento19 y casi 6.000 proteoform IDs mediante acoplamiento con Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)-TAGATOSA fraccionamiento27. Los resultados demuestran claramente la capacidad de CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo.
En este documento, se describe un procedimiento detallado de usar CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo. El CZE-MS/MS sistema emplea el tubo capilar recubierto de LPA para reducir la EF en el capilar, el método de cruce de pH dinámico para determinar la concentración de proteínas, la interfaz de flujo de electro-cinéticamente bombeado vaina para acoplamiento CZE a MS, un orbitrap en línea masa Espectrómetro para la colección de espectros MS y MS/MS de las proteínas y un software de TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificación y caracterización) para proteoform ID vía búsqueda base de datos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:905px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Fused silica capillary</td>
			<td style="width:117px;">Polymicro Technologies</td>
			<td style="width:147px;">1068150017</td>
			<td style="width:355px;">50 &#181;m i.d. 360 &#181;m o.d.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sodium hydroxide pellets</td>
			<td style="width:117px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:147px;">7708-10</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LC-MS grade water</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td>W6-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SA48-1</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Methanol</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A456-4</td>
			<td>Toxic, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M6514</td>
			<td>Moisture and heat sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">423805000</td>
			<td>Highy toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acrylamide</td>
			<td style="width:117px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:147px;">164855000</td>
			<td>Toxic, health hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium persulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A3678</td>
			<td>Health hazard, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">lysozyme</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cytochrome C</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C7752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Myoglobin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">M1882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#223;-casein</td>
			<td style="width:117px;">Sgma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C6905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Carbonic anhydrase</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">C3934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Urea</td>
			<td style="width:117px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:147px;">36428-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D0632</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Iodoacetamide</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">AC122270250</td>
			<td>Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A117-50</td>
			<td>Corrosive, Health Hazard</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">C4 trap column</td>
			<td style="width:117px;">Sepax Technologies</td>
			<td style="width:147px;">110043-4001C</td>
			<td>3 &#181;m particles, 300 &#197; pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A998SK-4</td>
			<td>Toxic, Oxidizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">1066-33-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Nalgene rapid-flow filters</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">126-0020</td>
			<td>0.2 &#181;m CN membrane, and 50 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">E. coli cells</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td>K-12 MG1655</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:117px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:147px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">BCA assay</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">23250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetone</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A11-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HPLC system for protein desalting</td>
			<td style="width:117px;">Agilient</td>
			<td style="width:147px;">1260 Infinity II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:117px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CE autosampler</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;">ECE-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Electro-kinetically pumped sheath flow interface</td>
			<td style="width:117px;">CMP Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Sutter flaming/brown micropipette puller</td>
			<td style="width:117px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:147px;">P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ultrasonic cell disruptor for cell lysis</td>
			<td style="width:117px;">Branson</td>
			<td align="right" style="width:147px;">101063196</td>
			<td>Model S-250A</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Vaccum concentrator</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SPD131DDA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale top-down proteomics using capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry

Zona capilar electroforesis-electrospray ionización-spectrometry total en tándem (CZE-ESI-MS/MS) ha sido reconocido como una herramienta útil para proteómica de arriba hacia abajo que tiene como objetivo caracterizar proteoforms en proteomas complejos. Sin embargo, la aplicación de CZE-MS/MS para proteómica de arriba hacia abajo a gran escala ha sido impedido por la baja capacidad de carga de muestra y estrecha ventana de separación de CZE. Aquí, se describe un protocolo mediante CZE-MS/MS con un volumen de muestra de carga escala microlitro y una ventana de separación de 90 min para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo. La plataforma de CZE-MS/MS se basa en una poliacrilamida lineal (LPA)-revestido separación capilar con flujo electroosmotic extremadamente bajo, un método de concentración dinámica muestra en línea basado en el cruce de pH con una alta eficiencia para el amontonamiento de proteína, un electro-cinéticamente bombeado vaina flujo CE-MS interfaz con muy alta sensibilidad y un espectrómetro de masas de trampa de iones con alta resolución en masa y velocidad de exploración. La plataforma puede ser utilizada para la caracterización de alta resolución de muestras simple proteína intacta y la caracterización a gran escala de proteoforms en diversos proteomas complejos. Por ejemplo, demuestra una muy eficiente separación de una mezcla de proteína estándar y una detección muy sensible de muchas impurezas utilizando la plataforma. Otro ejemplo, esta plataforma puede producir más de 500 proteoform y 190 identificaciones de proteína de un proteoma de Escherichia coli en un CZE-MS/MS solo ejecutan.

La figura 1 muestra un diagrama del sistema dinámico de basado en el cruce de pH CZE-ESI-MS utilizado en el experimento. Una toma larga de la muestra en un buffer básico se inyecta en una revestido de LPA separación capilar llenada de un ácido BGE. Después de aplicar altos voltajes I y II, los analitos en la zona de la muestra será concentrada por el método de cruce de pH dinámico. Para evaluar el funcionamiento del sistema CZE-MS, por lo gen...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry at JoVE.com

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Se describe un protocolo detallado para la separación, identificación y caracterización de proteoforms en muestras de proteínas utilizando la zona capilar electroforesis-electrospray ionización-spectrometry total en tándem (CZE-ESI-MS/MS). El protocolo puede utilizarse para la caracterización de alta resolución de proteoforms en las muestras de proteína simple y la identificación a gran escala de proteoforms en muestras complejas del proteoma.

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Este método puede ayudar a mejorar la caracterización a gran escala y de alta resolución de las isoformas proteicas y las modificaciones post-traduccionales de proteínas en las células. La principal ventaja de esta técnica es que la espectrometría de masas de electroforesis de zona capilar ofrece una separación altamente eficiente y una detección altamente sensible de proteínas intactas. Para pretratar el capilar, séquelo con gas nitrógeno a 10 psi durante al menos 12 horas.A continuación, llene el capilar con 50%volumen por volumen de metacrilato de 3 propilo en metanol utilizando una bomba de jeringa. Selle ambos extremos del capilar con goma de sílice. Después de incubar a temperatura ambiente durante al menos 24 horas, continúe con un recubrimiento lineal de poliacrilamida en la pared interna del capilar de separación, como se describe en el protocolo de texto.Quemar una porción del capilar utilizando una llama suave para eliminar el recubrimiento exterior de poliamida a unos cuatro centímetros de distancia de un extremo del capilar. Limpie suavemente la parte quemada del capilar limpiando para eliminar completamente el recubrimiento de poliamida. Taladre un pequeño agujero al final de un tubo de 200 microlitros alrededor del mismo tamaño que el diámetro exterior capilar para mantener suficientemente el capilar en su lugar una vez que se enhebra a través de este agujero.Enrosque el extremo del capilar que está cerca de la parte quemada a través del agujero hasta que la porción quemada esté en el tubo. A continuación, agregue aproximadamente 150 microlitros de HF al tubo de 200 microlitros para que la solución hf esté aproximadamente a la mitad de la parte quemada en el capilar. Incubar el capilar en la solución de HF a temperatura ambiente durante 90 a 100 minutos.Prepare la mezcla de proteínas estándar y la muestra de E.coli como se describe en el protocolo de texto. Para configurar la electroforesis de zona capilar, o sistema CZE, cargue la muestra, el electrolito de fondo y el capilar de separación en el automuestrador CZE. Seleccione la carga de muestra en la página de control manual del muestreador automático CZE.Cargue el vial de electrolito de fondo en la bandeja tampón del muestreador automático, observando su posición en la bandeja tampón. A continuación, cargue el vial de muestra en la bandeja de muestra del muestreador automático, observando su posición en la bandeja de muestras. Coloque el muestreador automático en la posición de alineación mediante el control manual.Ahora, cargue el capilar de separación en el automuestrador CZE utilizando el extremo no grabado del capilar. Ajuste la altura del extremo de inyección del capilar si el volumen de la muestra es inferior a 50 microlitros. Cambie el muestreador automático a modo de espera mediante el control manual.Escriba la posición de la muestra en el sistema y mueva el capilar a la muestra. Empuje el extremo de inyección del capilar más abajo para llegar a la parte inferior del vial de la muestra. Continuando con el control manual, enjuague el capilar con el electrolito de fondo durante 20 minutos con una presión de 20 psi.Ahora, monte una interfaz de flujo de vaina bombeada electrocinetically comercial en la parte delantera del espectrómetro de masas. Llene el depósito de tampón de vaina con un tampón que contenga metanol de volumen del 10% y ácido fórmico de volumen del 0,2%en agua de grado LCMS. Enjuague la T en la interfaz con el tampón de la vaina mediante la aplicación de presión manualmente con una jeringa.Enrosque el extremo de un milímetro de diámetro exterior de un emisor de electrospray a través de un tubo de manguito y conecte el emisor con un puerto de la T a través de un accesorio. Simplemente enjuague la T manualmente de nuevo con una jeringa para llenar el emisor con el tampón de vaina. Ajuste la distancia entre el orificio del emisor y la entrada del espectrómetro de masas a aproximadamente dos milímetros con la ayuda de la cámara que viene con la interfaz.Aplique una tensión de dos a 2,2 kilovoltas en el vial de tampón de vaina para electrospray. A continuación, ajuste la tensión de pulverización para alcanzar una electrospray estable. Aplicar una presión baja en el extremo de inyección del capilar durante este proceso para asegurarse de que no hay burbujas en el capilar.Apague la tensión de pulverización y enrosque suavemente el extremo grabado del capilar de separación a través de la T en el emisor hasta que no pueda ser empujado más. Después de detener la baja presión en el extremo de inyección del capilar, enjuague el emisor un poco con el tampón de vaina. Una vez más, aplicar de dos a 2,2 kilovoltas de voltaje de pulverización para probar el aerosol.Seleccione un nuevo método en el menú desplegable del archivo en la pantalla principal del instrumento. Allí, seleccione la entrada como vial de muestra inicial, vial de muestra final, bandeja como muestra, presión como cinco psi, kilovoltas como cero y duración de 95 segundos para una inyección de muestra. A continuación, establezca la entrada como vial de entrada, la bandeja como tampón, la presión como cero psi, los kilovoltas como 30 y la duración como 4.200 segundos para la separación de la muestra de mezcla de proteína estándar.Para la separación de la muestra de proteome de E.coli, ajuste la entrada como vial de entrada, la bandeja como tampón, la presión como cero psi, los kilovoltas como 20 y la duración como 6.600 segundos. Por último, seleccione la entrada como vial de entrada, la bandeja como tampón, la presión de 10 psi, los kilovoltas como 30 y la duración de 600 segundos para el lavado capilar. Ahora, configure los parámetros MS y MS/MS para el análisis de proteínas intactos utilizando un espectrómetro de máscara de trampa de iones cuádruples.Para ajustar la configuración del archivo de ajuste, active el modo de proteína intacta y utilice una presión de reventado de 0,2. Ajuste la temperatura capilar de transferencia de iones a 320 grados Celsius y el nivel de RF de lente S a 55. Para realizar el experimento CZE MS/MS, inicie el método de adquisición de datos en el equipo del espectrómetro de masas, primero seleccionando la secuencia de ejecución.A continuación, inicie la secuencia de electroforesis capilar en el ordenador de automuestración de electroforesis capilar. Realice una búsqueda de base de datos con TopPIC en la suite TopPIC y en la interfaz gráfica de usuario de TopPIC. Haga clic en el archivo de base de datos y seleccione una base de datos adecuada para la búsqueda.Haga clic en el archivo de espectro y seleccione el ms2 generado. msalign archivo generado como entrada. Seleccione el archivo de entidades MS1 y elija el archivo de entidades generado.Establecer cisteína carbamidomethyl C57 como una modificación fija debido al tratamiento de la iodoacetamida. Seleccione la función de base de datos de señuelo y, en Configuración de corte, seleccione la tasa de detección falsa en el menú desplegable junto al nivel de espectro. Establezca la tasa de detección falsa en 0.01 en el nivel de espectro.Deje la función de generación sin seleccionar y establezca la tolerancia de error en 15 partes por millón. Establezca la tasa de detección falsa en 0,05 en el nivel de proteoformo. En Parámetros avanzados, seleccione dos para el número máximo de turnos de masa en el menú desplegable.Establezca el desplazamiento de masa máximo de modificaciones desconocidas en 500 daltons. Deje todos los demás parámetros en sus valores predeterminados y haga clic en el botón de inicio en la parte inferior derecha de la interfaz gráfica de usuario. Se muestra el electroferograma representativo para la mezcla de proteínas estándar.La mezcla de proteínas estándar se ejecuta normalmente al menos por duplicado para evaluar la eficiencia de separación y la reproducibilidad del sistema. La eficiencia de separación se puede evaluar con el número de placas teóricas de algunas proteínas. La reproducibilidad puede evaluarse por las desviaciones estándar relativas de la intensidad de las proteínas y el tiempo de migración.La plataforma CZE MS/MS se puede utilizar para la caracterización a gran escala de proteoformas en varios proteomas complejos, identificando más de 500 proteoformas y 190 proteínas de un proteoma de E.coli en una sola carrera con alta confianza. Aquí, se puede utilizar un zoom en la vista del electroferograma para evaluar la ventana de separación del sistema. El muy bajo valor E y FDR espectral sugiere la alta confianza del ID proteoformo.El alto número de iones de fragmentos emparejados indica además la alta confianza del ID.Al intentar este procedimiento, es importante recordar enhebrar el capilar de separación grabado en el emisor de electrosprayter lentamente y suavemente.El etiquetado de isótopos estables o los métodos libres de etiquetas se pueden incorporar en el procedimiento CZE MS para determinar cómo cambia la abundancia de proteoformos en las células en varias condiciones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la proteómica de arriba hacia abajo exploraran las funciones de los proteoformos en la regulación de diversos procesos biológicos en las células. No olvide que trabajar con ácido fluorhídrico puede ser extremadamente peligroso y las precauciones tales como el equipo de protección personal adecuado y tener procedimientos de emergencia en su lugar siempre deben tomarse al realizar este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Investigación

Química

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

La electroforesis capilar para supervisar Péptido injerto sobre quitosano películas en tiempo real

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semillas

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (CE-ICP-MS) for Quantification of Iron Redox Species (Fe(II), Fe(III))

Setup of Capillary Electrophoresis-Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry CE-ICP-MS for Quantification of Iron Redox Species FeII, FeIII

Configuración de Espectrometría de Masas De Plasma Acoplada Inductivamente Electroforesistiva (CE-ICP-MS) para Cuantificación de Especies redox de Hierro (Fe(II), Fe(III))

Dyshomeostasis of iron metabolism is accounted in the pathophysiological framework of numerous diseases, including cancer and several neurodegenerative ...

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Electroforesis capilar Enfoques de espectrometría de masas para la caracterización de la proteína y el metabolito Corona adquiridos por nanomateriales

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Identificación de proteínas de inmunidad antibacteriana en Escherichia coli utilizando MALDI-TOF-TOF-MS/MS y análisis proteómico de arriba hacia abajo

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...