Name: establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het National Institute of Health Grant R24OD018546 (to L.Y.P. and S.G.). De auteurs willen graag Weizhe Li, Ph.D. bedanken voor de hulp bij chirurgische ingrepen, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng voor immunohistologie, UNMC flow cytometrie Research Facility leden Director Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S. en Samantha Wall, b.s., unmc Advanced microscopie kern faciliteit leden Janice A. Taylor, b.s., en James R. talaska, b.s., voor de technische ondersteuning. De auteurs erkennen drs. Mamoru Ito en Hiroshi Suemizu van CIEA voor het verstrekken van TK-nog muizen en Dr. Joachim Baumgart voor het verstrekken van treosulfan. De auteurs danken Dr. Adrian Koesters, UNMC, voor haar redactionele bijdrage aan het manuscript.

Dit protocol is goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Universiteit van Nebraska Medical Center.
Opmerking: Verkrijg toestemming van de lokale IACUC voordat u experimenten op dieren uitvoert.
1. verwerking van navelstreng bloed en de isolatie van menselijke Hspc's
<ol><li>Voer alle stappen van het protocol uit onder steriele omstandigheden in laminaire flow kasten.</li>
	<li>Neem de navelstreng bloed (CB)...

<ol>
	<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+specific+causes+of+death+amongst+HIV-positive+individuals+in+the+D:A:D+Study.">Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study.</a> AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).</li><li>Puoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+for+liver+disease+in+patients+with+HIV+infection:+a+cohort+study.">Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).</li><li>Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+patterns,+and+course+of+past+hepatitis+B+virus+infection+in+intravenous+drug+users+with+HIV-1+infection.">Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection.</a> The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).</li><li>Scharschmidt, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+in+patients+with+HIV+infection:+relationship+to+AIDS+and+patient+survival.">Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival.</a> Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).</li><li>Lacombe, K., Rockstroh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+viral+hepatitis+coinfections:+advances+and+challenges.">HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges.</a> Gut. 61, 47-58 (2012).</li><li>Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+for+the+study+of+infectious+diseases.">Humanized mice for the study of infectious diseases.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).</li><li>Billerbeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+efficiently+engrafted+with+fetal+hepatoblasts+and+syngeneic+immune+cells+develop+human+monocytes+and+NK+cells.">Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells.</a> The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).</li><li>Dagur, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+depletion+in+the+presence+of+HIV-1+infection+in+dual+reconstituted+humanized+mice.">Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice.</a> Biology Open. 7 (2), (2018).</li><li>Gaska, J. M., Ploss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+viral+pathogenesis+in+humanized+mice.">Study of viral pathogenesis in humanized mice.</a> Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).</li><li>Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders.">Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+TK-NOG+mice:+a+predictive+model+for+cholestatic+human+liver+toxicity.">Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).</li><li>Washburn, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+to+study+hepatitis+C+virus+infection,+immune+response,+and+liver+disease.">A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).</li><li>Gutti, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+and+hematolymphoid+dual+reconstitution+in+treosulfan-conditioned+uPA-NOG+mice.">Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice.</a> The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).</li><li>Strick-Marchand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+for+stable+engraftment+of+a+human+immune+system+and+human+hepatocytes.">A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes.</a> PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).</li><li>Keng, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+liver+pathogenesis,+human+immune+responses+and+drug+testing+in+a+humanised+mouse+model+of+HCV+infection.">Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection.</a> Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).</li><li>Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+HBV+Infection+and+Therapy+in+Immune-Deficient+NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null+(NRG)+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+(Fah)+Knockout+Mice+Transplanted+with+Human+Hepatocytes.">Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).</li><li>Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Humanized Mice for HIV Research. , (2014).</li><li>Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+Engrafted+With+Human+HSC+Only+or+HSC+and+Thymus+Support+Comparable+HIV-1+Replication,+Immunopathology,+and+Responses+to+ART+and+Immune+Therapy.">Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).</li><li>Zhang, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+immunopathogenesis+in+humanized+mouse+models.">HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).</li><li>Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+prevent+liver+fibrosis+during+HIV+type+1+infection+in+a+humanized+mouse+model.">Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstituted+'humanized+liver'+in+TK-NOG+mice+is+mature+and+functional.">The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).</li><li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatic+cell+line+HepaRG+as+a+possible+cell+source+for+the+generation+of+humanized+liver+TK-NOG+mice.">The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice.</a> Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).</li><li>Kosaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+TK-NOG+based+humanized+mouse+model+for+the+study+of+HBV+and+HCV+infections.">A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).</li><li>Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+infection+and+the+liver.">Human immunodeficiency virus infection and the liver.</a> World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).</li><li>Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+immune-pathogenesis+and+therapy+of+human+liver+tropic+virus+infection+in+humanized+mouse+models.">Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+HIV+infection+of+hepatocytes.">Low-level HIV infection of hepatocytes.</a> Virology Journal. 9, 1-7 (2012).</li><li>Dash, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-acting+nanoformulated+antiretroviral+therapy+elicits+potent+antiretroviral+and+neuroprotective+responses+in+HIV-1-infected+humanized+mice.">Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice.</a> AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).</li><li>Sun, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+chimeric+mouse+models+of+hepatitis+B+virus+infection.">Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection.</a> International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).</li><li>Shafritz, D. A., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+and+experimental+conditions+that+lead+to+effective+repopulation+of+the+liver+by+transplanted+cells.">Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).</li><li>Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+human+hepatocytes+by+human+hematopoietic+stem+cells+in+sheep.">Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep.</a> Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).</li><li>Streetz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+parenchymal+replacement+in+mice+by+transplanted+allogeneic+hepatocytes+is+facilitated+by+bone+marrow+transplantation+and+mediated+by+CD4+cells.">Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells.</a> Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).</li></ol>

De lever is aangetast en beschadigd bij HIV-geïnfecteerde patiënten24. Experimentele kleine diermodellen voor het bestuderen van menselijke leverziekten in de aanwezigheid van HIV-1 is zeer beperkt, ondanks de beschikbaarheid van een paar gecotransplanteerde diermodellen met CD34+ hspcs en hepatocyten7,12, 25. In in vitro experimenten, hepatocyten worden aangetoond dat een laag niveau HIV-1-...

Sinds de komst van antiretrovirale therapie, is er een aanzienlijke afname van sterfgevallen gerelateerd aan HIV-1 monoinfectie. Echter, leverziekte is ontstaan als een veel voorkomende oorzaak van morbiditeit bij HIV-geïnfecteerde patiënten1,2. Coinfecties van hepatitis virussen met HIV-1-infectie komen vaker voor dan 10%-30% van de HIV-geïnfecteerde personen in de Verenigde Staten3,4,5.
De gastheer-specificiteit van HIV-1 en hepatitis virussen beperkt het nut van kleine diermodellen om humane-specifieke infectieziekten te bestuderen of om meerdere aspecten van HIV-1-geassocieerde lever pathogenese onderzoeken. Immunodeficiënte muizen die het engraftment van menselijke cellen en/of weefsels (aangeduid als gehumaniseerde Muismodellen) toelaten, zijn acceptabele diermodellen voor preklinische studies6,7,8. Sinds de introductie van gehumaniseerde muizen in de vroege jaren 2000, meerdere Preklinische studies van cholestatische menselijke lever toxiciteit, humaan-specifieke pathogenen, met inbegrip van HIV-1 en HIV-geassocieerde Neurocognitieve stoornissen, Epstein Barr virus, hepatitis, en andere infectieziekten, zijn onderzocht bij deze muizen6,9,10,11. Meerdere Muismodellen voor CD34+ hspc's en/of humane hepatocyten transplantatie zijn al lang ontwikkeld en zijn na verloop van tijd verbeterd om de pathogenese van de ziekte van het hepatitis B-virus (HBV)-geassocieerde leverziekte12te bestuderen, 13 , 14. verschillende modellen voor hspc en humane hepatocyte (HEP) transplantatie zijn gebaseerd op stammen, bekend als nog (NOD. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, en Fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull muis16. Elk model heeft echter zijn eigen voordelen en beperkingen; bijvoorbeeld, AFC8 dubbele gehumaniseerde muizen voor HEPs en menselijke stamcellen (HSCs) op een Balb/C-Rag2-/- γc-/- achtergrond maakt de succesvolle engraftment van immune cellen en hscs, maar er is een afwezigheid van een antigeen-specifieke T-en B-cel antwoord in dit model12. De belangrijkste zorgen bij het reconstitueren van dubbele gehumaniseerde muizen zijn suboptimale engraftment, een gebrek aan geschikte modellen ter ondersteuning van verschillende weefsels, niet-overeenkomende aandoeningen, immuunafstoting of transplantaat-versus-hostziekte (gvhd), en technische moeilijkheden, zoals riskante manipulaties met pasgeborenen en hoge sterftecijfers als gevolg van metabole afwijkingen13.
Hoewel gehumaniseerd muizen zijn gebruikt voor HIV-onderzoek voor vele jaren17,18,19, het gebruik van gehumaniseerde muizen te bestuderen van leverschade veroorzaakt door HIV-1 is beperkt20. We eerder gemeld de oprichting van een dubbele gehumaniseerd TK-nog muismodel en de toepassing ervan in HIV-geassocieerde leverziekte8. Dit model toont de robuuste engraftment van lever en immune cellen en aan HIV infectie pathogenese. Deze discussie presenteert een gedetailleerd protocol, met inbegrip van de meest kritische stappen in de transplantatie van menselijke hepatocyten. Een beschrijving van de Hspc's die nodig zijn voor een geslaagde engraftment van HEPs en de oprichting van een functioneel immuunsysteem bij TK-nog muizen wordt ook gepresenteerd. Het gebruik van deze muizen om HIV-geassocieerde lever immunopathogenese te bestuderen is gedetailleerd. TK-nog mannelijke muizen met een lever-specifieke herpes simplexvirus type 1 thymidine kinase (HSV-tk) transgen worden gebruikt. Muis levercellen die dit transgen uitdrukken, kunnen gemakkelijk worden ablatie na een korte blootstelling aan een niet-toxische dosis van gcv. Getransplanteerde humane levercellen worden stabiel onderhouden binnen de muis lever zonder exogene drugs21. De muizen zijn ook voorgeconditioneerd met niet-myeloablatieve doses van treosulfan om een niche te creëren in het beenmerg van de muis voor menselijke cellen8. Immunodeficiënte TK-nog-muizen zijn intrasplenisch geïnjecteerd met HEPs en multipotente Hspc's. De muizen worden vervolgens regelmatig gecontroleerd op bloed en lever reconstitutie door immunofhenootypering in het bloed en metingen van respectievelijk serum humaan-albuminespiegels. Muizen met een succesvolle reconstitutie van meer dan 15% voor zowel menselijke immuuncellen als HEPs zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met HIV-1. Het effect van HIV op de lever kan worden beoordeeld al in 4-5 weken na infectie. Het is van cruciaal belang om op te merken dat, omdat HIV-1 wordt gebruikt, alle nodige voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren van het virus en het injecteren in muizen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">27G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:125px;">30G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">5 mL polystyrene&#160; round-bottom tube 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">352054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS array bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">For purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">BD FACS array software</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS lysing solution</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">349202</td>
			<td style="width:167px;">To lyse red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument for acquisiton of flow cytometry samples</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tube</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">BD 367874</td>
			<td style="width:167px;">To collect Cord blood</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A9576</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Controlled substance and pain-killer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD14-PE</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555398</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD19-BV605</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562653</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:125px;">CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-046-702</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; CD34+ HSPC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">CD34-PE, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-081-002</td>
			<td style="width:167px;">Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD3-AF700</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">557943</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD45-PerCPCy5.5</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">564105</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555349</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD8-BV421</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562428</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cell counting slides</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">CS11204</td>
			<td style="width:167px;">for extraction of genomic DNA from ear piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cobas Amplicor system v1.5&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">bioanalyzer to measure viral load</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cotton-tipped applicators&#160;</td>
			<td style="width:135px;">&#160;McKesson</td>
			<td style="width:127px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cytokeratin-18 (CK18)</td>
			<td style="width:135px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">M7010</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D2650-5X5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:125px;">Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">30914</td>
			<td style="width:167px;">Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FACS Diva version 6</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometer software required for&#160; acqusition of sample</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">10438026</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FLOWJO analysis software 
			v10.2</td>
			<td style="width:135px;">FLOWJO, LLC</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:135px;">APP Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">315110</td>
			<td style="width:167px;">Prescripition drug</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td>
			<td style="width:135px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:127px;">450475</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Hepatocytes thawing medium&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">MCHT50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Horizon Open Ligating Clip Appliers</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:127px;">537061</td>
			<td style="width:167px;">To hold the ligating clips</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Hospira Sterile Water for Injection</td>
			<td style="width:135px;">ACE surgical supply co. Inc.</td>
			<td style="width:127px;">001-1187</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of Buprenorphine (pain-killer)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td style="width:135px;">Bethyl laboratories</td>
			<td style="width:127px;">E80-129</td>
			<td style="width:167px;">For assesing human albumin levels in mouse serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human hepatocyte</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">HUCP1</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Iris Scissors, Straight</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">13295</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Lancet</td>
			<td style="width:135px;">MEDIpoint</td>
			<td style="width:127px;">Goldenrod 5 mm</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-401</td>
			<td style="width:167px;">Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:135px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:127px;">50494</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; lymphocytes from peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-303</td>
			<td style="width:167px;">holds Qudro MACS seperator and LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5605</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5157&#160;</td>
			<td style="width:167px;">to hold and pull out spleen from peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">mouse CD45-FITC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">553080</td>
			<td style="width:167px;">mouse-specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td style="width:135px;">Hyclone</td>
			<td style="width:127px;">SH30256.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Qudro MACS separator&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-090-976</td>
			<td style="width:167px;">holds four LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">11875093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">StepOne Plus Real Time PCR&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument used&#160; to&#160; genotype</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml</td>
			<td style="width:135px;">DYMAX CORP</td>
			<td style="width:127px;">T15469</td>
			<td style="width:167px;">Used to&#160; dispense&#160; HSPC and HEP supension in controlled manner</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Suturevet PGA synthetic absorbale suture</td>
			<td style="width:135px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:127px;">41178</td>
			<td style="width:167px;">Suturing of skin and peritoneum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">4369016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:125px;">TK-NOG mice&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Treosulfan</td>
			<td style="width:135px;">Medac GmbH</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by &#160;Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450022</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">1346</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Weck hemoclip traditional titanium ligating clips</td>
			<td style="width:135px;">Esutures</td>
			<td style="width:127px;">523700</td>
			<td style="width:167px;">To ligate the spleen post-injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis

Ondanks de toegenomen levensverwachting van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntie virus-1 (HIV-1), is de leverziekte ontstaan als een veelvoorkomende oorzaak van hun morbiditeit. De lever Immunopathologie veroorzaakt door HIV-1 blijft ongrijpbaar. Kleine xenotransplantaatmodellen is diermodellen met humane hepatocyten en menselijk immuunsysteem kunnen de menselijke biologie van de pathogenese van de ziekte recapituleren. Hierin wordt een protocol beschreven om een dubbel gehumaniseerd muismodel tot stand te brengen door humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stam/voorlopercellen (HSPCs) transplantatie, om lever Immunopathologie te bestuderen zoals WAARGENOMEN bij HIV-geïnfecteerde patiënten. Om dubbele reconstitutie te bereiken, mannelijke TK-nog (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (Alb-tk) 7-2/shijic) muizen zijn intraperitoneaal geïnjecteerd met ganciclovir (gcv) doses te elimineren muis transgene levercellen, en met treosulfan voor nonmyeloablative conditionering, die beide vergemakkelijking van humane hepatocyten (HEP) engraftment en menselijk immuunsysteem (zijn) ontwikkeling. Humaan albumine (ALB) niveaus worden geëvalueerd voor lever engraftment, en de aanwezigheid van menselijke immuuncellen in bloed gedetecteerd doorstroming cytometrie bevestigt de oprichting van menselijk immuunsysteem. Het model ontwikkeld met behulp van het protocol beschreven hier lijkt op meerdere componenten van leverschade van HIV-1-infectie. De inrichting ervan kan essentieel blijken te zijn voor onderzoeken naar co-infectie met Hepatitis virus en voor de evaluatie van antivirale en antiretrovirale geneesmiddelen.

De oprichting van een Dual gehumaniseerd muismodel met menselijke lever en immune cellen kan gemakkelijk worden bewaakt bij elke stap met zeer eenvoudige ELISA en flow cytometrie, respectievelijk. Flow cytometrie wordt regelmatig uitgevoerd om de ontwikkeling van een functioneel immuunsysteem te evalueren en om het effect van HIV-infectie op immuuncellen te zien. In Dual gehumaniseerde muizen kan de ontwikkeling van functionele immuuncellen variëren van 15% tot 90% van de lymfocyten poor...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Dit protocol biedt een betrouwbare methode om gehumaniseerde muizen te vestigen met zowel menselijk immuunsysteem als levercellen. Dubbele gereconstitueerde immunodeficiënte muizen bereikt via intrasplenische injectie van humane hepatocyten en CD34+ hematopoietische stamcellen zijn vatbaar voor humaan immunodeficiëntie virus-1 infectie en even leverschade zoals waargenomen in HIV-geïnfecteerde patiënten.

Oprichting van de dubbele gehumaniseerde TK-nog muis model voor HIV-geassocieerde lever pathogenese

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Het algemene doel van het protocol is het genereren van een gehumaniseerd muismodel met functioneel menselijk immuunsysteem en lever met behulp van menselijke hematopoietische stamcellen en hepato-site. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in genetische lever gehumaniseerde muizen. Deze methode biedt een krachtig hulpmiddel om immunopathologie veroorzaakt door HIV te bestuderen, zoals waargenomen bij mensen.Het aantonen van het proces zal worden door Yimin Sun, een supervisor van de pathologie en microbiologie afdeling, samen met Weimin Wang en Edwrd Makarov, onderzoek technoloog. Om te beginnen, overdracht navelstrengbloed verzameld in heparinized buizen naar een steriele laminaire stroomkast. Voeg PBS toe tot het volume is verhoogd tot 35 milliliter.Leg het monster op de top van lymfocyten scheiding medium en centrifugeren het 400 keer G en op vier graden Celsius gedurende 35 minuten zonder pauzes. Verwijder vervolgens voorzichtig de bovenste plasmalaag en gebruik een transferpipet om de witte buffy coat interface over te brengen naar een nieuwe buis. Hang de buffy jas opnieuw op in 30 tot 40 milliliter ijskoude buffer.Combineer met behulp van een pipet 20 microliter van de celsuspensie met 20 microliter van 0,4% trypan blauw. Pipette 10 microliter van dit mengsel in de buitenste opening van een van de twee kamers van een telplaat, en steek de dia in een geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen. Centrifugeren de cellen op 300 keer G en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Zorgvuldig aspirate de supernatant en voeg 300 microliters van ijskoude buffer. Voeg 100 microliters van menselijke FC receptor blokkeren reagens en 100 microliters van monoklonale muis anti-menselijke CD34 antilichaam geconjugeerde MicroBeads voor maximaal 100 miljoen cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius.Voeg 10 milliliter ijskoude buffer toe om de cellen te wassen en centrifuge het 300 keer G en vier graden celsius gedurende 10 minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en hang de pellet opnieuw op in 500 microliters ijskoude buffer. Plaats hierna een positieve ls-kolom met positieve selectie in het magnetisch geactiveerde celsorteerveld en geef deze door met drie milliliter ijskoude buffer.Laad het monster in de LS-kolom die MicroBeads in monsters kan vastpluipen aan menselijke CD34-positieve cellen en laat het onder invloed van de zwaartekracht in de opvangbuis stromen. Was de kolom drie keer met ijskoude buffer en verzamel het eluent in dezelfde opvangbuis. Vervolgens, duik de kolom met vijf milliliter van ijskoude buffer om de CD34 positieve cellen zinspelen in een nieuwe collectie buis.Herhaal de procedure om een zuiverheid van meer dan 90% te bereiken Vervolgens gebruikt u trypanblauwe kleurstof en een hemocytometer om de ontweken CD34-positieve cellen te tellen. Na het tellen, centrifugeren de cellen op 300 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in 125 microliter PBS voor een injectie die onmiddellijk bij transplantatie kan worden gebruikt.Om de zuiverheid van de CD34 positieve eluent te controleren, neem 50 microliter van de suspensie en incuberen met 10 microliter pe geconjugeerd anti-menselijke CD34 antilichaam op vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Daarna was en schorst u de cellen opnieuw in PBS en voert u stroomcytometrie uit. Analyseer na de overname de gegevens zoals beschreven in het tekstprotocol.Eerst halen en ontdooien de cryopreserved hepatocyten zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder vervolgens de biodop en giet de ontdooide hepatocyten in een 50 milliliter conische buis met opgewarmd ontdooiingsmedium. Rock de buis met de hand voor een paar seconden om de cellen op te schorten.Pellet de cellen op 100 keer G en bij kamertemperatuur gedurende acht minuten. Was de pelletcellen in PBS met 0,1%BSA en bundel ze met verse of ontdooide HSPCs in PBS tot een eindvolume van 80 microliters per muis. Bevestig eerst het ene uiteinde van een steriele verlengbuis aan een naald van 30 meter en het andere uiteinde aan een spuit van één milliliter.Vul de spuit met de ophanging van gepoolde HEPs en HSPCs. Plaats de spuit in de inkeping van een repetitieve doseerpijp en pas de dispenser aan om 10 microliter in elke pers af te geven. Scheer elke muis zoals beschreven in het tekstprotocol en scrub de linkerkant van het lichaam van elke muis met 10%povidone jodium gevolgd 70% isopropyl alcohol.Met behulp van Vannas type schaar, maak een kleine incisie in de huid, spier en buikvlies aan de linkerkant van de buikvlieswand om de buikholte ongeveer 5 millimeter onder de onderste rand van de ribbenkast in te voeren. Zoek de milt en gebruik tangen om het iets te trekken naar het bedieningsgebied voor gemakkelijke toegang en steek de 30 meter naald in de onderste pool van de milt. Ontgrendel vervolgens de zuiger van de doseerpijp en doseer 10 microliter van het volume per keer, met een limiet van 60 tot 80 microliter per milt.Trek de naald langzaam in en knip de milt met ligatingclips met behulp van een ligatie-applier. Gebruik vervolgens met katoen getipte applicators bevochtigd met steriele PBS om de milt terug in de lichaamsholte te duwen. Gebruik een onderbroken hechtingspatroon om de spierlaag van de buikwand te sluiten.Volbrengen huidsluiting met een onderbroken hechting patroon met behulp van niet-absorbeerbare hechtingen. Breng alle benodigde materialen over naar een aangewezen Biosafety Level Two Plus-faciliteit. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder een wegwerphoes alle jurken, schoenhoezen, een gezichtsmasker en dubbele handschoenen, inclusief snijbestendige handschoenen, te allen tijde tijdens het werken met het virus.Selecteer muizen met een reconstructie van meer dan 15% van de menselijke CD45 positieve cellen en met een aanwezigheid van menselijke albumine in het serum voor HIV-1 infectie. Intraperitoneally injecteren de muizen met 1.000 tot 10.000 weefselkweek infectieuze doses van 50 HIV-1 ADA in een volume van 100 tot 200 microliter per muis. Na het euthanaseren van de muizen, accijns van de lever van elke muis zoals beschreven in het tekstprotocol.Verzamel en fix de levers in 4%paraformaldehyde 's nachts. De oprichting van een dual gehumaniseerd muismodel met menselijke lever- en immuuncellen kan bij elke stap eenvoudig worden gecontroleerd met respectievelijk zeer eenvoudige ELIZA en stroomcytometrie. Flow cytometrie wordt regelmatig uitgevoerd om de ontwikkeling van een functioneel immuunsysteem te evalueren en om het effect van HIV-infectie op immuuncellen te zien.Bij gehumaniseerde muizen kan de ontwikkeling van functionele immuuncellen variëren van 15 tot 90% van de lymfocytenpoort. Voor de evaluatie van de engraftment van menselijke hepatocyten wordt ELIZA voor mensspecifieke albumineniveaus maandelijks uitgevoerd op muisserum. Muizen geënt met zowel HSPCs en HEPs tonen mens-specifieke albumin niveaus variërend van ongeveer zeven microgram per milliliter tot 377 microgram per milliliter op een maand, blijven groeien in de tijd van observatie.Het effect van HIV-infectie op menselijke immuuncellen in het bloed van dubbele gehumaniseerde muizen wordt gecontroleerd door stromingscytometrie en op HEPs in de lever door mensspecifiek albumin ELIZA. Tegen vijf weken veroorzaakt HIV-1 een afname van het aantal menselijke albumineniveaus in het serum en is er een uitputting van menselijke CK18 positieve hepatocyten in de leversecties van dubbele gehumaniseerde muizen. Een lagere verhouding van CD4 tot CD8 wordt meestal waargenomen in het bloed en de lever van hiv-geïnfecteerde muizen, in vergelijking met niveaus die in dezelfde muis voor infectie.Bloed moet zorgvuldig worden gelaagd op de top van lymfocyten scheiding medium voor isolaties van buffy jas. Houd voor de operatie de milt voorzichtig vast en steek de naald in de onderste pool van de milt. Na de isolatie van hematopoietische stamcellen is het cruciaal om de zuiverheid van CD34 positieve hematopoietische stamcellen te controleren om CD3-positieve cellen en acute injecties van hepatocyat van verschillende donor te voorkomen.Als de gehumaniseerde muizen fysiologisch aspect van het menselijk immuunsysteem en de lever vertonen, kunnen de ontwikkelde muizen worden gebruikt om fysiopathogenese van HIV en fysieke infecties en cirrose te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Het Insect<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als een krachtige Infectie model te Bacteriële Pathogenese Onderzoek

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Gehumaniseerd muismodel om te studeren Bacteriële infecties Targeting microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Gehumaniseerd knik/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) muis Model voor HIV-replicatie en Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Een Ex Vivo kip primaire Bursal-celkweek Model studie Bursal infectieziekte Virus pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...