Name: establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

이 작품은 국립 보건 원 보조금 R24OD018546에 의해 지원되었다 (L.Y.P. 및 S.G.에). 저자는 외과 적 절차에 도움을 Weizhe 리, 박사, 박사, 아만다 지점 우즈, B.S., 면역 신체 에 대한 얀 청, UNMC 흐름 세포 분석 연구 시설 회원 이사 필립 헥슬리, 박사, 빅토리아 B. 스미스, B.S., 및 사만다에 도움을 감사드립니다 월, B.S., UNMC 고급 현미경 핵심 시설 회원 제니스 A. 테일러, B.S., 제임스 R. Talaska, B.S., 기술 지원을 위해. 저자는 TK-NOG 마우스와 테오술판을 제공하는 요아킴 바움가르트 박사를 제공한 CIEA의 이토 마모루 박사와 스에미즈 히로시 박사를 인정합니다. 저자는 원고에 그녀의 편집 기여에 대한 박사 아드리안 Koesters, UNMC, 감사합니다.

이 프로토콜은 네브래스카 대학 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고: 동물 실험을 수행하기 전에 현지 IACUC의 승인을 얻으실 수 있습니다.
1. 배꼽 제대혈 의 처리 와 인간 HSPC의 격리
<ol><li>층류 캐비닛의 멸균 조건하에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다.</li>
	<li>헤파린화 된 튜브에서 수집 된 ...

<ol>
	<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+specific+causes+of+death+amongst+HIV-positive+individuals+in+the+D:A:D+Study.">Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study.</a> AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).</li><li>Puoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+for+liver+disease+in+patients+with+HIV+infection:+a+cohort+study.">Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).</li><li>Rodriguez-Mendez, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+parenchymal+replacement+in+mice+by+transplanted+allogeneic+hepatocytes+is+facilitated+by+bone+marrow+transplantation+and+mediated+by+CD4+cells.">Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells.</a> Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).</li></ol>

간은 HIV에 감염된 환자24에서손상되고 손상됩니다. HIV-1의 존재에 있는 인간적인 간 질병을 공부하기 위한 실험적인 작은 동물 모형은 CD34+ HSPC 및 간세포7,12를가진 몇몇 공동 이식한 동물 모형의 가용성에도 불구하고, 극단적으로 제한됩니다 25. 시험관 내 실험에서, 간세포는 낮은 수준의 HIV-1 감염<su...

항 레트로 바이러스 치료의 출현 이후, HIV-1 단독 감염과 관련된 사망이 상당히 감소했습니다. 그러나, 간 질환은 HIV 감염 환자에서 이환율의 일반적인 원인으로등장하고있다 1,2. HIV-1 감염을 가진 간염 바이러스의 공동 감염은 미국에 있는 HIV 감염한 사람의 10% - 30%를 차지하는 일반적입니다3,4,5.
HIV-1 및 간염 바이러스의 호스트 특이성은 인간 특정 전염병을 연구하거나 HIV-1 관련 간 병인의 다중 양상을 조사하기 위하여 작은 동물 모형의 유용성을 제한합니다. 인간 세포 및/또는 조직(인간화마우스 모델이라고 불등)의 생생을 허용하는 면역결핍 마우스는 전임상연구에서6,7,8에허용되는 동물 모델이다. 2000 년대 초반에 인간화 된 마우스의 도입 이후, 담즙 정체 인간의 간 독성의 여러 전임상 연구, HIV-1 및 HIV 관련 신경 인지 장애를 포함한 인간 특정 병원체, 엡스타인 바 바이러스, 간염, 기타 감염성 질환은, 이들 마우스6,9,10,11에서조사되었다. CD34+ HSPC 및/또는 인간 간세포 이식에 대한 다중 마우스 모델은 오랫동안 개발되어 왔으며 시간이 지남에 따라 B형 간염 바이러스(HBV)-관련 간 질환의 질병 발병기전을 연구하기 위해 개선되었습니다12. 13세 , 14. HSPC 및 인간 간세포 (HEP) 이식에 대한 여러 모델은 NOG (NOD)로 알려진 균주를 기반으로합니다. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13,NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15,Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12,및 fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull 마우스16. 그러나 각 모델에는 고유한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, BALb/C-Rag2-/- γc-/- 배경상에 있는 HEPs 및 인간 줄기 세포(HSC)를 위한 AFC8 이중 인간화 마우스는 면역 세포와 HSC의 성공적인 생착을 가능하게 하지만 항원 특이적 T-및 B 세포의 부재가 있습니다. 이 모델12의응답 . 이중 인간화 마우스를 재구성하는 주요 관심사는 최적이 아닌 생착, 다른 조직을 지원하기위한 적합한 모델의 부족, 불일치 조건, 면역 거부, 또는 이식편대- 숙주 질환 (GVHD) 및 기술 신생아와 함께 위험한 조작과 신진 대사 이상으로 인한 높은 사망률과 같은 어려움13.
인간화마우스는17, 18,19년동안 HIV 연구에 사용되어 왔지만, HIV-1에 의한 간 손상을 연구하기 위해 인간화된 마우스의 사용은20개에제한되어 왔다. 우리는 이전에 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델의 설립과 HIV 관련 간 질환에 그것의 응용 프로그램의설립을보고 8. 이 모형은 간 및 면역 세포의 강력한 생착을 보여주고 HIV 감염 병인을 되풀이합니다. 이 토론은 인간 간세포의 이식에 있는 가장 중요한 단계를 포함하여 상세한 프로토콜을 제출합니다. HEPs의 성공적인 생착 및 TK-NOG 마우스에서 기능성 면역 계통의 확립에 필요한 HSPC에 대한 설명도 제시된다. HIV 관련 간 면역요법을 연구하기 위하여 이 마우스의 사용은 상세한입니다. 간특이적 포진심플렉스 바이러스 타입 1티미딘 키나아제(HSV-TK)를 운반하는 TK-NOG 수컷 마우스가 이식유전자를 사용한다. 이 이식유전자를 발현하는 마우스 간 세포는 GCV의 비독성 용량에 잠깐 노출된 후에 쉽게 절제될 수 있다. 이식된 인간 간 세포는 외인성 약물 없이 마우스 간 내에서 안정적으로유지된다(21). 마우스는 또한 인간 세포에 대한 마우스 골수에 틈새 시장을 만들기 위해 treosulfan의 비myeloablative 복용량으로전제조건8. 면역결핍 TK-NOG 마우스는 HEPs 및 다능성 HSPC로 경내 주사된다. 마우스는 혈액 면역 phenotyping 및 혈청 인간 알부민 수준의 측정에 의해 혈액과 간 재구성을 위해 정기적으로 모니터링됩니다. 인간 면역 세포와 HEPs 둘 다에 대해 15% 이상의 성공적인 재구성을 가진 마우스는 복강 내 HIV-1로 주입됩니다. 간장에 대한 HIV의 효과는 감염 후 4 - 5 주 일찍 평가 할 수 있습니다. HIV-1이 사용되기 때문에 바이러스를 처리하고 마우스에 주입하는 동안 필요한 모든 예방 조치를 취해야합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">27G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:125px;">30G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">5 mL polystyrene&#160; round-bottom tube 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">352054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS array bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">For purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">BD FACS array software</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS lysing solution</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">349202</td>
			<td style="width:167px;">To lyse red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument for acquisiton of flow cytometry samples</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tube</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">BD 367874</td>
			<td style="width:167px;">To collect Cord blood</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A9576</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Controlled substance and pain-killer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD14-PE</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555398</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD19-BV605</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562653</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:125px;">CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-046-702</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; CD34+ HSPC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">CD34-PE, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-081-002</td>
			<td style="width:167px;">Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD3-AF700</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">557943</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD45-PerCPCy5.5</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">564105</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555349</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD8-BV421</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562428</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cell counting slides</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">CS11204</td>
			<td style="width:167px;">for extraction of genomic DNA from ear piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cobas Amplicor system v1.5&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">bioanalyzer to measure viral load</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cotton-tipped applicators&#160;</td>
			<td style="width:135px;">&#160;McKesson</td>
			<td style="width:127px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cytokeratin-18 (CK18)</td>
			<td style="width:135px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">M7010</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D2650-5X5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:125px;">Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">30914</td>
			<td style="width:167px;">Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FACS Diva version 6</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometer software required for&#160; acqusition of sample</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">10438026</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FLOWJO analysis software 
			v10.2</td>
			<td style="width:135px;">FLOWJO, LLC</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:135px;">APP Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">315110</td>
			<td style="width:167px;">Prescripition drug</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td>
			<td style="width:135px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:127px;">450475</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Hepatocytes thawing medium&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">MCHT50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Horizon Open Ligating Clip Appliers</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:127px;">537061</td>
			<td style="width:167px;">To hold the ligating clips</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Hospira Sterile Water for Injection</td>
			<td style="width:135px;">ACE surgical supply co. Inc.</td>
			<td style="width:127px;">001-1187</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of Buprenorphine (pain-killer)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td style="width:135px;">Bethyl laboratories</td>
			<td style="width:127px;">E80-129</td>
			<td style="width:167px;">For assesing human albumin levels in mouse serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human hepatocyte</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">HUCP1</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Iris Scissors, Straight</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">13295</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Lancet</td>
			<td style="width:135px;">MEDIpoint</td>
			<td style="width:127px;">Goldenrod 5 mm</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-401</td>
			<td style="width:167px;">Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:135px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:127px;">50494</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; lymphocytes from peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-303</td>
			<td style="width:167px;">holds Qudro MACS seperator and LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5605</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5157&#160;</td>
			<td style="width:167px;">to hold and pull out spleen from peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">mouse CD45-FITC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">553080</td>
			<td style="width:167px;">mouse-specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td style="width:135px;">Hyclone</td>
			<td style="width:127px;">SH30256.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Qudro MACS separator&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-090-976</td>
			<td style="width:167px;">holds four LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">11875093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">StepOne Plus Real Time PCR&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument used&#160; to&#160; genotype</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml</td>
			<td style="width:135px;">DYMAX CORP</td>
			<td style="width:127px;">T15469</td>
			<td style="width:167px;">Used to&#160; dispense&#160; HSPC and HEP supension in controlled manner</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Suturevet PGA synthetic absorbale suture</td>
			<td style="width:135px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:127px;">41178</td>
			<td style="width:167px;">Suturing of skin and peritoneum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">4369016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:125px;">TK-NOG mice&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Treosulfan</td>
			<td style="width:135px;">Medac GmbH</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by &#160;Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450022</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">1346</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Weck hemoclip traditional titanium ligating clips</td>
			<td style="width:135px;">Esutures</td>
			<td style="width:127px;">523700</td>
			<td style="width:167px;">To ligate the spleen post-injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis

인간 면역 결핍 바이러스-1 (HIV-1)에 감염된 환자의 기대 수명이 증가했음에도 불구하고 간 질환은 이환율의 일반적인 원인으로 나타났습니다. HIV-1에 기인한 간 면역 병리학은 애매하게 남아 있습니다. 인간 간세포및 인간 면역 계통을 가진 작은 이종이식 동물 모형은 질병의 병인의 인간 생물학을 되풀이할 수 있습니다. 본 명세서에서, 프로토콜은 인간 간세포 및CD34+ 조혈줄기/전구세포(HSPC) 이식을 통해 이중 인간화된 마우스 모델을 확립하고, HIV 감염 환자에서 관찰된 바와 같이 간 면역병리학을 연구하기 위해 기술된다. 이중 재구성을 달성하기 위해, 남성 TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg (Alb-TK)7-2/ShiJic) 마우스는 쥐 형질전환 간 세포를 제거하기 위해 간시 클로비르 (GCV) 투여량으로 복강 내 주입, 그리고 비 myeloablative 컨디셔닝을위한 treosulfan, 둘 다 인간 간세포 (HEP) 생착 및 인간 면역 체계 (HIS) 개발을 용이하게합니다. 인간 알부민(ALB) 수준은 간 생착에 대해 평가되고, 유세포측정에 의해 검출된 혈액내 인간 면역 세포의 존재는 인간 면역 계통의 확립을 확인한다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 개발된 모델은 HIV-1 감염으로 인한 간 손상의 여러 구성 요소와 유사합니다. 그것의 설립은 간염 바이러스 공동 감염의 연구 결과 및 항 바이러스 및 항 레트로 바이러스 약물의 평가에 필수적인 증명할 수 있었습니다.

인간의 간 및 면역 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모형의 설치는 각각 아주 간단한 ELISA 및 유세포 측정을 가진 각 단계에서 쉽게 감시될 수 있습니다. 유세포측정은 기능성 면역 계통의 발달을 평가하고 면역 세포에 대한 HIV 감염의 효과를 보기 위해 정기적으로 수행된다. 이중 인간화 마우스에서 기능성 면역 세포의 발달은 림프구 게이트의 15 %에서 90 %까지 다양할 수 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

이 프로토콜은 인간 면역 계통 및 간 세포 둘 다로 인간화한 마우스를 설치하는 믿을 수 있는 방법을 제공합니다. 인간 간세포 및 CD34+ 조혈 줄기 세포의 경내 주사를 통해 달성된 이중 재구성 면역 결핍 마우스는 인간 면역 결핍 바이러스-1 감염에 취약하고 관찰된 바와 같이 간 손상을 재현합니다. HIV에 감염된 환자.

HIV 관련 간 병인을 위한 이중 인간화 TK-NOG 마우스 모델 구축

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

프로토콜의 전반적인 목표는 인간 조혈 줄기 세포 및 헤파토 부위를 사용하여 기능적 인간 면역 체계및 간을 가진 인간화된 마우스 모델을 생성하는 것입니다. 이 방법은 유전 간 인간화 마우스에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 방법은 사람들에서 관찰된 바와 같이 HIV에 기인한 면역 병리학을 공부하는 강력한 공구를 제공합니다.이 과정을 시연하는 것은 병리학 및 미생물학 부서의 감독자인 이명선(Yimin Sun)과 연구 기술자인 바이핀 왕과 에드워드 마카로프(Edwrd Makarov)가 할 것입니다. 시작하려면, 멸균 라미나르 흐름 캐비닛에 분리 된 튜브에서 수집 된 탯줄 혈액을 전송합니다. 볼륨이 35 밀리리터로 증가할 때까지 PBS를 추가합니다.림프구 분리 매체와 원심분리기 위에 샘플을 400배, 섭씨 4도에서 35분간 나누어 드실 수 있습니다. 다음으로, 조심스럽게 상단 플라즈마 층을 제거하고 새로운 튜브에 흰색 버피 코트 인터페이스를 전송하는 전송 파이펫을 사용합니다. 얼음 차가운 버퍼의 30 ~40 밀리리터에 버피 코트를 다시 중단합니다.파이펫을 사용하여 셀 서스펜션의 마이크로리터 20개에 0.4%의 마이크로리터 20개를 결합합니다. 파이펫 10 마이크로리터는 카운팅 슬라이드의 두 챔버 중 하나의 외부 개구부로, 셀을 계산하기 위해 자동화 된 셀 카운터에 슬라이드를 삽입합니다. 세포를 300배, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.조심스럽게 슈퍼 나티를 흡인하고 얼음 차가운 버퍼 의 300 마이크로 리터를 추가합니다. 인간 FC 수용체 차단 시약 100마이크로리터와 최대 1억 개의 세포에 대한 단일 클론 마우스 항인간 CD34 항체 컨쥬게이드 MicroBeads100 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 30분 동안 배양하세요.10 밀리리터의 얼음 차가운 버퍼를 추가하여 세포를 씻고 원심분리기는 300배, 섭씨 4도를 10분 동안 세척합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 얼음 차가운 버퍼 의 500 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그런 다음, 자기 활성화 셀 선별 필드에 양수 선택 LS 컬럼을 배치하고 얼음 냉기 버퍼의 세 밀리리터로 통과한다.샘플에서 인간 CD34 양성 세포에 바인딩된 MicroBeads를 트랩할 수 있는 LS 컬럼에 샘플을 적재하고 중력의 영향으로 수집 튜브로 흘러들어갈 수 있습니다. 얼음 차가운 버퍼로 컬럼을 세 번 씻고 동일한 수집 튜브에서 용액을 수집합니다. 그런 다음 CD34 양수 세포를 새로운 수집 튜브로 암시하기 위해 얼음 냉부 버퍼 5 밀리리터로 컬럼을 급락시합니다.90% 이상의 순도를 달성하기 위해 절차를 반복하고, 트라이판 블루 염료와 혈안이계를 사용하여 경각증 CD34 양성 세포를 계산합니다. 계산 후, 원심 분리는 5 분 동안 300 배 G에서 세포를 분리합니다. 상체를 버리고 이식시 즉시 사용할 주사를 위해 PBS의 125 마이크로리터에서 세포를 다시 중단한다.CD34 양성 용출물의 순도를 확인하려면 서스펜션의 50 마이크로리터를 복용하여 PE 컨쥬게이드 항인간 CD34 항체 10 마이크로리터로 30분 동안 섭씨 4도에 배양하십시오. 그 후, PBS에서 세포를 세척 및 다시 중단하고 유동 세포 측정을 진행한다. 수집 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 냉동 보존 된 간구를 검색하고 해동합니다. 그런 다음, 바이오 캡을 제거하고 해동 된 간구를 50 밀리리터 원판 튜브에 부어 따뜻하게 해동 매체를 함유한다. 세포를 일시 중단하기 위해 몇 초 동안 손으로 튜브를 흔들어.100 배 G와 8 분 동안 실온에서 세포를 펠렛. PBS에서 펠릿 세포를 0.1%BSA로 세척하고 PBS에 신선하거나 해동된 HSPC를 마우스당 80 마이크로리터로 최종 부피로 풀을 짜십시오. 먼저 멸균 연장 튜브의 한쪽 끝을 30 게이지 바늘에 부착하고 다른 쪽 끝을 1 밀리리터 주사기에 부착합니다.주사기를 풀링된 HEP 및 HSPC의 서스펜션으로 채우면 주사기를 반복적인 분배 파이펫의 노치에 맞추고 디스펜서를 조정하여 각 프레스에 10개의 마이크로리터를 분배합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 마우스를 면도하고 각 마우스의 왼쪽을 10%의 포비도요드로 스크럽하고 70%의 이소프로필 알코올을 사용하였다.Vannas 유형 가위를 사용하여 복막 벽 왼쪽의 피부, 근육 및 복막에 작은 절개를 하여 늑골 케이지의 아래 가장자리 아래 약 5mm 의 복막 구멍에 들어갑니다. 비장을 찾아 서 봉위를 사용하여 작동 영역으로 약간 당겨 쉽게 접근하고 30 게이지 바늘을 비장의 하부 기둥에 삽입합니다. 다음으로, 디스펜싱 파이펫의 플런저를 잠금 해제하고 비장 당 60 ~80 마이크로 리터의 제한으로 한 번에 10 마이크로 리터를 분배합니다.바늘을 천천히 철회하고 계합 심플리어를 사용하여 리깅 클립으로 비장을 잘라냅니다. 그런 다음 멸균 PBS로 젖은 면 팁 어플리케이터를 사용하여 비장을 다시 체공으로 밀어 넣습니다. 중단된 봉합사 패턴을 사용하여 복벽의 근육 층을 닫습니다.흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 중단된 봉합사 패턴으로 피부 클로저작업을 수행합니다. 필요한 모든 재료를 지정된 생물 안전 레벨 2 플러스 시설로 이전합니다. 바이러스를 사용하여 항상 절단 저항 장갑을 포함하여 일회용 커버, 신발 커버, 얼굴 마스크 및 더블 장갑을 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오.인간 CD45 양성 세포의 15% 이상의 재구성을 가진 마우스를 선택하고 HIV-1 감염을 위한 혈청에서 인간 알부민의 존재와 함께 선택하십시오. 마우스당 100~200마이크로리터의 부피로 1, 000~10, 000개의 조직 배양 전염성 투여량을 마우스에 주입한다. 마우스를 안락사한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 마우스에서 간을 절제합니다.수집 하 고 하룻밤 4%의 파라포름알데히드에 간을 수정합니다. 인간 간 및 면역 세포를 가진 이중 인간화 마우스 모형의 설립은 각각 아주 간단한 ELIZA 및 유동 세포질로 각 단계에서 쉽게 감시될 수 있습니다. 유동 세포측정은 기능성 면역 계통의 발달을 평가하고 면역 세포에 HIV 감염의 효력을 보기 위하여 정기적으로 수행됩니다.이중 인간화 마우스에서 기능성 면역 세포의 개발은 림프구 게이트의 15 ~90 %까지 다양할 수 있습니다. 인간 간세포의 이식평가를 위해, 인간특유의 알부민 수준에 대한 ELIZA는 마우스 혈청에서 매월 수행된다. HSPC와 HEP를 이식한 마우스는 밀리리터당 약 7마이크로그램에서 한 달 동안 밀리리터당 377 마이크로그램에 이르는 인간 전용 알부민 수치를 보여주며 관찰 기간 동안 계속 성장하고 있습니다.이중 인간화된 마우스의 혈액에 있는 인간 적인 면역 세포에 HIV 감염의 효력은 인간 특정 알부민 ELIZA에 의하여 간유 세포측정및 HEPs에 의해 감시됩니다. 5 주까지, HIV-1혈청에 있는 인간 적인 알부민 수준에 있는 감소를 일으키는 원인이 되고 이중 인간화한 마우스의 간 단면도에 있는 인간 CK18 양성 간구의 고갈이 있습니다. CD4에서 CD8에 대한 비율의 낮은 전형적으로 HIV 감염 마우스의 혈액과 간에서 관찰되며, 감염 전에 동일한 마우스에 표시된 수준에 비해.혈액은 버피 코트의 격리를 위해 림프구 분리 매체 위에 신중하게 겹쳐야합니다. 수술의 경우 비장을 부드럽게 잡고 비장의 하부 극에 바늘을 삽입하십시오. 조혈 줄기 세포의 격리에 따라, CD34 양성 조혈 줄기 세포의 순도를 검사하는 것이 중요합니다 CD3 양성 세포와 다른 기증자로부터 간세포의 급성 주사.인간화된 마우스가 인간 면역 계통과 간의 생리적 측면을 보여주기 때문에, 개발된 마우스는 HIV와 물리적 감염 및 간경변증의 생리병발생을 연구하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

연구

면역학 및 감염병학

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

줄기 세포 기반 유전자 치료 종양 모델로 BLT 인간화 마우스를 사용하여

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

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곤충<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

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설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

인간 답게 된 마우스 모델은 미세 혈관을 대상으로 세균 감염을 연구하는

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

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Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

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꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...