Name: establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי למענק הבריאות R24OD018546 (כדי L.Y.P. ו S.G.). המחברים רוצים להודות Weizhe Li, Ph.D., לעזרה בהליכים כירורגי, אמנדה סניף וודס, בולשיט, יאן צ'נג עבור אימונוהיסטולוגיה, UNMC זרימה cytometry מתקן מחקר חברי המנהל פיליפ הקסלי, Ph.D., ויקטוריה ב. סמית, בולשיט, וסמנתה וול, בולשיט, UNMC מתקדמים הליבה המיקרוסקופיה חברי מתקנים ג'ניס א. טיילור, בולשיט, וג ר. טלסקה, בולשיט, על התמיכה הטכנית. המחברים מכירים בד"ר. מורו איטו והירושי סואמאז מ-CIEA למתן העכברים TK-חעוגה ו ד ר יואכים באומגארט למתן טראוסולפן. המחברים מודים לד ר אדריאן קואסטרים, UNMC, על תרומת המאמר שלה לכתב היד.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) במרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.
הערה: קבל אישור IACUC המקומי לפני ביצוע ניסויים על בעלי חיים.
1. עיבוד דם חבל הטבור ובידוד האדם העברי
<ol><li>בצע את כל השלבים של הפרוטוקול תחת תנאים סטריליים ב...

<ol>
	<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+specific+causes+of+death+amongst+HIV-positive+individuals+in+the+D:A:D+Study.">Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study.</a> AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).</li><li>Puoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+for+liver+disease+in+patients+with+HIV+infection:+a+cohort+study.">Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).</li><li>Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+patterns,+and+course+of+past+hepatitis+B+virus+infection+in+intravenous+drug+users+with+HIV-1+infection.">Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection.</a> The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).</li><li>Scharschmidt, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+in+patients+with+HIV+infection:+relationship+to+AIDS+and+patient+survival.">Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival.</a> Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).</li><li>Lacombe, K., Rockstroh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+viral+hepatitis+coinfections:+advances+and+challenges.">HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges.</a> Gut. 61, 47-58 (2012).</li><li>Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+for+the+study+of+infectious+diseases.">Humanized mice for the study of infectious diseases.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).</li><li>Billerbeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+efficiently+engrafted+with+fetal+hepatoblasts+and+syngeneic+immune+cells+develop+human+monocytes+and+NK+cells.">Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells.</a> The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).</li><li>Dagur, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+depletion+in+the+presence+of+HIV-1+infection+in+dual+reconstituted+humanized+mice.">Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice.</a> Biology Open. 7 (2), (2018).</li><li>Gaska, J. M., Ploss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+viral+pathogenesis+in+humanized+mice.">Study of viral pathogenesis in humanized mice.</a> Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).</li><li>Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders.">Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+TK-NOG+mice:+a+predictive+model+for+cholestatic+human+liver+toxicity.">Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).</li><li>Washburn, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+to+study+hepatitis+C+virus+infection,+immune+response,+and+liver+disease.">A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).</li><li>Gutti, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+and+hematolymphoid+dual+reconstitution+in+treosulfan-conditioned+uPA-NOG+mice.">Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice.</a> The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).</li><li>Strick-Marchand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+for+stable+engraftment+of+a+human+immune+system+and+human+hepatocytes.">A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes.</a> PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).</li><li>Keng, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+liver+pathogenesis,+human+immune+responses+and+drug+testing+in+a+humanised+mouse+model+of+HCV+infection.">Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection.</a> Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).</li><li>Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+HBV+Infection+and+Therapy+in+Immune-Deficient+NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null+(NRG)+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+(Fah)+Knockout+Mice+Transplanted+with+Human+Hepatocytes.">Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).</li><li>Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Humanized Mice for HIV Research. , (2014).</li><li>Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+Engrafted+With+Human+HSC+Only+or+HSC+and+Thymus+Support+Comparable+HIV-1+Replication,+Immunopathology,+and+Responses+to+ART+and+Immune+Therapy.">Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).</li><li>Zhang, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+immunopathogenesis+in+humanized+mouse+models.">HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).</li><li>Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+prevent+liver+fibrosis+during+HIV+type+1+infection+in+a+humanized+mouse+model.">Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstituted+'humanized+liver'+in+TK-NOG+mice+is+mature+and+functional.">The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).</li><li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatic+cell+line+HepaRG+as+a+possible+cell+source+for+the+generation+of+humanized+liver+TK-NOG+mice.">The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice.</a> Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).</li><li>Kosaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+TK-NOG+based+humanized+mouse+model+for+the+study+of+HBV+and+HCV+infections.">A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).</li><li>Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+infection+and+the+liver.">Human immunodeficiency virus infection and the liver.</a> World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).</li><li>Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+immune-pathogenesis+and+therapy+of+human+liver+tropic+virus+infection+in+humanized+mouse+models.">Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+HIV+infection+of+hepatocytes.">Low-level HIV infection of hepatocytes.</a> Virology Journal. 9, 1-7 (2012).</li><li>Dash, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-acting+nanoformulated+antiretroviral+therapy+elicits+potent+antiretroviral+and+neuroprotective+responses+in+HIV-1-infected+humanized+mice.">Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice.</a> AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).</li><li>Sun, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+chimeric+mouse+models+of+hepatitis+B+virus+infection.">Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection.</a> International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).</li><li>Shafritz, D. A., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+and+experimental+conditions+that+lead+to+effective+repopulation+of+the+liver+by+transplanted+cells.">Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).</li><li>Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+human+hepatocytes+by+human+hematopoietic+stem+cells+in+sheep.">Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep.</a> Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).</li><li>Streetz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+parenchymal+replacement+in+mice+by+transplanted+allogeneic+hepatocytes+is+facilitated+by+bone+marrow+transplantation+and+mediated+by+CD4+cells.">Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells.</a> Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).</li></ol>

הכבד הוא נפרץ וניזוק בחולים נגועים באיידס24. ניסיוני מודלים בעלי חיים קטנים לחקר מחלות הכבד האנושי בנוכחות HIV-1 הוא מוגבל מאוד, למרות הזמינות של כמה מודלים בעלי חיים המושתלים עם CD34+ hspcs ו hepatocytes7,12, . עשרים וחמש בניסויים מחו?...

מאז הופעתו של טיפול תרופתי, יש כבר ירידה משמעותית במקרי מוות הקשורים HIV-1 monoinfection. עם זאת, מחלת כבד התפתחה כגורם נפוץ של תחלואה בחולים נגועים ב-HIV1,2. זיהומים הפטיטיס של וירוסי צהבת עם hiv-1 זיהום נפוצים יותר, חשבונאות עבור 10%-30% של אנשים נגועים באיידס בארצות הברית3,4,5.
המארח-ספציפיות של HIV-1 ווירוסים צהבת מגביל את השירות של מודלים בעלי חיים קטנים כדי ללמוד מחלות זיהומיות אדם ספציפי או לחקור היבטים מרובים של הפתוגנזה הקשורים בכבד HIV-1. עכברים לקויה המאפשרים את החרט של תאים אנושיים ו/או רקמות (כינה מודלים של עכברים הומניזציה) הם מודלים בעלי חיים מקובלים עבור מחקרים קדם-קליניים6,7,8. מאז המבוא של עכברים הומניזציה בתחילת שנות האלפיים, מחקרים פרה-קליניים מרובים של רעילות הכבד האנושי, פתוגנים אנושיים, כולל HIV-1 ו-HIV הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות, וירוס אפשטיין בר, צהבת, ועוד מחלות זיהומיות, נחקרו אלה עכברים6,9,10,11. מודלים של עכבר מרובים עבור CD34+ hspcs ו/או השתלת hepatocyte האדם כבר זמן רב פותחו ושופרו לאורך זמן כדי ללמוד את הפתוגנזה המחלה של הפטיטיס B וירוס (hbv)-הקשורים מחלת הכבד12, מיכל בן 13 , 14. מספר דגמים עבור hspc ו hepatocyte האדם (הפטיטיס) השתלת מבוססים על זנים, המכונה חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, nsg (הנהון. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, balb/C-Rag2- γc-/- (Rag2tm 1.1 flv Il2rgtm 1.1 flv/j)12, ו-פה-/- הנהון rag1-/- il2rγnull העכבר16. עם זאת, לכל דגם יש יתרונות ומגבלות משלו; לדוגמה, AFC8 עכברים כפולים הומניזציה עבור HEPs ותאי גזע האדם (HSCs) ב Balb/C-Rag2- γc-/- רקע מאפשר את החרט המוצלח של תאים חיסוניים ו HSCs, אבל יש העדר של אנטיגן ספציפי T-ו-B-cell תגובה במודל12זה. החששות העיקריים במרכיבי עכברים הומניזציה כפולה כוללים בתאום מחדש, חוסר מודלים מתאימים לתמוך ברקמות שונות, תנאים לא תואמים, דחייה החיסונית, או השתל-מול-מארחים מחלה (gvhd), וטכני קשיים, כגון מניפולציות מסוכן עם ילודים ושיעורי תמותה גבוהים בשל חריגות מטבולית13.
למרות עכברים הומניזציה שימשו למחקר HIV במשך שנים רבות17,18,19, השימוש של עכברים הומניזציה ללמוד נזק לכבד שנגרם על ידי HIV-1 כבר מוגבל20. בעבר דיווחו על הקמתה של הומניזציה כפולה TK-חעוגה מודל העכבר ויישומו במחלת הכבד הקשורים ל-HIV8. מודל זה מראה את החרט החסון של הכבד ואת התאים החיסוניים ולכידה הפתוגנזה זיהום HIV. דיון זה מציג פרוטוקול מפורט, כולל הצעדים הקריטיים ביותר בהשתלה של הפטוציטים אנושיים. תיאור של HSPCs נדרש העפיל מוצלחת של HEPs והקמת מערכת חיסונית תפקודית ב-TK-חעוגה עכברים מוצגים גם. השימוש בעכברים אלה כדי ללמוד immunopathogenesis הכבד הקשורים לאיידס מפורט. TK-חעוגה עכברים זכרים נושאים את הכבד הספציפי הרפס וירוס סוג 1 תימידין קינאז (HSV-TK) טרנסגנטית משמשים. כדוריות הכבד של העכבר ביטוי זה יכול בקלות להיות בלתי מבוקר לאחר חשיפה קצרה למינון רעיל של GCV. תאים המושתלים בכבד האדם נשמרים באופן בלתי נשכח בתוך הכבד של העכבר ללא תרופות אקסוגני21. העכברים הם גם ממוזג עם מינונים nonmyeloablative של treosulfan ליצור נישה במח העצם העכבר עבור תאים אנושיים8. חעוגה לקויה-הזרקת טי-טי-טי. העכברים מנוטרים לאחר מכן באופן סדיר עבור מחדש דם והכבד החוקה על ידי immunophenotyping קלדה ומדידות של סרום ברמות אנושיות-אלבומין, בהתאמה. עכברים עם חוקה מוצלחת של יותר מ 15% עבור תאי החיסון האנושיים ו-HEPs הם intraperitoneally וזרק עם HIV-1. ההשפעה של HIV על הכבד ניתן להעריך מוקדם ככל 4-5 שבועות לאחר ההדבקה. חשוב לציין כי בגלל HIV-1 נעשה שימוש, כל אמצעי הזהירות הדרושים יש לנקוט בעת טיפול בווירוס והזרקת אותו לתוך עכברים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">27G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:125px;">30G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">5 mL polystyrene&#160; round-bottom tube 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">352054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS array bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">For purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">BD FACS array software</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS lysing solution</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">349202</td>
			<td style="width:167px;">To lyse red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument for acquisiton of flow cytometry samples</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tube</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">BD 367874</td>
			<td style="width:167px;">To collect Cord blood</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A9576</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Controlled substance and pain-killer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD14-PE</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555398</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD19-BV605</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562653</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:125px;">CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-046-702</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; CD34+ HSPC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">CD34-PE, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-081-002</td>
			<td style="width:167px;">Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD3-AF700</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">557943</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD45-PerCPCy5.5</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">564105</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555349</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD8-BV421</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562428</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cell counting slides</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">CS11204</td>
			<td style="width:167px;">for extraction of genomic DNA from ear piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cobas Amplicor system v1.5&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">bioanalyzer to measure viral load</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cotton-tipped applicators&#160;</td>
			<td style="width:135px;">&#160;McKesson</td>
			<td style="width:127px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cytokeratin-18 (CK18)</td>
			<td style="width:135px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">M7010</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D2650-5X5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:125px;">Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">30914</td>
			<td style="width:167px;">Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FACS Diva version 6</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometer software required for&#160; acqusition of sample</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">10438026</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FLOWJO analysis software 
			v10.2</td>
			<td style="width:135px;">FLOWJO, LLC</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:135px;">APP Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">315110</td>
			<td style="width:167px;">Prescripition drug</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td>
			<td style="width:135px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:127px;">450475</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Hepatocytes thawing medium&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">MCHT50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Horizon Open Ligating Clip Appliers</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:127px;">537061</td>
			<td style="width:167px;">To hold the ligating clips</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Hospira Sterile Water for Injection</td>
			<td style="width:135px;">ACE surgical supply co. Inc.</td>
			<td style="width:127px;">001-1187</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of Buprenorphine (pain-killer)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td style="width:135px;">Bethyl laboratories</td>
			<td style="width:127px;">E80-129</td>
			<td style="width:167px;">For assesing human albumin levels in mouse serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human hepatocyte</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">HUCP1</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Iris Scissors, Straight</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">13295</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Lancet</td>
			<td style="width:135px;">MEDIpoint</td>
			<td style="width:127px;">Goldenrod 5 mm</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-401</td>
			<td style="width:167px;">Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:135px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:127px;">50494</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; lymphocytes from peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-303</td>
			<td style="width:167px;">holds Qudro MACS seperator and LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5605</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5157&#160;</td>
			<td style="width:167px;">to hold and pull out spleen from peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">mouse CD45-FITC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">553080</td>
			<td style="width:167px;">mouse-specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td style="width:135px;">Hyclone</td>
			<td style="width:127px;">SH30256.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Qudro MACS separator&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-090-976</td>
			<td style="width:167px;">holds four LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">11875093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">StepOne Plus Real Time PCR&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument used&#160; to&#160; genotype</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml</td>
			<td style="width:135px;">DYMAX CORP</td>
			<td style="width:127px;">T15469</td>
			<td style="width:167px;">Used to&#160; dispense&#160; HSPC and HEP supension in controlled manner</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Suturevet PGA synthetic absorbale suture</td>
			<td style="width:135px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:127px;">41178</td>
			<td style="width:167px;">Suturing of skin and peritoneum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">4369016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:125px;">TK-NOG mice&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Treosulfan</td>
			<td style="width:135px;">Medac GmbH</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by &#160;Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450022</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">1346</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Weck hemoclip traditional titanium ligating clips</td>
			<td style="width:135px;">Esutures</td>
			<td style="width:127px;">523700</td>
			<td style="width:167px;">To ligate the spleen post-injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis

למרות תוחלת החיים המוגבר של חולים נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 (HIV-1), מחלת הכבד התפתחה כגורם נפוץ של התחלואה שלהם. הכבד immunopathology הנגרמת על ידי HIV-1 נשאר חמקמק. מודלים בעלי חיים קטנים של השתלה עם המעי האנושי ומערכת החיסון האנושית יכולים ללכוד את הביולוגיה האנושית של הפתוגנזה של המחלה. בזאת, פרוטוקול מתואר כדי להקים מודל הומניסטי כפול העכבר באמצעות האדם hepatocytes ו CD34+ המטפאות גזע/מחולל קדמון תאים (HSPCs) השתלת, כדי ללמוד הכבד immunopathology כפי שנצפתה בחולים נגועים באיידס. כדי להשיג החוקה הכפולה, זכר TK-חעוגה (נוד. Cg-prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK) 7-2/ShiJic) עכברים הם intraperitoneally וזרק עם ganciclovir (gcv) מינונים כדי לחסל את תאי הכבד טרנסגניים העכבר, עם treosulfan עבור מיזוג nonmyeloablative, שניהם להקל על מערכת החיסון האנושית של המערכת החיסונית (שלו). רמות אלבומין האנושי (ALB) מוערכות עבור מינון הכבד, והנוכחות של תאי החיסון האנושיים בדם שאותרו על ידי הזרימה cy, try מאשרת את הקמתה של המערכת החיסונית האנושית. המודל פיתח באמצעות פרוטוקול המתואר כאן דומה רכיבים מרובים של נזק לכבד מזיהום HIV-1. הקמתה יכולה להוכיח להיות חיוני למחקרים של דלקת וירוס הפטיטיס ושיתוף הערכה של תרופות אנטי ויראליות ואנטי.

הקמתה של מודל עכבר כפול הומניזציה עם הכבד האנושי ותאים חיסוניים ניתן לפקח בקלות בכל שלב עם אליסה פשוטה מאוד וזרימה cy, בהתאמה. Cy, הזרמת הזרימה מבוצעת באופן קבוע כדי להעריך את ההתפתחות של מערכת חיסונית תפקודית לראות את ההשפעה של זיהום HIV על התאים החיסוניים. ב עכברים הומניזצי...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה להקמת עכברים הומניזציה עם מערכת החיסון האנושית ותאי הכבד. השני עכברים לקויה מחדש השיגה באמצעות הזרקה התוך הטחול של האדם hepatocytes ו CD34+ תאי גזע המטרופאיות רגישים לנגיף הכשל החיסוני האנושי-1 זיהום ונזק הכבד לכידה כפי שנצפתה ב . חולים נגועים באיידס

הקמתה של הומניזציה Dual-TK-חעוגה מודל העכבר עבור הנגיף הקשור HIV פתוגנזה

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

המטרה הכוללת של הפרוטוקול היא ליצור מודל עכבר אנושי עם מערכת חיסונית אנושית תפקודית וכבד באמצעות תאי גזע hematopoietic אנושי ואתר hepato. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכבד גנטי עכברים אנושיים. שיטה זו מספקת כלי רב עוצמה לחקר אימונופתולוגיה הנגרמת על ידי HIV כפי שנצפה אצל אנשים.הדגמת התהליך תהיה על ידי ימין סאן, מפקח מהמחלקה לפתולוגיה ומיקרוביולוגיה, יחד עם ואמין וואנג ו אדוורד מקרוב, טכנולוג מחקר. כדי להתחיל, להעביר דם חבל הטבור שנאסף צינורות heparinized לארון זרימה למינאר סטרילי. הוסף PBS עד שהנפח יגדל ל- 35 מיליליטר.שכבת המדגם על גבי מדיום הפרדת לימפוציטים צנטריפוגה זה 400 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 35 דקות ללא הפסקות. לאחר מכן, להסיר בזהירות את שכבת הפלזמה העליונה ולהשתמש פיפטה העברה להעביר את ממשק מעיל באפי לבן לצינור חדש. להשעות מחדש את המעיל באפי ב 30 עד 40 מיליליטר של חיץ קר כקרח.באמצעות פיפטה, לשלב 20 microliters של ההשעיה התא עם 20 microliters של 0.4% trypan כחול. Pipette 10 microliters של תערובת זו לתוך הפתח החיצוני של אחד משני התאים של שקופית ספירה, ולהוסיף את השקופית לתוך מונה תא אוטומטי לספור את התאים. צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.בזהירות שאפו את העל-טבעי והוסיפו 300 מיקרוליטרים של חיץ קר כקרח. הוסף 100 microliters של קולטן FC אנושי חוסם reagent ו 100 microliters של עכבר חד שבטי נגד אדם CD34 נוגדנים הוסיף MicroBeads עבור עד 100 מיליון תאים. דגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.מוסיפים 10 מיליליטר של חיץ קר כקרח כדי לשטוף את התאים וצנטריפוגה זה 300 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולה ב 500 microliters של חיץ קר קרח. לאחר מכן, מקם עמודת LS בחירה חיובית בשדה מיון התאים המופעלים מגנטית והעביר אותה באמצעות שלושה מיליליטר של חיץ קר כקרח.טען את הדגימה לתוך עמודת LS שיכולה ללכוד MicroBeads מאוגד לתאים חיוביים CD34 אנושי בדגימות, ולאפשר לו לזרום תחת השפעת כוח הכבידה לתוך צינור האיסוף. לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם חיץ קר כקרח ולאסוף את eluent באותו צינור איסוף. לאחר מכן, לצלול את העמודה עם חמישה מיליליטר של חיץ קר קרח כדי ל מרמז על CD34 תאים חיוביים לתוך צינור אוסף חדש.חזור על ההליך כדי להשיג טוהר של מעל 90%Next, השתמש בצבע כחול trypan ו hemocytometer לספור את התאים החיוביים CD34 חמק. לאחר הספירה, צנטריפוגה התאים ב 300 פעמים G במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-125 מיקרוליטרים של PBS להזרקה שתשמש באופן מיידי בהשתלה.כדי לבדוק את הטוהר של ה-CD34 חיובי eluent, לקחת 50 microliters של ההשעיה דגירה אותו עם 10 microliters של PE גדוש נוגדן CD34 אנטי אנושי בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף מחדש להשעות את התאים PBS ולהמשיך לבצע ציטומטריה זרימה. לאחר הרכישה, נתח את הנתונים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.ראשית, לאחזר ולהפשיר את hepatocytes cryopreserved כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להסיר את הכובע הביולוגי ויוצקים את hepatocytes מופשר לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל מדיום הפשרה מחומם. רוק הצינור ביד במשך כמה שניות כדי להשעות את התאים.גלולה התאים ב 100 פעמים G ובטמפרטורת החדר במשך שמונה דקות. שטפו את התאים המופרעים ב-PBS עם 0.1%BSA ואספו אותם עם HSPCs טריים או מופשרים ב-PBS לנפח סופי של 80 מיקרוליטרים לעכבר. ראשית, לצרף קצה אחד של צינור הארכה סטרילית למחט 30 מד ואת הקצה השני למזרק מיליליטר אחד.למלא את המזרק עם ההשעיה של HEPs בריכה ו HSPCs. להתאים את המזרק ב חריץ של פיפטה מחלק חוזרת ולהתאים את המתקן כדי לוותר על 10 microliters בכל עיתונות. לגלח כל עכבר כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט ולשפשף את הצד השמאלי של הגוף של כל עכבר עם 10%povidone יוד ואחריו 70% אלכוהול isopropyl.באמצעות מספריים מסוג Vannas, לעשות חתך קטן בעור, שריר ו peritoneum בצד שמאל של הקיר הצפי להיכנס לחלל הצפי כ 5 מילימטרים מתחת לקצה התחתון של כלוב הצלעות. אתר את הטחול ולהשתמש מדפים כדי למשוך אותו מעט לאזור ההפעלה לגישה קלה ולהכניס את מחט 30 מד לתוך הקוטב התחתון של הטחול. לאחר מכן, לפתוח את הבוכנה של פיפטה מחלק ולחלק 10 microliters של נפח בכל פעם, עם מגבלה של 60 עד 80 microliters לכל טחול.לסגת את המחט לאט ולגזור את הטחול עם קליפים קשירה באמצעות קשירה applier. לאחר מכן, השתמשו במוליך כותנה רטוב עם PBS סטרילי כדי לדחוף את הטחול בחזרה לחלל הגוף. השתמש בתבנית תפר מופרעת כדי לסגור את שכבת השריר של דופן הבטן.השג סגירת עור עם תבנית תפר מופרעת באמצעות תפרים שאינם ניתנים לספיגה. העבר את כל החומרים הדרושים למתקן ייעודי של Biosafety רמה 2 פלוס. ללבוש ציוד הגנה אישי כולל כיסוי חד פעמי כל השמלה, כיסויי נעליים, מסכת פנים וכפפות כפולות, כולל כפפות עמידות לחתוך, בכל עת תוך כדי עבודה עם הנגיף.בחר עכברים עם ארגון מחדש של יותר מ 15% של תאים חיוביים CD45 אנושי עם נוכחות של אלבומין אנושי בסרום עבור זיהום HIV-1. תוך-אפית להזריק את העכברים עם 1, 000 כדי 10, 000 רקמות תרבות מינונים זיהומיות של 50 HIV-1 ADA בנפח של 100 כדי 200 microliters לכל עכבר. לאחר המתת חום העכברים, יש למלמל את הכבד מכל עכבר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לאסוף ולתקן את הכבדים ב 4% paraformaldehyde לילה. הקמת מודל עכבר אנושי כפול עם כבד אנושי ותאי מערכת החיסון ניתן לפקח בקלות בכל שלב עם ELIZA פשוט מאוד cytometry זרימה, בהתאמה. ציטומטריית זרימה מבוצעת באופן קבוע כדי להעריך את התפתחות המערכת החיסונית תפקודית ולראות את ההשפעה של הידבקות ב- HIV על תאי החיסון.בעכברים אנושיים כפולים, ההתפתחות של תאים חיסוניים תפקודיים יכולה לנוע בין 15 ל -90% משער הלימפוציטים. להערכת חריטה של hepatocytes אנושי, ELIZA עבור רמות אלבומין ספציפי לאדם מבוצע מדי חודש על סרום העכבר. עכברים חרובים הן HSPCs ו HEPs להראות רמות אלבומין ספציפיות לאדם החל בערך שבעה מיקרוגרם למיליליטר ל 377 מיקרוגרם למיליליטר בחודש אחד, ממשיך לגדול לאורך זמן התצפית.ההשפעה של הידבקות ב- HIV על תאים חיסוניים אנושיים בדם של עכברים אנושיים כפולים מנוטרת על ידי ציטומטריית זרימה ועל HEPs בכבד על ידי אלבומין ספציפי לאדם ELIZA. על ידי חמישה שבועות, HIV-1 גורם לירידה ברמות אלבומין אנושי בסרום ויש דלדול של hepatocytes CK18 אנושי חיובי בחלקי הכבד של עכברים אנושיים כפולים. נמוך יותר של יחס של CD4 ל CD8 הוא ציין בדרך כלל בדם ובכבד של עכברים נגועים ב- HIV, בהשוואה לרמות שצוינו באותו עכבר לפני ההדבקה.דם צריך להיות שכבתי בזהירות על גבי מדיום הפרדת לימפוציטים עבור בידודים של מעיל באפי. לניתוח, להחזיק את הטחול בעדינות ולהכניס את המחט בקוטב התחתון של הטחול. בעקבות הבידוד של תאי גזע hematopoietic, זה חיוני כדי לבדוק את הטוהר של CD34 תאי גזע hematopoietic חיובי, כדי למנוע CD3 תאים חיוביים זריקות חריפות של hepatocyte מתורם אחר.כמו העכברים האנושיים מראים היבט פיזיולוגי של המערכת החיסונית האנושית והכבד, העכברים המפותחים יכולים להיות מנוצלים כדי לחקור פיזיותרפיה של HIV וזיהומים פיזיים שחמת הכבד.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

ב גיבוש biofilm חוץ גופית ב 8-Slide גם לשכת

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

החרקים<em&gt; גלרית mellonella</em&gt; כדגם זיהום רב עצמה כדי לחקור פתוגנזה קטריאלי

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...