Name: establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü hibe R24OD018546 (L.Y.P. ve S.G.) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Weizhe Li, Ph.D., cerrahi işlemlerde yardım için teşekkür etmek istiyorum, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng immünohistoloji için, UNMC akış sitometri araştırma tesisi üyeleri Direktörü Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., ve Samantha Wall, B.S., UNMC gelişmiş mikroskopi çekirdek tesis üyeleri Janice A. Taylor, B.S., ve James R. Talaska, B.S., teknik destek için. Yazarlar Dr Mamoru Ito ve Hiroshi Suemizu CIEA tk-NOG fareler ve Dr Joachim Baumgart treosulfan sağlamak için sağlamak için kabul. Yazarlar Dr Adrian Koesters, UNMC, onun editoryal katkılarından dolayı el yazması teşekkür ederiz.

Bu protokol, Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Hayvanlar üzerinde deneyler yapmadan önce yerel IACUC'den onay alın.
1. Göbek Kordon Kanının İşlenmesi ve İnsan HSP'lerinin İzolasyon
<ol><li>Laminar akış dolaplarında steril koşullar altında protokolün tüm adımlarını gerçekleştirin.</li>
	<li>Heparinize tüplerde toplanan göbek kordo...

<ol>
	<li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+associated+with+specific+causes+of+death+amongst+HIV-positive+individuals+in+the+D:A:D+Study.">Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study.</a> AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).</li><li>Puoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortality+for+liver+disease+in+patients+with+HIV+infection:+a+cohort+study.">Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).</li><li>Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence,+patterns,+and+course+of+past+hepatitis+B+virus+infection+in+intravenous+drug+users+with+HIV-1+infection.">Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection.</a> The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).</li><li>Scharschmidt, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+B+in+patients+with+HIV+infection:+relationship+to+AIDS+and+patient+survival.">Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival.</a> Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).</li><li>Lacombe, K., Rockstroh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+and+viral+hepatitis+coinfections:+advances+and+challenges.">HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges.</a> Gut. 61, 47-58 (2012).</li><li>Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+for+the+study+of+infectious+diseases.">Humanized mice for the study of infectious diseases.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).</li><li>Billerbeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+efficiently+engrafted+with+fetal+hepatoblasts+and+syngeneic+immune+cells+develop+human+monocytes+and+NK+cells.">Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells.</a> The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).</li><li>Dagur, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocyte+depletion+in+the+presence+of+HIV-1+infection+in+dual+reconstituted+humanized+mice.">Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice.</a> Biology Open. 7 (2), (2018).</li><li>Gaska, J. M., Ploss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+viral+pathogenesis+in+humanized+mice.">Study of viral pathogenesis in humanized mice.</a> Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).</li><li>Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+models+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders.">Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).</li><li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+TK-NOG+mice:+a+predictive+model+for+cholestatic+human+liver+toxicity.">Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).</li><li>Washburn, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+to+study+hepatitis+C+virus+infection,+immune+response,+and+liver+disease.">A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease.</a> Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).</li><li>Gutti, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+and+hematolymphoid+dual+reconstitution+in+treosulfan-conditioned+uPA-NOG+mice.">Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice.</a> The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).</li><li>Strick-Marchand, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+model+for+stable+engraftment+of+a+human+immune+system+and+human+hepatocytes.">A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes.</a> PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).</li><li>Keng, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+liver+pathogenesis,+human+immune+responses+and+drug+testing+in+a+humanised+mouse+model+of+HCV+infection.">Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection.</a> Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).</li><li>Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+HBV+Infection+and+Therapy+in+Immune-Deficient+NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null+(NRG)+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+(Fah)+Knockout+Mice+Transplanted+with+Human+Hepatocytes.">Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).</li><li>Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Humanized Mice for HIV Research. , (2014).</li><li>Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+Engrafted+With+Human+HSC+Only+or+HSC+and+Thymus+Support+Comparable+HIV-1+Replication,+Immunopathology,+and+Responses+to+ART+and+Immune+Therapy.">Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).</li><li>Zhang, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+immunopathogenesis+in+humanized+mouse+models.">HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models.</a> Cellular &amp; Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).</li><li>Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+prevent+liver+fibrosis+during+HIV+type+1+infection+in+a+humanized+mouse+model.">Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model.</a> The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).</li><li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstituted+'humanized+liver'+in+TK-NOG+mice+is+mature+and+functional.">The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).</li><li>Higuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+hepatic+cell+line+HepaRG+as+a+possible+cell+source+for+the+generation+of+humanized+liver+TK-NOG+mice.">The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice.</a> Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).</li><li>Kosaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+TK-NOG+based+humanized+mouse+model+for+the+study+of+HBV+and+HCV+infections.">A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).</li><li>Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+infection+and+the+liver.">Human immunodeficiency virus infection and the liver.</a> World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).</li><li>Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+immune-pathogenesis+and+therapy+of+human+liver+tropic+virus+infection+in+humanized+mouse+models.">Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-level+HIV+infection+of+hepatocytes.">Low-level HIV infection of hepatocytes.</a> Virology Journal. 9, 1-7 (2012).</li><li>Dash, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-acting+nanoformulated+antiretroviral+therapy+elicits+potent+antiretroviral+and+neuroprotective+responses+in+HIV-1-infected+humanized+mice.">Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice.</a> AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).</li><li>Sun, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+chimeric+mouse+models+of+hepatitis+B+virus+infection.">Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection.</a> International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).</li><li>Shafritz, D. A., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+and+experimental+conditions+that+lead+to+effective+repopulation+of+the+liver+by+transplanted+cells.">Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).</li><li>Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+human+hepatocytes+by+human+hematopoietic+stem+cells+in+sheep.">Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep.</a> Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).</li><li>Streetz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+parenchymal+replacement+in+mice+by+transplanted+allogeneic+hepatocytes+is+facilitated+by+bone+marrow+transplantation+and+mediated+by+CD4+cells.">Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells.</a> Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).</li></ol>

Karaciğer, HIV'li hastalarda24. HIV-1 varlığında insan karaciğer hastalıkları nın incelenmesi için deneysel küçük hayvan modelleri son derece sınırlıdır, CD34 ile birkaç cotransplanted hayvan modelleri durumuna rağmen+ HSPCs ve hepatosit7 ,12, 25. yıl. In vitro deneylerde hepatositlerin düşük seviyeli HIV-1 enfeksiyonu olduğu gösterilmiştir26. ?...

Antiretroviral tedavinin gelişinden bu yana, HIV-1 monoenfeksiyona bağlı ölümlerde önemli bir azalma olmuştur. Ancak, karaciğer hastalığı HIV-enfekte hastalarda morbidite ortak bir nedeni olarak ortaya çıkmıştır1,2. HIV-1 enfeksiyonu ile hepatit virüslerinin coenfeksiyonlar daha yaygındır, 10% için muhasebe - 30% ABD'de HIV enfektekişilerin% 30,4,5.
HIV-1 ve hepatit virüslerinin ev sahibi özgüllüğü, küçük hayvan modellerinin insana özgü bulaşıcı hastalıkları incelemek veya HIV-1 ile ilişkili karaciğer patogenesinin çeşitli yönlerini araştırmak için yararsağlar. İnsan hücrelerinin ve/veya dokuların engraftment izin immunodeficient fareler (insanlı fare modelleri olarak da adlandırılır) preklinikçalışmalariçin kabul edilebilir hayvan modelleri 6,7,8. 2000'li yılların başında insanlaşmış farelerin piyasaya sürülmesinden bu yana, kolestatik insan karaciğer toksisitesi, HIV-1 ve HIV ile ilişkili nörobilişsel bozukluklar, Epstein Barr virüsü, hepatit ve diğer dahil olmak üzere insana özgü patojenler, birden fazla preklinik çalışmalar bulaşıcı hastalıklar, bu farelerde araştırılmıştır6,9,10,11. CD34+ HSPCs ve / veya insan hepatosit transplantasyonu için birden fazla fare modelleri uzun geliştirilmiş ve Hepatit B virüsü (HBV) ilişkili karaciğer hastalığı hastalığı patogenezini incelemek için zaman içinde geliştirilmiş12, 13.000 , 14. HSPC ve insan hepatosit (HEP) transplantasyonu için çeşitli modeller NOG (NOD) olarak bilinen suşlara dayanmaktadır. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12ve fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull fare16. Ancak, her modelin kendi avantajları ve sınırlamaları vardır; örneğin, Bir Balb/C-Rag2üzerinde HEP'ler ve insan kök hücreleri (HSC'ler) için AFC8 çift insanlaştırılmış fareler , bağışıklık hücreleri ve HSC'lerin başarılı bir şekilde engraftment sağlar, ancak bir antijene özgü T- ve B-hücre yokluğu var bu modelde yanıt12. Çift insanlı farelerin yeniden konumlanmasındaki en önemli endişeler arasında suboptimal engraftment, farklı dokuları destekleyecek uygun modellerin olmaması,uyumsuz koşullar, immün ret veya greft-versus-host hastalığı (GVHD) ve teknik metabolik anormalliklere bağlı olarak yenidoğanlarda riskli manipülasyonlar ve yüksek mortalite oranları gibi güçlükler13.
İnsanlaştırılmış fareler uzun yıllar HIV araştırma için kullanılan olmasına rağmen17,18,19, HIV-1 neden olduğu karaciğer hasarı incelemek için insanlaşmış farelerin kullanımı20sınırlı olmuştur . Biz daha önce bir çift insanlaştırılmış TK-NOG fare modeli ve HIV ilişkili karaciğer hastalığı8onun uygulama kurulması bildirdi. Bu model karaciğer ve bağışıklık hücrelerinin sağlam engraftment gösterir ve HIV enfeksiyonu patogenezini recapitulates. Bu tartışma, insan hepatositlerinin naklinde en kritik adımları içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. HEP'lerin başarılı bir şekilde engreftlemesi ve TK-NOG farelerde fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin kurulması için gerekli olan HSP'lerin tanımı da sunulmuştur. Bu farelerin HIV ile ilişkili karaciğer immünopatogenezi üzerinde çalışması için kullanımı ayrıntılıdır. Karaciğere özgü herpes simpleks virüsü tip 1 timidin kigaz (HSV-TK) transgeni taşıyan TK-NOG erkek fareler kullanılır. Bu transgeni ifade eden fare karaciğer hücreleri, toksik olmayan bir GCV dozuna kısa bir maruzktan sonra kolayca ablated olabilir. Nakledilen insan karaciğer hücreleri eksojen ilaçlar olmadan fare karaciğeri içinde stably korunur21. Fareler de insan hücreleri için fare kemik iliği bir niş oluşturmak için treosulfan nonmyeloablative dozlarda ön koşulluvardır 8. İmmün eksikliği olan TK-NOG farelere intrasplenik olarak HEP ve çok güçlü HSP'ler enjekte edilir. Fareler daha sonra düzenli olarak kan immünofenotiyonu ve serum insan-albumin düzeyleriölçümleri ile kan ve karaciğer reconstitution için izlenir, sırasıyla. Hem insan bağışıklık hücreleri hem de HEP'ler için %15'ten fazla başarılı bir reconstitution ile fareler intraperitoneally HIV-1 enjekte edilir. HIV'in karaciğer üzerindeki etkisi enfeksiyon sonrası 4- 5 hafta kadar erken değerlendirilebilir. HIV-1 kullanıldığından, virüsün kullanımı ve farelere enjekte edilmesi sırasında gerekli tüm önlemlerin alınması gerektiği ne kadar önemlidir?

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:553px;" width="552">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">27G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305109</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:125px;">30G1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">305106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">5 mL polystyrene&#160; round-bottom tube 12 x 75 mm style</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">352054</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">309659</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS array bioanalyzer&#160;</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">For purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">BD FACS array software</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">BD FACS lysing solution</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">349202</td>
			<td style="width:167px;">To lyse red blood cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD LSR II</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument for acquisiton of flow cytometry samples</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">BD&#160;Vacutainer Plastic Blood Collection Tube</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">BD 367874</td>
			<td style="width:167px;">To collect Cord blood</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A9576</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Controlled substance and pain-killer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD14-PE</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555398</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD19-BV605</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562653</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:125px;">CD34 MicroBead Kit, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-046-702</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; CD34+ HSPC</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">CD34-PE, human</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-081-002</td>
			<td style="width:167px;">Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD3-AF700</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">557943</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD45-PerCPCy5.5</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">564105</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD4-APC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">555349</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">CD8-BV421</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">562428</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cell counting slides</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">CS11204</td>
			<td style="width:167px;">for extraction of genomic DNA from ear piece</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cobas Amplicor system v1.5&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Roche Molecular Diagnostics</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">bioanalyzer to measure viral load</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cotton-tipped applicators&#160;</td>
			<td style="width:135px;">&#160;McKesson</td>
			<td style="width:127px;">24-106-2S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Cytokeratin-18 (CK18)</td>
			<td style="width:135px;">DAKO</td>
			<td style="width:127px;">M7010</td>
			<td style="width:167px;">Specific to human</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:127px;">D2650-5X5ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:125px;">Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile</td>
			<td style="width:135px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:127px;">30914</td>
			<td style="width:167px;">Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FACS Diva version 6</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometer software required for&#160; acqusition of sample</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">10438026</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">FLOWJO analysis software 
			v10.2</td>
			<td style="width:135px;">FLOWJO, LLC</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">flow cytometry analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:135px;">APP Pharmaceuticals, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">315110</td>
			<td style="width:167px;">Prescripition drug</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Greiner MiniCollect EDTA Tubes</td>
			<td style="width:135px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:127px;">450475</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Hepatocytes thawing medium&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">MCHT50</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Horizon Open Ligating Clip Appliers</td>
			<td style="width:135px;">Teleflex</td>
			<td style="width:127px;">537061</td>
			<td style="width:167px;">To hold the ligating clips</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Hospira Sterile Water for Injection</td>
			<td style="width:135px;">ACE surgical supply co. Inc.</td>
			<td style="width:127px;">001-1187</td>
			<td style="width:167px;">For dilution of Buprenorphine (pain-killer)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human Albumin ELISA Quantitation Set</td>
			<td style="width:135px;">Bethyl laboratories</td>
			<td style="width:127px;">E80-129</td>
			<td style="width:167px;">For assesing human albumin levels in mouse serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Human hepatocyte</td>
			<td style="width:135px;">Triangle Research Labs&#160;</td>
			<td style="width:127px;">HUCP1</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Iris Scissors, Straight</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">13295</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Lancet</td>
			<td style="width:135px;">MEDIpoint</td>
			<td style="width:127px;">Goldenrod 5 mm</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:125px;">LS columns&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-401</td>
			<td style="width:167px;">Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:135px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:127px;">50494</td>
			<td style="width:167px;">For isoation of&#160;&#160; lymphocytes from peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">MACS MultiStand</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-042-303</td>
			<td style="width:167px;">holds Qudro MACS seperator and LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5605</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Micro Dissecting Forceps</td>
			<td style="width:135px;">Roboz Surgical Instrument Co.</td>
			<td style="width:127px;">RS-5157&#160;</td>
			<td style="width:167px;">to hold and pull out spleen from peritoneal cavity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">mouse CD45-FITC</td>
			<td style="width:135px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:127px;">553080</td>
			<td style="width:167px;">mouse-specific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">PBS (Phosphate Buffered Saline)</td>
			<td style="width:135px;">Hyclone</td>
			<td style="width:127px;">SH30256.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">Qudro MACS separator&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:127px;">130-090-976</td>
			<td style="width:167px;">holds four LS columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:127px;">11875093</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">StepOne Plus Real Time PCR&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Instrument used&#160; to&#160; genotype</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml</td>
			<td style="width:135px;">DYMAX CORP</td>
			<td style="width:127px;">T15469</td>
			<td style="width:167px;">Used to&#160; dispense&#160; HSPC and HEP supension in controlled manner</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Suturevet PGA synthetic absorbale suture</td>
			<td style="width:135px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:127px;">41178</td>
			<td style="width:167px;">Suturing of skin and peritoneum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">TaqMan Gene Expression Master Mix</td>
			<td style="width:135px;">Thermofisher scientific</td>
			<td style="width:127px;">4369016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:125px;">TC20 automated cell counter</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:125px;">TK-NOG mice&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Treosulfan</td>
			<td style="width:135px;">Medac GmbH</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:167px;">Provided by &#160;Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:125px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:135px;">Bio-rad</td>
			<td style="width:127px;">1450022</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:125px;">Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L</td>
			<td style="width:135px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">1346</td>
			<td style="width:167px;">Used to make an incision on skin to expose spleen</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:125px;">Weck hemoclip traditional titanium ligating clips</td>
			<td style="width:135px;">Esutures</td>
			<td style="width:127px;">523700</td>
			<td style="width:167px;">To ligate the spleen post-injection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of the dual humanized tk-nog mouse model for hiv-associated liver pathogenesis

İnsan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1) ile enfekte hastaların artan yaşam beklentisi rağmen, karaciğer hastalığı morbidite ortak bir nedeni olarak ortaya çıkmıştır. HIV-1'in neden olduğu karaciğer immünpatolojisi hala zor. İnsan hepatositleri ve insan bağışıklık sistemi ile küçük ksenogreft hayvan modelleri hastalığın patogenezinin insan biyolojisini özetleyebilir. Burada, insan heatositleri ve CD34+ hematopoetik kök/progenitor hücreleri (HSPCs) transplantasyonu ile hiv hastalarında gözlenen karaciğer immünopatolojisini incelemek için çift insanlaştırılmış fare modeli oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Çift reconstitution elde etmek için, erkek TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) fareler intraperitoneally gansiclovir enjekte edilir (GCV) dozları fare transgenik karaciğer hücrelerini ortadan kaldırmak için, ve nonmiyeoablative klima için treosulfan ile, her ikisi de insan hepatosit (HEP) engraftment ve insan bağışıklık sistemi (HIS) gelişimini kolaylaştırmak. İnsan albumini (ALB) düzeyleri karaciğer engraftment için değerlendirilir, ve kanda insan bağışıklık hücrelerinin varlığı kanda akış sitometri tarafından tespit insan bağışıklık sisteminin kurulmasını doğrular. Burada açıklanan protokol kullanılarak geliştirilen model, HIV-1 enfeksiyonundan kaynaklanan karaciğer hasarının birden fazla bileşenini andırmaktadır. Kurulması hepatit virüsü ortak enfeksiyon çalışmaları ve antiviral ve antiretroviral ilaçların değerlendirilmesi için gerekli olduğunu kanıtlayabilir.

İnsan karaciğeri ve bağışıklık hücreleri ile çift insanlı fare modelinin kurulması, sırasıyla çok basit ELISA ve akış sitometrisi ile her adımda kolayca izlenebilir. Akış sitometrisi fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin gelişimini değerlendirmek ve HIV enfeksiyonunun bağışıklık hücreleri üzerindeki etkisini görmek için düzenli olarak yapılır. Çift insanlaşmış farelerde, fonksiyonel bağışıklık hücrelerinin gelişimi lenfosit kapısının% 15...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis at JoVE.com

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

Bu protokol, hem insan bağışıklık sistemi hem de karaciğer hücreleri ile insanlaşmış fareler kurmak için güvenilir bir yöntem sağlar. İnsan hepatositlerinin intrasplenik enjeksiyonu ve CD34+ hematopoetik kök hücrelerin insplektik enjeksiyonu ile elde edilen çift immünoeksik fareler insan immün yetmezlik virüsü-1 enfeksiyonuna yatkındır ve gözlendiği gibi karaciğer hasarına recapitulate HIV bulaşmış hastalar.

HIV ile ilişkili Karaciğer Patogenezi için Çift İnsanize TK-NOG Fare Modelinin Oluşturulması

Despite the increased life expectancy of patients infected with human immunodeficiency virus-1 (HIV-1), liver disease has emerged as a common cause of ...

Protokolün genel amacı, insan hematopoetik kök hücreleri ve hepato sitesi kullanarak fonksiyonel insan bağışıklık sistemi ve karaciğer ile insanlaşmış bir fare modeli oluşturmaktır. Bu yöntem genetik karaciğer insanlaşmış farelerde anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu yöntem, insanlarda gözlenen HIV'in neden olduğu immünpatolojiyi incelemek için güçlü bir araç sağlar.Sürecin yanı sıra patoloji ve mikrobiyoloji bölümünden bir danışman olan Yimin Sun ve araştırma teknoloğu Edwrd Makarov tarafından gösterilecek. Başlamak için, heparinized tüpler toplanan göbek kordon kanı steril laminar akış kabine aktarın. Hacmi 35 mililitreye yükseltilene kadar PBS ekleyin.Katman lenfosit ayırma orta üstüne örnek ve santrifüj 400 kez G ve hiçbir mola ile 35 dakika boyunca dört derece santigrat. Daha sonra, üst plazma tabakasını dikkatlice çıkarın ve beyaz buffy coat arayüzünü yeni bir tüpe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. 30 ila 40 mililitre buz gibi soğuk tampon da buffy ceket yeniden askıya.Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini %0,4 trypan mavisi 20 mikrolitre ile birleştirin. Pipet 10 mikrolitre bu karışımın bir sayma slayt iki odacık larından birinin dış açılması içine, ve hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı içine slayt ekleyin. Hücreleri 300 kez G'de ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.Dikkatle supernatant aspire ve buz soğuk tampon 300 mikrolitre ekleyin. 100 milyon hücreye kadar konjuge mikroboncuklar için 100 mikrolitre insan FC reseptör bloke reaktif ve monoklonal fare anti-insan CD34 antikor 100 milyon hücre için mikroboncuklar konjuge 100 mikrolitre ekleyin. 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat.Hücreleri yıkamak için 10 mililitre buz gibi tampon ekleyin ve 10 dakika boyunca 300 kez G ve dört santigrat derece santrifüj. Dikkatle supernatant çıkarın ve buz gibi soğuk tampon 500 mikrolitre pelet yeniden askıya. Bundan sonra, manyetik aktif hücre sıralama alanına pozitif bir seçim LS sütun yerleştirin ve buz soğuk tampon üç mililitre ile geçmek.Numuneyi, numunelerde insan CD34 pozitif hücrelerine bağlı MikroBoncukları tuzağa düşürebilen ve yerçekiminin etkisi altında toplama tüpüne akmasını sağlayan LS sütununa yükleyin. Sütunu buz gibi tamponla üç kez yıkayın ve elüent'i aynı toplama tüpünde toplayın. Daha sonra, cd34 pozitif hücreleri yeni bir toplama tüpüne dönüştürmek için beş mililitre buz gibi soğuk tampon içeren sütunu daldırın.%90'ın üzerinde bir saflık elde etmek için prosedürü tekrarlayın Sonraki, elde edilen CD34 pozitif hücreleri saymak için trypan mavi boya ve hemositometre kullanın. Saydıktan sonra hücreleri 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin. Transplantasyonda hemen kullanılacak bir enjeksiyon için 125 mikrolitre PBS'deki hücreleri atın ve yeniden askıya alın.CD34 pozitif eluent saflığını kontrol etmek için, süspansiyon 50 mikrolitre almak ve 30 dakika boyunca dört derece santigrat de PE konjuge anti-insan CD34 antikor 10 mikrolitre ile kuluçka. Bundan sonra, yıkama ve PBS hücreleri yeniden askıya ve akış sitometri gerçekleştirmek için devam edin. Edinmeden sonra, metin protokolünde özetlenen verileri analiz edin.İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi cryopreserved hepatositleri alın ve eritin. Sonra, biyo kap çıkarın ve ısıtılmış eritme orta içeren 50 mililitrelik konik tüp içine çözülmüş hepatositler dökün. Hücreleri askıya almak için tüpü birkaç saniye elle sallayın.100 kez G ve sekiz dakika oda sıcaklığında hücreleri pelet. PBS'deki peletli hücreleri %0,1 BSA ile yıkayın ve pbs'de taze veya çözülmüş HSPC'lerle fare başına 80 mikrolitrelik son bir hacimle birleştirin. İlk olarak, steril uzatma tüpünün bir ucunu 30 gauge iğneye, diğer ucunu da bir mililitreşşile şırıngaya takın.Şırıngayı havuzlu HEP'lerin ve HSP'lerin süspansiyonuyla doldurun. Şırıngayı tekrarlayan dağıtım pipetinin çentikine tonuyla töben edin ve dağıtıcıyı her prese 10 mikrolitre dağıtacak şekilde ayarlayın. Metin protokolünde belirtildiği gibi her faretıraş ve% 10 povison iyot ile her farenin vücudunun sol tarafında ovmak% 70 izopropil alkol izledi.Vannas tipi makas kullanarak, göğüs kafesinin alt kenarının yaklaşık 5 milimetre altında periton boşluğuna girmek için periton duvarının solunda deri, kas ve periton küçük bir kesi yapmak. Dalağını bulun ve kolay erişim için çalışma alanına hafifçe çekmek için forseps kullanın ve 30 gauge iğneyi dalak alt kutbuna takın. Daha sonra, dağıtım pipetinin pistonunun kilidini açın ve dalak başına 60 ila 80 mikrolitre lik bir sınırla bir seferde hacmin 10 mikrolitresini dağıtın.İğneyi yavaşça geri çekin ve bir ligasyon aplier kullanarak dalağını bağlama klipleri ile kırpın. Daha sonra, dalak geri vücut boşluğuna itmek için steril PBS ile ıslak pamuk uçlu aplikatörler kullanın. Karın duvarının kas tabakasını kapatmak için kesilmiş bir dikiş deseni kullanın.Emilemeyen dikişler kullanarak kesilen dikiş deseni ile cilt kapanmasını gerçekleştirin. Gerekli tüm malzemeleri belirlenmiş bir Biyogüvenlik Seviye İki Plus tesisine aktarın. Virüsle çalışırken her zaman tek kullanımlık bir kapak, tüm gece elbisesi, ayakkabı kapakları, yüz maskesi ve kesmeye dayanıklı eldivenler de dahil olmak üzere çift eldiven içeren kişisel koruma ekipmanları giyin.İnsan CD45 pozitif hücrelerinin %15'inden fazlasının yeniden yapılandırılmasına ve HIV-1 enfeksiyonu için serumda insan albumini bulunan fareleri seçin. İntraperitoneally fare başına 100 ila 200 mikrolitre hacminde 50 HIV-1 ADA 50 HIV-1 ADA enfeksiyöz dozlarda 1, 000-10, 000 doku kültürü enfeksiyöz doz ile fareler enjekte. Fareler ötenazi sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi her fareden karaciğer ilerler.Toplamak ve% 4 paraformaldehit gecede karaciğer düzeltmek. İnsan karaciğeri ve bağışıklık hücreleri ile çift insanlı fare modelinin kurulması, sırasıyla çok basit ELIZA ve akış sitometrisi ile her adımda kolayca izlenebilir. Akış sitometrisi fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin gelişimini değerlendirmek ve HIV enfeksiyonunun bağışıklık hücreleri üzerindeki etkisini görmek için düzenli olarak yapılır.Çift insanlaşmış farelerde, fonksiyonel bağışıklık hücrelerinin gelişimi lenfosit kapısının% 15 ila% 90 arasında değişebilir. İnsan hepatositlerinin engreftasyonunun değerlendirilmesi için, insana özgü albumin düzeyleri için ELIZA aylık olarak fare serumuna yapılır. Hem HSP'ler hem de HEP'ler ile engrafted fareler bir ay mililitre başına 377 mikrogram yaklaşık yedi mikrogram arasında değişen insana özgü albumin düzeyleri göstermek, gözlem süresi içinde büyümeye devam.HIV enfeksiyonunun insan bağışıklık hücreleri üzerindeki etkisi çift insanlaşmış farelerin kanında akış sitometrisi ve karaciğerdeki HEP'ler üzerinde insana özgü albumin ELIZA tarafından izlenmektedir. Beş hafta içinde, HIV-1 serumda insan albumin düzeylerinde azalmaya neden olur ve çift insanlaşmış farelerin karaciğer bölümlerinde insan CK18 pozitif hepatositlerin tükenmesi vardır. CD4'ün CD8'e oranının daha düşük olduğu tipik olarak HIV ile enfekte olmuş farelerin kan ve karaciğerinde, enfeksiyon öncesi aynı farede belirtilen seviyelere göre görülür.Kan buffy kat izolasyonları için lenfosit ayırma ortamı üstüne dikkatle katmanlı olmalıdır. Ameliyat için dalağı hafifçe tutun ve iğneyi dalağının alt kutbuna yerleştirin. Hematopoetik kök hücrelerin izolasyonundan sonra, CD3 pozitif hücrelerden ve farklı donörden akut hepatosit enjeksiyonlarından kaçınmak için CD34 pozitif hematopoetik kök hücrelerin saflığını kontrol etmek çok önemlidir.İnsanlaşmış fareler insan bağışıklık sistemi ve karaciğer fizyolojik yönünü göstermek gibi, gelişmiş fareler HIV ve fiziksel enfeksiyonlar ve siroz fizyopatogenez irdelemek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

8-iyi Odası Slayt in vitro Biyofilm Oluşumu

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Böcek<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bakteriyel Patogenez İnceleyecek Güçlü Enfeksiyon Model olarak

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

İki fotonlu Lipopolysaccharide tedavi fare karaciğer bağışıklık yanıtında sırasında lökositlerin Intravital görüntüleme

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Humanized NOD/SCID/IL2rÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³null hu-NSG Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

İnsanlaşmış NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) fare modeli HIV çoğaltma ve gecikme süresi çalışmaları için

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Virülans ve Aeromonas enfeksiyon Caenorhabditis elegans modelindeki patogenezinde değerlendirilmesi

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...