Name: establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde conceder R24OD018546 (para L.Y.P. e SG). Os autores gostariam de agradecer a Weizhe li, Ph.D., pela ajuda em procedimentos cirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para imunohistologia, membros da unidade de pesquisa de citometria de fluxo da UNMC diretor Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., e Samantha Wall, B.S., UNMC avançada microscopia membros do núcleo da instalação Janice A. Taylor, B.S., e James R. talaska, B.S., para o apoio técnico. Os autores reconhecem os Drs. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu da CIEA por fornecerem camundongos TK-NOG e o Dr. Joachim Baumgart por fornecerem treosulfan. Os autores agradecem ao Dr. Adrian Koesters, UNMC, por sua contribuição editorial para o manuscrito.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) no centro médico da Universidade de Nebraska.
Nota: Obter a aprovação do IACUC local antes de realizar experimentos em animais.
1. processamento de sangue do cordão umbilical e o isolamento de HSPCs humanos
<ol><li>Realize todas as etapas do protocolo condições estéreis em armários de fluxo laminar.</li>
	<li>Tome o sangue do cordão umbilical (CB) ...

<ol>
	<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+specific+causes+of+death+amongst+HIV-positive+individuals+in+the+D:A:D+Study.">Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study.</a> AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).</li><li>Puoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+for+liver+disease+in+patients+with+HIV+infection:+a+cohort+study.">Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).</li><li>Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+patterns,+and+course+of+past+hepatitis+B+virus+infection+in+intravenous+drug+users+with+HIV-1+infection.">Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection.</a> The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).</li><li>Scharschmidt, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+in+patients+with+HIV+infection:+relationship+to+AIDS+and+patient+survival.">Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival.</a> Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).</li><li>Lacombe, K., Rockstroh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+viral+hepatitis+coinfections:+advances+and+challenges.">HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges.</a> Gut. 61, 47-58 (2012).</li><li>Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. 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A., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+and+experimental+conditions+that+lead+to+effective+repopulation+of+the+liver+by+transplanted+cells.">Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).</li><li>Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+human+hepatocytes+by+human+hematopoietic+stem+cells+in+sheep.">Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep.</a> Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).</li><li>Streetz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+parenchymal+replacement+in+mice+by+transplanted+allogeneic+hepatocytes+is+facilitated+by+bone+marrow+transplantation+and+mediated+by+CD4+cells.">Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells.</a> Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).</li></ol>

O fígado está comprometido e danificado em pacientes infectados pelo HIV24. Modelos experimentais de animais pequenos para o estudo de doenças hepáticas humanas na presença de HIV-1 é extremamente limitado, apesar da disponibilidade de alguns modelos animais cotransplantados com CD34+ hspcs e hepatócitos7,12, a 25. Em experimentos in vitro, os hepatócitos são mostrados para ter infecç...

Desde o advento da terapia antirretroviral, houve uma diminuição substancial nos óbitos relacionados à monoinfecção pelo HIV-1. Noentanto, adoença hepática surgiu como uma causa comum de morbidade em pacientes infectados pelo HIV1,2. Coinfecções de vírus da hepatite com infecção pelo HIV-1 são mais comuns, representando 10%-30% das pessoas infectadas pelo HIV nos Estados Unidos3,4,5.
A especificidade do hospedeiro do HIV-1 e dos vírus da hepatite limita a utilidade de pequenos modelos animais para estudar doenças infecciosas específicas do homem ou para investigar múltiplos aspectos da patogênese hepática associada ao HIV-1. Camundongos imunodeficientes que permitem o Engraftment de células humanas e/ou tecidos (denominados modelos humanizados do camundongo) são modelos animais aceitáveis para estudos pré-clínicos6,7,8. Desde a introdução de camundongos humanizados no início dos anos 2000, vários estudos pré-clínicos de toxicidade hepática humana colestática, patógenos específicos do homem, incluindo HIV-1 e distúrbios neurocognitivos associados ao HIV, vírus Epstein Barr, hepatite e outros doençasinfecciosas, foraminvestigadas nesses camundongos6,9,10,11. Os modelos múltiplos do rato para CD34+ hspcs e/ou a transplantação humana do hepatócito têm sido desenvolvidos por muito tempo e melhoraram sobre o tempo para estudar a patogénese da doença do vírus de hepatite B (HBV)-doença de fígado associada12, 13 anos de , 14. vários modelos para hspc e hepatócitos humanos (HEP) transplante são baseados em cepas, conhecido como Nog (Nod. CG-prkdcscid Il2rgtm1Sug/jictac)8,13, NSG (Nod. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2TM 1.1 FLV Il2rgTM 1.1 FLV/j)12, e Fah-/- Nod rag1-/- il2rγnull mouse16. No entanto, cada modelo tem suas próprias vantagens e limitações; por exemplo, AFC8 camundongos humanizados duplos para HEPs e células-tronco humanas (HSCs) em um Balb/C-Rag2-/- γc-/- background permite o bem sucedido Engraftment de células imunes e hscs, mas há uma ausência de um antígeno-específico T-e B-Cell resposta neste modelo12. As principais preocupações em reconstituir camundongos humanizados duplos incluem o Engraftment suboptimal, a falta de modelos adequados para suportar diferentes tecidos, condições incompatíveis, rejeição imune, ou doença do enxertocontrao hospedeiro (DECH), e técnicas dificuldades, como manipulações de risco com recém-nascidos e altas taxas de mortalidade devido a anormalidades metabólicas13.
Embora os camundongos humanizados tenham sido usados para a pesquisa por HIV há muitos anos17,18,19, o uso de camundongos humanizados para estudar os danos hepáticos causados pelo HIV-1 tem sido limitado20. Nós relatamos previamente o estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG e de sua aplicação na doença de fígado HIV-associada8. Este modelo mostra o Engraftment robusto do fígado e das pilhas imunes e recapitula a patogénese da infecção do HIV. Esta discussão apresenta um protocolo detalhado, incluindo os passos mais críticos no transplante de hepatócitos humanos. Uma descrição dos HSPCs exigidos para um Engraftment bem sucedido dos HEPs e o estabelecimento de um sistema imune funcional em ratos de TK-NOG é apresentada igualmente. O uso destes ratos para estudar o imunopatogênese HIV-associado do fígado é detalhado. Os ratos masculinos de TK-Nog que carreg um tipo fígado-específico do vírus de palavra simples de herpes-1 transgene da quinase do timidina (HSV-tk) são usados. As células hepáticas do rato que expressam este transgene podem ser facilmente abladas após uma breve exposição a uma dose não tóxica de GCV. As pilhas de fígado humanas transplantadas são mantidas estàvel dentro do fígado do rato sem medicina exógena21. Os camundongos também são pré-condicionados com doses nonmyeloablative de treosulfan para criar um nicho na medula óssea do rato para células humanas8. Os camundongos imunodeficientes TK-NOG são injetados intrasplenicamente com HEPs e HSPCs multipotentes. Os ratos são monitorados regularmente para a reconstituição do sangue e do fígado pelo imunofenotipagem do sangue e pelas medidas de níveis da humano-albumina do soro, respectivamente. Camundongos com uma reconstituição bem-sucedida de mais de 15% para ambas as células imunes humanas e HEPs são injetados intraperitonealmente com HIV-1. O efeito do HIV no fígado pode ser avaliado tão cedo quanto 4-5 semanas pós-infecção. É importante notar que, porque o HIV-1 é usado, todas as precauções necessárias devem ser tomadas durante o manuseio do vírus e injetá-lo em camundongos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">27G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:125px;">30G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">5 mL polystyrene&#160; round-bottom tube 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">352054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS array bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">For purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">BD FACS array software</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS lysing solution</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">349202</td>
			<td style="width:167px;">To lyse red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument for acquisiton of flow cytometry samples</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tube</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">BD 367874</td>
			<td style="width:167px;">To collect Cord blood</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A9576</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Controlled substance and pain-killer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD14-PE</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555398</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD19-BV605</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562653</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:125px;">CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-046-702</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; CD34+ HSPC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">CD34-PE, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-081-002</td>
			<td style="width:167px;">Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD3-AF700</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">557943</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD45-PerCPCy5.5</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">564105</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555349</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD8-BV421</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562428</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cell counting slides</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">CS11204</td>
			<td style="width:167px;">for extraction of genomic DNA from ear piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cobas Amplicor system v1.5&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">bioanalyzer to measure viral load</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cotton-tipped applicators&#160;</td>
			<td style="width:135px;">&#160;McKesson</td>
			<td style="width:127px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cytokeratin-18 (CK18)</td>
			<td style="width:135px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">M7010</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D2650-5X5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:125px;">Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">30914</td>
			<td style="width:167px;">Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FACS Diva version 6</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometer software required for&#160; acqusition of sample</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">10438026</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FLOWJO analysis software 
			v10.2</td>
			<td style="width:135px;">FLOWJO, LLC</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:135px;">APP Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">315110</td>
			<td style="width:167px;">Prescripition drug</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td>
			<td style="width:135px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:127px;">450475</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Hepatocytes thawing medium&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">MCHT50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Horizon Open Ligating Clip Appliers</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:127px;">537061</td>
			<td style="width:167px;">To hold the ligating clips</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Hospira Sterile Water for Injection</td>
			<td style="width:135px;">ACE surgical supply co. Inc.</td>
			<td style="width:127px;">001-1187</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of Buprenorphine (pain-killer)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td style="width:135px;">Bethyl laboratories</td>
			<td style="width:127px;">E80-129</td>
			<td style="width:167px;">For assesing human albumin levels in mouse serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human hepatocyte</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">HUCP1</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Iris Scissors, Straight</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">13295</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Lancet</td>
			<td style="width:135px;">MEDIpoint</td>
			<td style="width:127px;">Goldenrod 5 mm</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-401</td>
			<td style="width:167px;">Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:135px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:127px;">50494</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; lymphocytes from peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-303</td>
			<td style="width:167px;">holds Qudro MACS seperator and LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5605</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5157&#160;</td>
			<td style="width:167px;">to hold and pull out spleen from peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">mouse CD45-FITC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">553080</td>
			<td style="width:167px;">mouse-specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td style="width:135px;">Hyclone</td>
			<td style="width:127px;">SH30256.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Qudro MACS separator&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-090-976</td>
			<td style="width:167px;">holds four LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">11875093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">StepOne Plus Real Time PCR&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument used&#160; to&#160; genotype</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml</td>
			<td style="width:135px;">DYMAX CORP</td>
			<td style="width:127px;">T15469</td>
			<td style="width:167px;">Used to&#160; dispense&#160; HSPC and HEP supension in controlled manner</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Suturevet PGA synthetic absorbale suture</td>
			<td style="width:135px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:127px;">41178</td>
			<td style="width:167px;">Suturing of skin and peritoneum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">4369016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:125px;">TK-NOG mice&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Treosulfan</td>
			<td style="width:135px;">Medac GmbH</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by &#160;Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450022</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">1346</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Weck hemoclip traditional titanium ligating clips</td>
			<td style="width:135px;">Esutures</td>
			<td style="width:127px;">523700</td>
			<td style="width:167px;">To ligate the spleen post-injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis

Apesar da expectativa de vida aumentada dos pacientes contaminados com o vírus de imunodeficiência humana-1 (HIV-1), a doença de fígado emergiu como uma causa comum de sua morbosidade. A Imunopatologia hepática causada pelo HIV-1 permanece elusiva. Os modelos animais pequenos do xenograft com hepatócitos humanos e o sistema imunitário humano podem recapitular a biologia humana da patogénese da doença. Nisto, um protocolo é descrito para estabelecer um modelo humanizado duplo do rato com os hepatócitos humanos e o transplante de CD34+ hematopoietic/pilhas do progenitor (hspcs), para estudar a Imunopatologia do fígado como observado em pacientes HIV-contaminados. Para conseguir a reconstituição dupla, o macho TK-NOG (NOD. CG-Prkdcscid Il2rgtm1Sug TG (ALB-tk) 7-2/shijic) os camundongos são injetados intraperitonealmente com doses de ganciclovir (GCV) para eliminar as células hepáticas transgênicas do camundongo, e com treosulfano para condicionamento não mieloablativo, ambos facilitar o desenvolvimento de hepatócitos humanos (HEP) e do sistema imunológico humano (HIS). Os níveis da albumina humana (ALB) são avaliados para o Engraftment do fígado, e a presença de pilhas imunes humanas no sangue detectado pela citometria do fluxo confirma o estabelecimento do sistema imunitário humano. O modelo desenvolvido utilizando o protocolo aqui descrito assemelha-se a múltiplos componentes de lesão hepática por infecção pelo HIV-1. Seu estabelecimento poderia revelar-se essencial para estudos da co-infecção do vírus de hepatite e para a avaliação de antivirais e de drogas antiretroviral.

O estabelecimento de um modelo humanizado duplo do rato com fígado humano e pilhas imunes pode facilmente ser monitorado em cada etapa com ELISA muito simples e cytometry do fluxo, respectivamente. A citometria de fluxo é realizada regularmente para avaliar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional e para ver o efeito da infecção pelo HIV nas células imunes. Em camundongos humanizados duplos, o desenvolvimento de células imunes funcionais pode variar de 15% a 90% da por...

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Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

O objetivo geral do protocolo é gerar um modelo de camundongo humanizado com sistema imunológico humano funcional e fígado usando células-tronco hematopoiéticas humanas e sítio hepato. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave em camundongos humanizados do fígado genético. Este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar a imunopatologia causada pelo HIV, como observado nas pessoas.A demonstração do processo será de Yimin Sun, supervisor do departamento de patologia e microbiologia, juntamente com Weimin Wang e Edwrd Makarov, tecnólogo de pesquisa. Para começar, transfira o sangue do cordão umbilical coletado em tubos heparinizados para um armário de fluxo laminar estéril. Adicione PBS até que o volume seja aumentado para 35 mililitros.Coloque a amostra em cima do meio de separação do linfócito e centrífuga 400 vezes G e a quatro graus celsius por 35 minutos sem quebras. Em seguida, remova cuidadosamente a camada de plasma superior e use uma pipeta de transferência para transferir a interface do casaco branco para um novo tubo. Suspenda o casaco de polimento em 30 a 40 mililitros de tampão gelado.Usando uma pipeta, combine 20 microliters da suspensão celular com 20 microliters de 0,4% de tripano azul. Pipeta 10 microliters desta mistura na abertura externa de qualquer uma das duas câmaras de um slide de contagem, e inserir o slide em um contador automatizado de células para contar as células. Centrifugar as células a 300 vezes G e a 4 graus celsius por 10 minutos.Aspire cuidadosamente o supernascer e adicione 300 microliters de tampão frio de gelo. Adicione 100 microliters de reagente de bloqueio de receptor FC humano e 100 microliters de anticorpos anti-humanos cd34 conjugados de camundongos monoclonais microesferas para até 100 milhões de células. Incubar por 30 minutos a quatro graus celsius.Adicione 10 mililitros de tampão gelado para lavar as células e centrífugas 300 vezes G e quatro graus celsius por 10 minutos. Remova cuidadosamente o supernascer e suspenda a pelota em 500 microliters de tampão gelado. Depois disso, coloque uma coluna LS de seleção positiva no campo de triagem celular ativada magnética e passe-a com três mililitros de tampão gelado.Carregue a amostra na coluna LS que pode prender microesferas ligadas a células positivas CD34 humanas em amostras, e permitir que ela flua sob a influência da gravidade para o tubo de coleta. Lave a coluna três vezes com tampão gelado e colete o eluent no mesmo tubo de coleta. Em seguida, mergulhe a coluna com cinco mililitros de tampão gelado para aludir as células positivas cd34 em um novo tubo de coleta.Repita o procedimento para alcançar uma pureza de mais de 90%, use corante azul trypan e um hemócitometro para contar as células positivas CD34 iludidas. Após a contagem, centrifugar as células a 300 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernascer e suspenda as células em 125 microliters de PBS para uma injeção a ser usada imediatamente no transplante.Para verificar a pureza do eluente positivo CD34, pegue 50 microliters da suspensão e incuba-o com 10 microliters de anticorpo CD34 conjugado de PE a quatro graus celsius por 30 minutos. Depois disso, lave e suspenda as células em PBS e prossiga para realizar a citometria de fluxo. Após a aquisição, analise os dados conforme descrito no protocolo de texto.Primeiro, recuperar e descongelar os hepatócitos criopreservados, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, remova a tampa biológica e despeje os hepatócitos descongelados em um tubo cônico de 50 mililitros contendo meio de descongelamento aquecido. Balance o tubo à mão por alguns segundos para suspender as células.Pelota as células a 100 vezes G e à temperatura ambiente por oito minutos. Lave as células pelleted em PBS com 0,1%BSA e lavonha-as com HSPCs frescos ou descongelados em PBS a um volume final de 80 microliters por mouse. Primeiro, conecte uma extremidade de um tubo de extensão estéril a uma agulha calibre 30 e a outra extremidade a uma seringa de um mililitro.Encha a seringa com a suspensão de HEPs agrupados e HSPCs. Coloque a seringa no entalhe de uma pipeta de distribuição repetitiva e ajuste o dispensador para dispensar 10 microliters em cada prensa. Raspe cada rato como descrito no protocolo de texto e esfregue o lado esquerdo do corpo de cada rato com iodo de 10% povidone seguido de álcool isopropílico de 70%.Utilizando tesouras do tipo Vannas, faça uma pequena incisão na pele, músculo e peritônio à esquerda da parede peritônio para entrar na cavidade peritoneal aproximadamente 5 milímetros abaixo da borda inferior da caixa torácica. Localize o baço e use fórceps para puxá-lo ligeiramente para a área de operação para fácil acesso e inserir a agulha de calibre 30 no polo inferior do baço. Em seguida, desbloqueie o êmbolo da pipeta de distribuição e dispense 10 microliters do volume por vez, com um limite de 60 a 80 microliters por baço.Retraia a agulha lentamente e corte o baço com clipes ligantes usando um aplicador de ligadura. Em seguida, use aplicadores de ponta de algodão molhados com PBS estéril para empurrar o baço de volta para a cavidade corporal. Use um padrão de sutura interrompido para fechar a camada muscular da parede abdominal.Realize o fechamento da pele com um padrão de sutura interrompido usando suturas não absorvíveis. Transfira todos os materiais necessários para uma instalação designada para o Nível Dois Plus. Use equipamentos de proteção pessoal, incluindo uma capa descartável de todos os vestidos, capas de sapato, uma máscara facial e luvas duplas, incluindo luvas resistentes a cortes, em todos os momentos enquanto trabalha com o vírus.Selecione camundongos com uma reconstituição de mais de 15% das células positivas de CD45 humanos e com presença de albumina humana no soro para infecção pelo HIV-1. Injete intraperitoneally os camundongos com doses infecciosas de 1.000 a 10.000 de cultura tecidual de 50 HIV-1 ADA em um volume de 100 a 200 microliters por rato. Depois de eutanásia dos camundongos, extiria o fígado de cada rato como descrito no protocolo de texto.Coletar e fixar os fígados em 4% de paraformaldeído durante a noite. O estabelecimento de um modelo de camundongo humanizado duplo com fígado humano e células imunes pode ser facilmente monitorado a cada passo com ELIZA muito simples e citometria de fluxo, respectivamente. A citometria de fluxo é realizada regularmente para avaliar o desenvolvimento de um sistema imunológico funcional e para ver o efeito da infecção pelo HIV nas células imunes.Em camundongos humanizados duplos, o desenvolvimento de células imunes funcionais pode variar de 15 a 90% do portão linfócito. Para a avaliação do engrafamento dos hepatócitos humanos, eliza para níveis de albumina específicos humanos é realizada mensalmente no soro do rato. Camundongos engrafados com HSPCs e HEPs mostram níveis de albumina específicos do homem que variam de aproximadamente sete microgramas por mililitro a 377 microgramas por mililitro em um mês, continuando a crescer ao longo do tempo de observação.O efeito da infecção pelo HIV em células imunes humanas no sangue de camundongos humanizados duplos é monitorado pela citometria de fluxo e nos HEPs no fígado pela albumina específica humana ELIZA. Em cinco semanas, o HIV-1 causa uma diminuição nos níveis de albumina humana no soro e há um esgotamento dos hepatócitos positivos ck18 humanos nas seções hepáticas de camundongos humanizados duplos. Uma menor proporção de CD4 para CD8 é tipicamente observada no sangue e fígado de camundongos infectados pelo HIV, em comparação com os níveis observados no mesmo camundongo antes da infecção.O sangue deve ser colocado cuidadosamente em cima do meio de separação do linfócito para isolamentos de casaco buffy. Para a cirurgia, segure o baço suavemente e insira a agulha no polo inferior do baço. Após o isolamento de células-tronco hematopoiéticas, é crucial verificar a pureza das células-tronco hematopoiéticas positivas cd34 para evitar células positivas CD3 e injeções agudas de hepatócito de diferentes doadores.Como os camundongos humanizados mostram aspecto fisiológico do sistema imunológico humano e do fígado, os camundongos desenvolvidos poderiam ser utilizados para estudar a fisiopatênese do HIV e infecções físicas e cirrose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

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In vitro a formação de biofilme em um slide Câmara de 8 poços

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Imunologia e Infecção

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Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

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Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Um modelo de cultura primária de células bolsas serosas Ex Vivo frango para estudar a patogênese de doenças infecciosas bolsas serosas vírus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Avaliando virulência e patogênese da infecção por Aeromonas em um modelo de Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...