Denne metode kan hjælpe os med at løse centrale spørgsmål vedrørende den rolle, ekstracellulære vesikler in vivo, ved at give os en kilde til vesikler, der er repræsentative for det lokale væv mikromiljø. Undersøgelser af ekstracellulære vesikler i vævsmiljøet kan fremme vores forståelse af de fysiologiske roller ekstracellulære vesikler og deres ændringer i patofysiologiske processer in vivo. En visuel demonstration af portalen vene cannulation er nyttigt, da den lille størrelse af venen gør det vanskeligt at vende manipulere.
Demonstration af proceduren med Doctor Kaori Ishiguro vil være Irene Yan, en forskning teknolog fra mit laboratorium. Før du begynder proceduren, sikre lemmer af en bedøvet mus og forbinde 23 gauge nål af en bevinget blodtapning indstillet til den frie ende af et stykke sprøjte pumpe slange. Rengør bughulen af musen med 70% ethanol og en alkohol pad og bruge en saks til at åbne musen fra den forreste af brystet til bækkenbenet, passe på ikke at skade nogen indre organer.
Brug en bomuld tippet applikator til forsigtigt at flytte tarmene til højre side af bughulen til at udsætte portalen vene og ringere vena cava og bruge buede kraftgrene til at placere en tråd under portalen vene. Bind en knude løst i suturen for at forberede dig til cinching efter kanylen og fyld kanylen med 40 grader Celsius HBSS, indtil opløsningen når kanylenspidsen. Sæt kanylen i portalvenen fem til 10 millimeter under ligaturen og fastgør kanylen med suturen.
Start infusionen med en 1-2 milliliter pr. minutstrømningshastighed. Hvis kanylen var korrekt placeret, leveren vil begynde at blanche. Skær ringere vena cava og lad den overdrevne væske i leveren til at dræne.
Langsomt øge strømningshastigheden til otte milliliter i minuttet, indtil en fuld 50 milliliter HBSS er blevet perfunderet gennem leveren i løbet af de næste fem minutter. Lige før HBSS løber ud, ændre frisk forberedt 40 grader Celsius kollagen fire opløsning til perfusate bægerglas og bruge kraftkker til at anvende forbigående pres på ringere vena cava på fem sekunders mellemrum at få leveren til at svulme op og hjælpe med væv fordøjelse og dissociation. Som fordøjelsen skrider frem, vil leveren svulme op og blive hvid.
Når forbliver deprimeret efter blid sondering med en bomuld tippet applikator, stoppe pumpen og fjerne kanylen. Fjern galdeblæren fra leveren, passe på ikke at rive galdeblæren væv, og bruge rene saks og scef til at høste leveren i en steril 10 centimeter kultur parabol af PBS. Efter skånsom vask, overføre leveren i en ny 10 centimeter kultur fad indeholder frisk kollagen fire opløsning og bruge to rene kraftfæcener til at rive leveren, mens forsigtigt ryster at adskille cellerne fra levervævet.
Når hele organet er fragmenteret, skal du bruge en tre millilitersprøjte til at triturere vævsslamenten, indtil de ufordøjede leverstykker rystes af. Hæld den resulterende celleopløsning gennem en 70 mikron nylon mesh si i en 50 milliliter konisk rør, vask skålen med HBSS at indsamle eventuelle resterende celler. Pool vasken med enkelt celle suspension og fjerne hepatocytter ved centrifugering.
Overfør derefter supernatanten til et nyt 50 milliliterrør. For at fjerne andre celler skal supernatanten centrifugeres, før den overføres til et nyt konisk rør på 50 milliliter. Fjern de døde celler med en anden centrifugering og overføre supernatant i en rund bund rør til at fjerne eventuelle celle snavs og aggregater.
Overfør nu supernatanten til et polycarbonat ultracentrifugerør og opslæm pellet i ca. 20 milliliter PBS i en anden og sidste ultracentrifugering. Derefter opslænves den ekstracellulære nanovesicle pellet i en milliliter PBS for minus 80 grader Celsius opbevaring, hvis vesicles ikke straks vil blive analyseret. Fra en enkelt muselever giver denne metode en ekstracellulær vesiclekoncentration, der varierer fra 1,74 til fire gange 10 til tolvte med et gennemsnit på 3,46 gange 10 til de tolvte partikler pr. milliliter som bestemt ved nanopartikelsporingsanalyse.
Gennemsnitsstørrelsen af de isolerede levervæv ekstracellulære vesikler er 157,7 nanometer med en tilstandsstørrelse på 144,5 nanometer og ekstracellulære vesikler størrelser spænder fra 100 til 600 nanometer ved nanopartikel tracking analyse. De ekstracellulære vesikler, der er isoleret ved hjælp af denne fremgangsmåde, er egnede til downstream-anvendelser, og den yderligere karakterisering kan omfatte morfologiske vurderinger ved elektromikroskopi eller analyse af deres overflademarkører eller -indhold.
