Name: establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所の助成金R24OD018546(L.Y.P.およびS.G.)によって支援されました。著者らは、外科的処置の助けに対して、アマンダ・ブランチ・ウッズ、B.S.、免疫組織学のためのヤン・チェン、UNMCフローサイトメトリー研究施設メンバーのフィリップ・ヘクスリー、博士、ビクトリア・B・スミス、B.S.、サマンサの助けに感謝したいと思います。ウォール、B.S.、UNMCは、技術サポートのためのジャニスA.テイラー、B.S.、およびジェームズR.Talaska、B.S.の高度な顕微鏡検査コア施設メンバー。著者らは、TK-NOGマウスとヨアヒム・バウムガート博士がトレオスルファンを提供したことを認めている。著者は、原稿への彼女の編集貢献のために、UNMCのエイドリアン・コエスター博士に感謝しています。

このプロトコルは、ネブラスカ大学医療センターの機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
注:動物実験を行う前に、地元のIACUCから承認を得る。
1. 臍帯血の処理とヒトHSPCの分離
<ol><li>層流のキャビネットの無菌条件の下で議定書のすべてのステップを行う。</li>
	<li>ヘパリン化チューブで採取した臍帯血(CB)を...

<ol>
	<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+specific+causes+of+death+amongst+HIV-positive+individuals+in+the+D:A:D+Study.">Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study.</a> AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).</li><li>Puoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+for+liver+disease+in+patients+with+HIV+infection:+a+cohort+study.">Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).</li><li>Rodriguez-Mendez, M. 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L., Kovalev, G. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-acting+nanoformulated+antiretroviral+therapy+elicits+potent+antiretroviral+and+neuroprotective+responses+in+HIV-1-infected+humanized+mice.">Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice.</a> AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).</li><li>Sun, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+chimeric+mouse+models+of+hepatitis+B+virus+infection.">Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection.</a> International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).</li><li>Shafritz, D. A., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+and+experimental+conditions+that+lead+to+effective+repopulation+of+the+liver+by+transplanted+cells.">Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).</li><li>Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+human+hepatocytes+by+human+hematopoietic+stem+cells+in+sheep.">Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep.</a> Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).</li><li>Streetz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+parenchymal+replacement+in+mice+by+transplanted+allogeneic+hepatocytes+is+facilitated+by+bone+marrow+transplantation+and+mediated+by+CD4+cells.">Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells.</a> Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).</li></ol>

肝臓は、HIV感染患者24で侵害され、損傷を受けている。HIV-1の存在下でヒト肝疾患を研究するための実験的な小動物モデルは、CD34 +HSPCおよび肝細胞7、12を有するいくつかの共移植動物モデルの利用可能性にもかかわらず、極めて限られている。 25.インビトロ実験では、肝細胞は低レベルのHIV-1<sup ...

抗レトロウイルス療法の出現以来、HIV-1単感染に関連する死亡が大幅に減少している。しかし、肝疾患はHIV感染患者1,2の罹患率の一般的な原因として現れた。HIV-1感染を伴う肝炎ウイルスの共感染はより一般的であり、米国ではHIV感染者の10%~30%を占める3、4、5を占めている。
HIV-1および肝炎ウイルスの宿主特異性は、ヒト特異的感染症を研究したり、HIV-1関連肝病因の複数の側面を調査するために、小動物モデルの有用性を制限する。ヒト細胞および/または組織の生着を可能にする免疫不欠性マウス(ヒト化マウスモデルと呼ばれています)は、前臨床試験6、7、8の許容可能な動物モデルである。2000年代初頭にヒト化マウスが導入されて以来、胆嚢突起ヒト肝毒性、HIV-1およびHIV関連神経認知障害を含むヒト特異的病原体、エプスタインバーウイルス、肝炎、および他の複数の前臨床研究感染症は、これらのマウス6、9、10、11で調査されている。CD34+HSPCおよび/またはヒト肝細胞移植のための複数のマウスモデルは、長い間開発され、B型肝炎ウイルス(HBV)関連肝疾患12の疾患病因を研究するために時間をかけて改善されてきた、13歳,14.HSPCおよびヒト肝細胞(HEP)移植のためのいくつかのモデルは、NOG(NOD)として知られている株に基づいている。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15、 バルブ/C-ラグ2-/- γ-/- γ -/- (Rag2 tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flg tm1.1Flv/J)12、および fah-/- NOD ラグ1-/--il2rγヌルマウス16.ただし、各モデルには独自の長所と制限があります。例えば、BALb/C-Rag2上のHEPおよびヒト幹細胞(HSC)のAFC8二重ヒト化マウスは、免疫細胞およびHSCの正常な生着を可能にするが、抗原特異的なT細胞およびB細胞が存在しないこのモデル12での応答 .二重ヒト化マウスの再構成における主な懸念は、最適でない生着、異なる組織をサポートするための適切なモデルの欠如、不一致の状態、免疫拒絶反応、または移植片対宿主病(GVHD)、および技術的な新生児による危険な操作や代謝異常による死亡率の高さなどの困難13.
ヒト化マウスは17年、18年、19年のHIV研究に長年使用されてきたが、HIV-1による肝臓損傷を研究するヒト化マウスの使用は20件に制限されている。我々は以前に、二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立とHIV関連肝疾患8におけるその応用を報告した。このモデルは、肝臓および免疫細胞の堅牢な生着を示し、HIV感染病因を要約する。この議論は、ヒト肝細胞移植における最も重要なステップを含む詳細なプロトコルを提示する。HEPの移植に成功するために必要なHSPCの説明とTK-NOGマウスにおける機能性免疫系の確立についても説明する。これらのマウスをHIV関連肝免疫病因の研究に用いることは詳細である。肝臓特異的ヘルペス単純ヘルペスウイルス1チミジンキナーゼ(HSV-TK)トランスジーンを担持するTK-NOG雄マウスが用いられる。このトランスジーンを発現するマウス肝細胞は、GCVの非毒性用量への短時間暴露後に容易にアブレートすることができる。移植されたヒト肝細胞は、外因性薬物なしでマウス肝臓内で安定に維持される21.マウスはまた、ヒト細胞8のマウス骨髄にニッチを作成するために、トレオスルファンの非骨髄切除用量で予め定められている。免疫不全のTK-NOGマウスは、HEPおよび多能性HSPCを神経中注射する。その後、マウスは、血液免疫の入力と血清ヒトアルブミンレベルの測定によって、血液および肝臓の再構成について定期的にモニタリングされる。ヒト免疫細胞とHEPの両方に対して15%以上の再構成に成功したマウスは、HIV-1を食前食内注射する。肝臓に対するHIVの効果は、早ければ4~5週間の感染後に評価することができる。HIV-1が使用されているので、ウイルスを処理し、マウスに注入する際に必要なすべての予防措置を取る必要があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">27G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:125px;">30G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">5 mL polystyrene&#160; round-bottom tube 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">352054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS array bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">For purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">BD FACS array software</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS lysing solution</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">349202</td>
			<td style="width:167px;">To lyse red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument for acquisiton of flow cytometry samples</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tube</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">BD 367874</td>
			<td style="width:167px;">To collect Cord blood</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A9576</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Controlled substance and pain-killer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD14-PE</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555398</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD19-BV605</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562653</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:125px;">CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-046-702</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; CD34+ HSPC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">CD34-PE, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-081-002</td>
			<td style="width:167px;">Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD3-AF700</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">557943</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD45-PerCPCy5.5</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">564105</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555349</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD8-BV421</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562428</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cell counting slides</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">CS11204</td>
			<td style="width:167px;">for extraction of genomic DNA from ear piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cobas Amplicor system v1.5&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">bioanalyzer to measure viral load</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cotton-tipped applicators&#160;</td>
			<td style="width:135px;">&#160;McKesson</td>
			<td style="width:127px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cytokeratin-18 (CK18)</td>
			<td style="width:135px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">M7010</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D2650-5X5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:125px;">Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">30914</td>
			<td style="width:167px;">Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FACS Diva version 6</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometer software required for&#160; acqusition of sample</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">10438026</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FLOWJO analysis software 
			v10.2</td>
			<td style="width:135px;">FLOWJO, LLC</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:135px;">APP Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">315110</td>
			<td style="width:167px;">Prescripition drug</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td>
			<td style="width:135px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:127px;">450475</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Hepatocytes thawing medium&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">MCHT50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Horizon Open Ligating Clip Appliers</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:127px;">537061</td>
			<td style="width:167px;">To hold the ligating clips</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Hospira Sterile Water for Injection</td>
			<td style="width:135px;">ACE surgical supply co. Inc.</td>
			<td style="width:127px;">001-1187</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of Buprenorphine (pain-killer)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td style="width:135px;">Bethyl laboratories</td>
			<td style="width:127px;">E80-129</td>
			<td style="width:167px;">For assesing human albumin levels in mouse serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human hepatocyte</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">HUCP1</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Iris Scissors, Straight</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">13295</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Lancet</td>
			<td style="width:135px;">MEDIpoint</td>
			<td style="width:127px;">Goldenrod 5 mm</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-401</td>
			<td style="width:167px;">Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:135px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:127px;">50494</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; lymphocytes from peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-303</td>
			<td style="width:167px;">holds Qudro MACS seperator and LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5605</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5157&#160;</td>
			<td style="width:167px;">to hold and pull out spleen from peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">mouse CD45-FITC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">553080</td>
			<td style="width:167px;">mouse-specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td style="width:135px;">Hyclone</td>
			<td style="width:127px;">SH30256.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Qudro MACS separator&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-090-976</td>
			<td style="width:167px;">holds four LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">11875093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">StepOne Plus Real Time PCR&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument used&#160; to&#160; genotype</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml</td>
			<td style="width:135px;">DYMAX CORP</td>
			<td style="width:127px;">T15469</td>
			<td style="width:167px;">Used to&#160; dispense&#160; HSPC and HEP supension in controlled manner</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Suturevet PGA synthetic absorbale suture</td>
			<td style="width:135px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:127px;">41178</td>
			<td style="width:167px;">Suturing of skin and peritoneum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">4369016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:125px;">TK-NOG mice&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Treosulfan</td>
			<td style="width:135px;">Medac GmbH</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by &#160;Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450022</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">1346</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Weck hemoclip traditional titanium ligating clips</td>
			<td style="width:135px;">Esutures</td>
			<td style="width:127px;">523700</td>
			<td style="width:167px;">To ligate the spleen post-injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis

ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)に感染した患者の平均余命が増加しているにもかかわらず、肝疾患は罹患率の一般的な原因として浮上している。HIV-1によって引き起こされる肝免疫病理学は、依然として不明なままである。ヒト肝細胞およびヒト免疫系を有する小さな異種移植片動物モデルは、疾患の病因のヒト生物学を要約することができる。本明細書において、ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)移植を介して二重ヒト化マウスモデルを確立するプロトコルが記載され、HIV感染患者で観察される肝臓免疫病理を研究する。二重再構成を達成するために、男性TK-NOG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgTm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic)マウスは、マウストランスジェニック肝細胞を排除するためにガンシクロビル(GCV)用量を経頭食内注射し、非筋筋形成調節のためのトレオスルファンを用いる。ヒト肝細胞(HEP)移植およびヒト免疫系(HIS)の発達を促進する。ヒトアルブミン(ALB)レベルは肝臓移植について評価され、フローサイトメトリーによって検出された血液中のヒト免疫細胞の存在は、ヒト免疫系の確立を確認する。ここで説明するプロトコルを使用して開発されたモデルは、HIV-1感染による肝臓損傷の複数の成分に似ています。その確立は、肝炎ウイルス共感染症の研究と抗ウイルス薬と抗レトロウイルス薬の評価のために不可欠であることが証明される可能性があります。

ヒト肝臓および免疫細胞を用いた二重ヒト化マウスモデルの確立は、それぞれ非常に簡単なELISAおよびフローサイトメトリーで各ステップで容易に監視することができる。フローサイトメトリーは、機能性免疫系の発達を評価し、免疫細胞に対するHIV感染の影響を確認するために定期的に行われる。二重ヒト化マウスでは、機能性免疫細胞の発達は、リンパ球門の15%?...

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Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

このプロトコルは、ヒト免疫系および肝細胞の両方を有するヒト化マウスを確立するための信頼性の高い方法を提供する。ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞の脾臓内注射を介して達成される二重再構成免疫不全マウスは、ヒト免疫不全ウイルス-1感染の影響を受けやすく、肝臓損傷を再キャパチレートするHIVに感染した患者

HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

このプロトコルの全体的な目的は、ヒト造血幹細胞およびヘパト部位を用いて、機能的ヒト免疫系と肝臓を有するヒト化マウスモデルを生成することである。この方法は、遺伝子肝ヒト化マウスの主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、HIVによって引き起こされる免疫病理学を研究するための強力なツールを提供します。このプロセスのデモンストレーションは、病理学と微生物学部門のスーパーバイザーであるYimin Sunと、研究技術者のウェイミン・ワンとエドワード・マカロフが行います。まず、ヘパリンチューブで採取した臍帯血を滅菌層流れキャビネットに移します。35ミリリットルにボリュームが増加するまでPBSを追加します。サンプルをリンパ球分離培地の上に重ね、遠心分離機でGを400倍、摂氏4度で35分間、休憩を取らずに重ねます。次に、上部のプラズマ層を慎重に取り外し、トランスファーピペットを使用して白いバフィーコートインターフェースを新しいチューブに移します。30~40ミリリットルの氷冷バッファーでバフィーコートを再中断します。ピペットを使用して、セル懸濁液の20マイクロリットルを0.4%トリパンブルーの20マイクロリットルと組み合わせます。この混合物のピペット10マイクロリットルは、計数スライドの2つのチャンバーのどちらかの外側の開口部に、セルをカウントするために自動化されたセルカウンターにスライドを挿入します。細胞をGの300倍、摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を慎重に吸引し、300マイクロリットルの氷冷バッファーを加えます。100マイクロリットルのヒトFC受容体遮断試薬と100マイクロリットルのモノクローナルマウス抗ヒトCD34抗体を最大1億個の細胞に結合させたマイクロビーズを加える。摂氏4度で30分間インキュベートします。10ミリリットルの氷冷バッファーを加え、細胞を洗浄し、遠心分離機でGの300倍、摂氏4度を10分間加えます。上清を慎重に取り除き、500マイクロリットルの氷冷バッファーでペレットを再懸濁します。この後、磁気活性化細胞選別フィールドに正の選択LS列を配置し、氷冷バッファーの3ミリリットルでそれを通過します。サンプル内のヒトCD34陽性細胞に結合したマイクロビーズを捕捉できるLSカラムにサンプルをロードし、重力の影響下でコレクションチューブに流れ込むことができます。氷冷バッファーでカラムを3回洗浄し、同じコレクションチューブに溶出液を集めます。次に、5 ミリリットルの氷冷バッファーでカラムを突き飛ばして、CD34 陽性細胞を新しいコレクションチューブに入れます。90%以上の純度を達成する手順を繰り返し次に、トリパンブルー色素とヘモサイトメーターを使用して、排除されたCD34陽性細胞を数える。計数後、5分間Gの300倍で細胞を遠心分離する。上清を捨て、細胞をPBSの125マイクロリットルで再中断し、注射をすぐに移植に使用します。CD34陽性溶離液の純度を確認するには、懸濁液の50マイクロリットルを取り、30分間摂氏4度で10マイクロリットルのPE共役抗ヒトCD34抗体と共にインキュベートします。この後、PBS内の細胞を洗浄し、再懸濁し、フローサイトメトリーを行う。取得後、テキストプロトコルに示されているデータを分析します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、凍結保存された肝細胞を取得して解凍します。次に、バイオキャップを取り除き、解凍した肝細胞を温めた解凍媒体を含む50ミリリットルの円錐状チューブに注ぎます。チューブを手で数秒揺らし、細胞を一時停止します。細胞をGの100倍、室温で8分間ペレットする。ペレット化した細胞をPBSで0.1%BSAで洗浄し、PBSの新鮮なHSPCsまたは解凍したHSPCsを使用して、1個のマウスあたり80マイクロリットルの最終体積にプールします。まず、滅菌延長チューブの一方の端を30ゲージ針に取り付け、もう一方の端を1ミリリットルのシリンジに取り付けます。シリンジにプールされたHEPとHSPの懸濁液を充填し、反復塗布ピペットのノッチに注射器をフィットさせ、ディスペンサーを調整して各プレスで10マイクロリットルを分配します。テキストプロトコルで概説されているように各マウスを剃り、10%ポビドーネで各マウスの体の左側をスクラブし、70%イソプロピルアルコールに続きます。Vannas型はさみを使用して、胸壁の左側の皮膚、筋肉および腹膜に小さな切開を行い、肋骨ケージの下端から約5ミリメートル下の腹腔に入ります。脾臓を見つけ、簡単にアクセスするために操作領域にわずかに引っ張るために鉗子を使用し、脾臓の下極に30ゲージの針を挿入します。次に、分配ピペットのプランジャーのロックを解除し、脾臓あたり60〜80マイクロリットルの制限で、一度に体積の10マイクロリットルを分配します。針をゆっくりと引っ込め、ライゲーションアプライヤーを使用してリゲーティングクリップで脾臓をクリップします。次に、無菌PBSで濡れた綿先端アプリケーターを使用して脾臓を体腔に押し戻します。中断された縫合パターンを使用して、腹壁の筋肉層を閉じます。非吸収性縫合糸を使用して中断された縫合線パターンで皮膚閉鎖を達成する。すべての必要な材料を指定されたバイオセーフティレベル2プラス施設に移します。ウイルスと一緒に作業中に、すべてのガウン、靴カバー、フェイスマスク、カット耐性手袋を含むダブル手袋を含む個人用保護具を常に着用してください。ヒトCD45陽性細胞の15%以上の再構成を有し、HIV-1感染のための血清中にヒトアルブミンの存在を有するマウスを選択する。腹腔内にマウスに1,000~10,000の組織培養感染量50HIV-1 ADAを1匹あたり100~200マイクロリットルの体積で注入する。マウスを安楽死させた後、テキストプロトコルに概説されているように、各マウスから肝臓を切除する。一晩4%パラホルムアルデヒドで肝臓を収集し、修正します。ヒト肝臓と免疫細胞を持つ二重ヒト化マウスモデルの確立は、それぞれ非常に簡単なELIZAとフローサイトメトリーを用いて各ステップで容易に監視することができる。フローサイトメトリーは、機能性免疫系の発達を評価し、HIV感染が免疫細胞に及ぼす影響を確認するために定期的に行われる。二重ヒト化マウスでは、機能的免疫細胞の発達はリンパ球ゲートの15〜90%の範囲であり得る。ヒト肝細胞の生着の評価のために、ヒト特異的なアルブミンレベルに対するELIZAは、マウス血清上で毎月行われる。HSPとHEPの両方を用いたマウスは、1ミリリットル当たり約7マイクログラムから1ヶ月あたり377マイクログラムまでのヒト特異的アルブミンレベルを示し、観察の時間をかけて成長し続ける。二重ヒト化マウスの血液中のヒト免疫細胞に対するHIV感染の影響は、ヒト特異的アルブミンELIZAによって肝臓のフローサイトメトリーおよびHEPによって監視される。5週間までに、HIV-1は血清中のヒトアルブミンレベルの低下を引き起こし、二重ヒト化マウスの肝臓切片にヒトCK18陽性肝細胞が枯渇する。CD4対CD8の比率は、感染前の同じマウスに記載されたレベルと比較して、HIV感染マウスの血液および肝臓で典型的に観察される。血液は、バフィーコートの分離のためにリンパ球分離媒体の上に慎重に重ねるべきです。手術のために、脾臓を優しく保持し、脾臓の下極に針を挿入します。造血幹細胞の単離に続いて、CD34陽性造血幹細胞の純度をチェックして、CD3陽性細胞および異なるドナーからの肝細胞の急性注射を避けることは重要です。ヒト化マウスはヒト免疫系と肝臓の生理学的側面を示すため、開発されたマウスはHIVおよび身体的感染症および肝硬変の生理病原性を研究するために利用することができる。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

幹細胞ベースの遺伝子治療腫瘍モデルとしてBLTヒト化マウスを用いた

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

昆虫<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;細菌性病因を調査するための強力な感染モデルとして

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの病原性を研究するためのEx Vivo鶏ファブリキウス嚢細胞培養モデル

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

病原性と線虫モデルにおけるアエロモナス感染症の病態の評価

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...