Name: isolation of tissue extracellular vesicles from the liver
Uploaded: 2019-08-21T12:30:00
Duration: 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver at JoVE.com

Deze studie werd gesteund door de financiering van het National Cancer Institute Grant CA-217833.

Alle studies waarbij dieren werden betrokken, werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol dat werd goedgekeurd door de Mayo Clinic institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité.
1. voorbereiding van de Bank
<ol><li>Maak een waterbad en stel het in op 37 °C. De andere benodigde apparatuur en opstelling worden weergegeven in Figuur 1.</li>
	<li>Meet 100 mg Collagenase type IV en voeg het toe aan een kolf van 125 mL die 100 mL HBSS bevat in een waterbad (40 °C). Zorg ervoor dat de Collagenase is opgelost door de vloeistof in de kolf te zwengelen en zorg er ook voor dat de kolf volledig in het waterbad wordt ondergedompeld. Voor een grotere efficiëntie, laat de collagenase te ontbinden voor ten minste 30 min, zelfs als het lijkt te ontbinden onmiddellijk.</li>
	<li>Dompel een kolf van 125 mL met 50 mL HBSS in een waterbad van 40 °C onder. Dit wordt gebruikt voor de initiële Flushing.</li>
	<li>Spuit het oppervlak van alle instrumenten zoals de schaar en de Tang met 70% ethanol. Maak een paar schone wattenstaafjes.</li>
	<li>Spoel de slang van de pomp uit door de pomp met 70% ethanol uit te voeren en verwijder eventuele rest ethanol door het tweemaal met stromend water te spoelen.</li>
	<li>Leg een absorberend Bank blok op de labbank en plaats een harde doos container bovenop. Dit is nodig om overtollige vloeistoffen te bevatten tijdens de perfusie van de muis. Wikkel een piepschuim pad met aluminiumfolie en plaats het in de container.</li>
	<li>Plaats een steriel 10 cm kweek schaaltje dicht bij de Bank. Dit zal worden gebruikt om de verteerde lever te houden nadat de perfusie is voltooid.</li>
	<li>Giet van tevoren 10 mL Collagenase medium (stap 1,2) in een steriel kweekbakje.</li>
	<li>Met behulp van een gevleugelde bloedverzamelset, Verbind de 23-gauge met het vrije uiteinde van de pomp slang (het snijden van de vleugels van de vlinder canule kan leiden tot een betere handling). Pas de punt van de canule van bloedinzameling is gevuld.</li>
</ol>2. voorbereiding van dieren
<ol><li>Voordat u begint met anesthesie met behulp van isoflurane, zorg ervoor dat er een voldoende hoeveelheid levergas beschikbaar is voor de duur van de procedure. Zet de zuurstof (O2) toevoer naar de inductie kamer op 1-2 L, schakel vervolgens Isofluraan tussen 2-4% met behulp van een debietmeter.</li>
	<li>Plaats de muis in de inductie kamer en sluit de bovenste deur. Controleer de muis totdat deze is liggend. Opmerking: de gassen in de kamer houden de muizen verdomiliseerd gedurende enkele minuten.</li>
	<li>Plaats de muis op een polystyreen schuim pad verpakt met aluminiumfolie. Schakel de stroom van de inductie kamer naar een nosecone. Zorg ervoor dat anesthesie voldoende is. Als de muis is begonnen te reageren, voorzichtig te onderdrukken in een neuskegel tot de het volledig anesthetized.</li>
	<li>Zorg voor anesthesie door het bewaken van de ademhaling en reactie op stimulatie tijdens de procedure. Pas de rate flowmeter zo nodig om voldoende anesthesie te garanderen. De poten moeten niet reageren op de knijp test onder verdoving. Aanvullende gegevens kunnen worden verkregen uit de laboratorium gids voor de verzorging van dieren.</li>
	<li>Plak of speld alle vier de ledematen van de muis.</li>
	<li>Reinig de huid over de buik door te spuiten met 70% ethanol en veeg het af met gaas en een alcoholdoekje. Deze stap is essentieel om besmetting van de muis vacht te voorkomen.</li>
	<li>Maak een wijd open snede door de huid van de voorste naar het bekken bot met behulp van een set steriele schaar. Let op dat u geen inwendige organen snijdt. Verplaats de darmen naar de linkerzijde van het dier met behulp van een katoen getipt applicator om zachtjes de portaal ader (PV) en de inferieure vena cava (IVC) bloot te leggen.</li>
</ol>3. cannulatie en perfusie (0,5 h)
<ol><li>Met behulp van gebogen Tang, plaats een draad onder de poortader en bind een knoop losjes om te bereiden strak na de cannulatie.</li>
	<li>Plaats de canule (23G uit de bloedverzamelset) in de portaal ader 5-10 mm onder de ligatuur. Plaats de canule niet langs de eerste portaal vertakking, anders kan de rechter voorste kwab onvoldoende geperfectiongebruikt worden. De canule kan worden bevestigd of met draad worden vastgemaakt met een Stop knoop.</li>
	<li>Start de pomp om de HBSS met een laag debiet te insmelten (1-2 mL/min). Zodra de cannulatie is bevestigd om succesvol te zijn, zal de lever beginnen te blancheer.</li>
	<li>Snijd de IVC om de druk te verlichten en laat overmatige vloeistof binnen de lever te drain. Dit wordt het best uitgevoerd met behulp van de andere hand van de operators, zodat de canule niet wordt verplaatst.</li>
	<li>Verhoog langzaam de stroomsnelheid tot 8 mL/min en voltooi de perfusie met het volledige 50 mL volume HBSS via de lever, gedurende de volgende 5 minuten.</li>
	<li>Verander de Collagenase met medium (stap 1,2) in het bekerglas vlak voordat de HBSS begint te lopen. Zorg ervoor dat luchtbellen niet aanwezig zijn en niet in de lever stromen bij het verwisselen van het medium.</li>
	<li>Breng een voorbijgaande druk aan op de IVC met een interval van 5 sec. door te klemmen met een tang. Dit zal leiden tot de lever zwellen en helpen met weefsel spijsvertering en dissociatie (7-8 min). Naarmate de spijsvertering vordert, zal de lever zwellen en wit worden. De lever kan gelijkmatig opzwellen tot ongeveer tweemaal de oorspronkelijke grootte.</li>
	<li>Zet de pomp uit en verwijder de canule zodra de spijsvertering is voltooid. De voltooiing van de lever spijsvertering zal afhangen van de grootte van de muis en de toestand van de lever. Een deuk in de lever kan worden waargenomen als een katoen getipt applicator wordt gebruikt om zachtjes sonde de lever.</li>
	<li>Verwijder de galblaas uit de lever, voorzichtig zijn om het niet te scheuren. Gebruik een gewassen schaar en een tang, haal de lever uit de muis in een steriele 10 cm kweek schaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor oppervlakte wassen. Breng de lever voorzichtig over in de steriele 10 cm kweek schaal met collagenase medium (uit stap 1,8). Dit is een cruciale stap voor het voorkomen van besmetting van de muis bloed en Gal.</li>
	<li>Pak en scheur de lever uit met twee schone Tang en schud de cellen voorzichtig van de lever. Als dit gebeurt, zal het medium worden vertrooneerd. Alle hepatocyten kunnen worden weggeschud, waardoor het bindweefsel en het vaatweefsel achterblijven.</li>
	<li>Triturate de cel oplossing vele malen met behulp van een 3 mL spuit totdat de niet-verteerde delen van de lever worden geschud. Giet het af in een conische buis van 50 mL met 70 μm nylon celstrainers om onverteerd bindweefsel te filteren. Was de schaal met HBSS om de resterende cellen te verzamelen en vul de conische buis van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeer zachtjes de conische buis van 50 mL in een draaiende emmer rotor bij 50 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Breng de supernatant over naar een nieuwe conische buis van 50 mL.</li>
</ol>4. isolatie van EVs (5 uur)
<ol><li>Centrifugeer het supernatant bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Breng het supernatant over in een nieuwe conische buis van 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeer het supernatant bij 2000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c om celresten en-aggregaten te verwijderen.</li>
	<li>Breng de supernatant over naar een ronde bodem buis en Centrifugeer het supernatant bij 10.000 x g voor 70 min bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel de supernatant en plaats in een polycarbonaat ultracentrifuge buis en centrifugeer bij 100.000 x g voor 70 min bij 4 °C.</li>
	<li>Verzamel de pellet in een ultracentrifuge buis die vervolgens wordt gewassen door opnieuw te suspenseren in PBS. Centrifugeer het supernatant verder op 100.000 x g voor 70 min bij 4 °C.</li>
	<li>De laatste pellet bestaande uit cellulaire nano blaasjes kan direct worden gebruikt voor experimenten of opnieuw worden opgehangen met 1000 μL PBS en opgeslagen bij-80 °C.</li>
</ol>5. beoordeling van de kwaliteit en het rendement van isolaties
<ol><li>Evalueer de grootteverdeling en de concentratie met behulp van nanodeeltjes tracking analyse of instelbare resistieve Pulsdetectie volgens de protocollen van de fabrikant van het instrument.</li>
	<li>Verdere isolatie en zuivering van specifieke vesikelpopulaties uitvoeren door verschillende benaderingen, zoals de toevoeging van een sacharose gradiënt of kussen, immunoaffiniteits technieken, of grootte uitsluitings chromatografie, gebaseerd op specifieke experimentele behoeften.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer:+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth.">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li><li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+liver+diseases.">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li><li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture.">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een optimale en reproduceerbare methode voor de isolatie van leverweefsel EV met behulp van een tweestapsperfusie proces via de portaal ader gevolgd door differentiële ultracentrifugatie. Belangrijke stappen van de procedure omvatten canule plaatsing, Collagenase concentratie en spijsvertering tijd, stroomsnelheid van het medium, behandeling van het weefsel na de spijsvertering, en klassieke differentiële ultracentrifugatie.
Celscheiding wordt bereikt door scheiding van bindweefsel componenten na de spijsvertering met behulp van Collagenase type IV. De concentratie van Collagenase gebruikt voor perfusie kan variëren van 0,1 tot 5 mg/mL. Er kan aanzienlijke variatie in batch-to-batch in de werkzaamheid van Collagenase voor weefsel spijsvertering. De concentraties van Collagenase van 0,5 tot 5 mg/mL werden getest, maar de gebruikte concentratie had geen grote invloed op de opbrengst van de verkregen EVs. Met behulp van een hogere concentratie van Collagenase zal resulteren in een snellere zwelling en bleken van de lever. Het doel is om bevredigende celdissociatie te verkrijgen zonder overmatige verontreiniging of beschadiging. Een optimale concentratie van Collagenase gebruikt in deze isolaties is 1-2 mg/ml geperfundeerd voor 7-8 min bij een debiet van 8 ml/min. Een te lange perfusie procedure zal het risico op het vernietigen van het dunne bindweefsel in de lever verhogen en de technische Risico's verhogen zoals naald dislodgment van de portaal ader of lucht overvullen met de ader.
Het meest uitdagende aspect van dit protocol is de cannulatie van de portaal ader. Dit kan een uitdaging zijn om uit te voeren, met name bij muizen in het bereik van 18 tot 25 g. De technieken voor Collagenase perfusie werden oorspronkelijk ontwikkeld voor gebruik bij ratten en vervolgens goedgekeurd voor gebruik bij muizen na talrijke aanpassingen en aanpassingen. Cannulatie met behulp van een 23G bloed verzameling set is gemakkelijker dan de plaatsing van een katheter in de bloedvaten van de kleine Luminale diameter. Bevestiging van de canule met behulp van draad met een Stop knoop wordt aanbevolen om dislodgement te voorkomen en de knoop dient ook als een marker van de locatie van de portaal ader in het geval de canule van het vat komt.
Voor downstreamanalyse is het uiterst belangrijk om minimale verontreiniging door cellen te hebben. Er zijn verschillende belangrijke overwegingen bij de behandeling van weefsel na de spijsvertering. Ten eerste worden de Tang en de schaar gewijzigd wanneer de lever wordt geëxtraheerd om bloed verontreiniging te voorkomen. Ten tweede is het van cruciaal belang dat de galblaas zorgvuldig uit de lever wordt verwijderd om scheuren en ongewenste besmetting van gal te voorkomen. Ten derde, zodra de lever is verwijderd uit de muis, wordt de lever zeer voorzichtig gewassen met behulp van PBS om bloed te verwijderen. Het minimaliseren van besmetting met cellen moet een hogere prioriteit krijgen dan vermindering van de opbrengst van de verkregen EVs.
Ultracentrifugatie is de meest gebruikte methode voor de isolatie en zuivering van EVS8,9,10,11. Deze aanpak zal de meeste parenchymale cellen verwijderen, zoals hepatocyten of cholangiocytes en niet-parenchymale cellen zoals Kupffer cellen, sinusoïdale endotheliale cellen en stervormige cellen, Bovendien zullen celresten, celaggregaties en dode cellen ook verwijderd door differentieel centrifugeren. Verdere zuivering en isolatie van specifieke populaties kan worden uitgevoerd door de grootte uitsluitings chromatografie om alle niet-vesiculaire eiwit aggregaten of lipoproteïnen te verwijderen.
Een beperking van dit protocol is dat het niet kan vangen alle weefsel blaasjes, gezien de mogelijkheid dat sommige blaasjes kunnen worden verwijderd in de perfusate. Als een globale beoordeling nodig is, moet de verzameling van perfusaat en isolatie van blaasjes binnen perfusaat worden overwogen. Een verdere beperking is het potentieel voor celbeschadiging. Om de potentiële impact van overmatige celdood te monitoren, kan de levensvatbaarheid van de cellen worden bewaakt en opgenomen in kwaliteitsparameters voor weefsel-EV-isolaties. Concluderend, deze procedure beschrijft een geoptimaliseerde workflow met behulp van een twee-stappen perfusie techniek via de portaal ader gevolgd door differentiële ultracentrifugatie voor het verkrijgen van leverweefsel EVS van muis levers bij een hoge opbrengst. Deze weefsel EVs zijn geschikt voor downstreamanalyses zoals de karakterisering van biomoleculaire samenstelling en andere studies die tot doel hebben hun fysiologische of pathofysiologische rollen of potentiële toepassingen als ziekte markeringen te karakteriseren.

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn membraan-gebonden blaasjes die vrijkomen uit veel verschillende soorten cellen in het lichaam. EVs bevatten een lading moleculen die RNA, DNA en eiwitten bevatten. Overdracht van deze lading door EVs van de ene cel naar de andere wordt gepostuleerd als één mechanisme waarmee cellen in weefsels met elkaar communiceren1. Het merendeel van de informatie met betrekking tot de lading of rollen van EVs in normale gezondheid en ziekten is afgeleid van studies over Ev's die zijn verkregen uit cellen in cultuur of verzameld uit de circulatie of andere lichaamsvloeistoffen2. Om hun fysiologische rollen in vivote begrijpen, is een robuuste methode nodig voor de isolatie van weefsel EVS die alle populaties van ev's vangt en cellulaire schade of verontreiniging vermijdt3. Het algemene doel van de beschreven methode is om weefsel EVs van muis levers te isoleren.
De meeste celtypen in de lever is aangetoond dat het produceren van EVs, en de studie van EV gebaseerde signalering is het bevorderen van basiskennis en begrip van hepatische ziekten. De gecombineerde impact van Ev's uit verschillende celtypen binnen weefsels wordt echter slechts gedeeltelijk begrepen. Isolatie van EVs uit lever weefsels is noodzakelijk om de in situ bijdragen van ev's binnen het weefsel milieu te begrijpen. De hierin beschreven aanpak is gebaseerd op een twee-stele perfusie om weefsel dissociatie te verbeteren en celbeschadiging te minimaliseren. Vervolgens worden Ev's geïsoleerd van het gedissocieerde leverweefsel. Benaderingen met behulp van twee-stap perfusie voor isolatie van hepatocyten zijn gebruikt sinds de vroege jaren 19504. Deze methoden voor de hepatocyten isolatie zijn gewijzigd en voortdurend verbeterd en zijn nu standaard benaderingen voor isolatie van hepatocyten in culturen, in celsuspensies, en uit de weefsels5,6,7. In de eerste stap wordt de lever onderworpen aan een niet-Recirculerende perfusie met een calcium vrije buffer, de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS). In de tweede stap wordt de lever geperfectiongebruikt met collagenase om de extracellulaire matrix te ontbinden voor verdere scheiding van desmosomale cel-naar-celknooppunten. Een optimale behandelingstijd voor Collagenase-ontbinding is 7 tot 10 minuten. Een kortere behandelingsduur zal leiden tot onvolledige ontbinding en behoud van celcontacten in de lever, terwijl een langere duur leverschade kan veroorzaken of verstoring van de portaal ader. Ev's worden vervolgens geïsoleerd met behulp van differentiële centrifugeren om cellen en cellulair puin te verwijderen. Dit resulteert in EV-inzameling in hoge opbrengsten die kunnen worden gebruikt voor verdere downstreamanalyses of studies.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:168px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB500125</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Curved non-serrated scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Masking tape</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Styrofoam pad</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:168px;">Scientific inc.</td>
			<td>B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Masterflex L/S Digital Miniflex Pump</td>
			<td style="width:168px;">Cole-parmer</td>
			<td>ZX-07525-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Water bath</td>
			<td>Thermo Electron Precision</td>
			<td>2837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:432px;">Blood collection sets</td>
			<td style="width:168px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">367292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:432px;">Petri dish, clear lid 100x15</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 70mm Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Moore medical</td>
			<td>69622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">25mL Serological Pipet</td>
			<td style="width:168px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser</td>
			<td>BioSurplus</td>
			<td>203-2751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:432px;">&#160;Levo Plus Motorized Pipette Filler</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>74020002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5804R</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>22628048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>969347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B34182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JA-25.50Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Round-bottom tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Reagents</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">HyClone Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30588.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase, Type IV, powder</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tissue extracellular vesicles from the liver

Extracellulaire blaasjes (Ev's) kunnen worden vrijgegeven uit vele verschillende celtypen en gedetecteerd in de meeste, zo niet alle, lichaamsvloeistoffen. EVs kan deelnemen aan cel-naar-cel communicatie door het afsluiten van bioactieve moleculen zoals RNA of eiwitten van de ene cel naar de andere. De meeste studies van EVs zijn uitgevoerd in celkweek modellen of in EVs geïsoleerd van lichaamsvloeistoffen. Er is een opkomende interesse in het isoleren van Ev's uit weefsels om hun bijdrage aan fysiologische processen te bestuderen en hoe ze worden veranderd in ziekte. De isolatie van EVs met voldoende opbrengst uit weefsels is technisch uitdagend vanwege de noodzaak van weefsel dissociatie zonder cellulaire schade. Deze methode beschrijft een procedure voor de isolatie van EVs van muis leverweefsel. De methode omvat een proces in twee stappen, beginnend met in situ Collagenase-spijsvertering, gevolgd door differentiële Ultra-centrifugatie. Weefsel perfusie met behulp van Collagenase biedt een voordeel ten opzichte van mechanisch snijden of homogenisatie van leverweefsel als gevolg van de toegenomen opbrengst van verkregen EVs. Het gebruik van dit proces in twee stappen om Ev's uit de lever te isoleren zal nuttig zijn voor de studie van weefsel EVs.

Het apparaat dat nodig is voor deze isolaties bestaat uit Standaard laboratoriumapparatuur, waardoor dit een relatief eenvoudige en kosteneffectieve aanpak is. Isolaties zijn uitgevoerd van twaalf tot dertig weken oude mannelijke en vrouwelijke Balb/c-of FVB-muizen. Het bakje met de muis is bekleed met aluminiumfolie in een hard-ommuurde container die overtollige vloeistoffen verzamelt tijdens de perfusie. De kolven die HBSS of Collagenase-bevattende medium bevatten, worden ondergedompeld in een waterbad (40 °C) dat klaar is om te worden gebruikt. Er worden twee steriele 10 cm cultuur gerechten gebruikt. Een is nodig voor oppervlakte wassen met PBS, en de andere voor het scheiden van hepatocyten van de bindweefsel componenten.
Bij deze methode wordt de lever geperfectiongebruikt op een niet-continue manier via de portaal ader in de voorkeur voor de cannulatie van de inferieure vena cava. Een alternatieve en veelgebruikte perfusie benadering is het uitvoeren van retrograde perfusie door het cannuleren van de inferieure Vena Cava en het snijden van de portaal ader voor drainage. Echter, portaal ader cannulatie is gemakkelijk te bereiken en impliceert een korte afstand tot de lever, als de portaal ader voedt rechtstreeks in de lever8. De selectie van een invoegpunt voor de cannulatie is cruciaal voor een optimaal succes (Figuur 2). De canule is geplaatst langs de takken van de maag en de alvleesklier aderen, maar niet buiten de eerste portaal tak (rechts en links hepatische portaal aders). Zodra de optimale insertie locatie in de portaal ader wordt geïdentificeerd, worden gebogen Tang gebruikt om een draad onder portaal ader te plaatsen en een losse knoop te binden. De naald van de canule is bevestigd met draad met behulp van een Stop knoop om te voorkomen dat de naald eruit valt.
Figuur 3 schetst het algemene verwerkingsschema voor het differentieel centrifugeren voor EVS-isolatie van leverweefsel. Ultracentrifugatie verwijdert cellen, vuil en andere onzuiverheden. De eerste vier stappen voor centrifugeren (50 x g, 300 x g, 2.000 x g, 10.000 x g) zijn ontworpen om hepatocyten te verwijderen, andere cellen, dode cellen of celresten respectievelijk intact te krijgen. (Figuren 4a en 4b). Na deze stappen wordt ultracentrifugatie opnieuw uitgevoerd bij 100.000 x g om de pellet te verzamelen (Figuur 4C). De pellet wordt gewassen door opnieuw te suspengeren in PBS en onderworpen aan een definitieve ultracentrifugatie bij 100.000 x g. De pellet na ultracentrifugatie is absoluut zichtbaar en kleverig in deze procedure in vergelijking met EVS van geconditioneerde cultuur media. Pipetteren is vaak nodig totdat bruine aggregaten uit het zicht zijn en volledig zijn opgelost. De laatste pellet wordt opnieuw opgehangen met 1000 μL PBS (Figuur 4D). Ultracentrifugatie verwijdert onzuiverheden en andere oplosbare verontreinigingen uit het plasma, wat functionele experimentele uitkomsten kan beïnvloeden. De centrifugeren wordt bij 4 °C uitgevoerd.
Van muis lever, deze methode levert een weefsel EV-concentratie die varieert van 1,74 tot 4,00 x 1012 met een gemiddelde van 3,46 x 1012 deeltjes per ml, zoals bepaald door nanodeeltjes tracking analyse (NTA) (Figuur 5). De gemiddelde grootte van het geïsoleerde leverweefsel EVs was 157,7 nm, met een grootte van 144,5 nm en EV maten variërend van 100-600 nm door NTA. De opbrengst van EV zal afhangen van factoren zoals het lever gewicht en de verliezen binnen de perfusaat of ultracentrifugeren stappen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> Figuur 1 : Bench voorbereiding. De materialen en hun locaties zijn: (A) pomp, (B) opgewarmde 125 mL kolf met HBSS en water zuig poort, (C) neuskegel aangesloten op een Isoflurane Vaporiser, (D) wateruitlaat poort van de pomp die verbindt met naald, (E) tray bekleed met aluminiumfolie in een harde ommuurde container, en (F) 10 cm kweek schotel waarin Collagenase medium vooraf wordt gegoten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> Figuur 2 : Cannulatie site. De anatomie van de buik van de muis wordt getoond. Met behulp van gebogen Tang, een draad wordt geplaatst onder de poortader (PV) en een losse knoop is gebonden. De insertie locatie is in de buurt van de lever, 5-10 mm onder de ligatuur, maar niet buiten de eerste Portal tak (linker en rechter hepatische portaal aders). De canule is vast of vastgemaakt met schroefdraad met een Stop knoop. Deze knoop dient als een marker van de PV-locatie als de canule wordt gedemonaangevraagd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> Figuur 3 : Schematische stappen van centrifugeren. Het doel is om ongewenste cellen en andere componenten te verwijderen en EVs te isoleren. De eerste vier Centrifugeer stappen zijn ontworpen om hepatocyten en andere cellen, dode cellen of celresten te verwijderen met behulp van differentiële centrifugatie. Na deze stappen wordt ultracentrifugatie uitgevoerd bij 100.000 x g om de pellet van EVs te verzamelen. De pellet wordt gewassen door opnieuw te suspengeren in PBS en onderworpen aan een definitieve ultracentrifugatie bij 100.000 x g. Alle Centrifugeer stappen worden uitgevoerd bij 4 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> Figuur 4 : Differentieel centrifugeren. A) na centrifugeren bij 50 x g gedurende 10 min wordt een pellet met hepatocyten waargenomen. B) een ronde bodem buis wordt gebruikt voor centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 70 min om celresten te verwijderen. C) een polycarbonaat ultracentrifuge buis wordt gebruikt voor centrifugeren bij 100.000 x g gedurende 70 min. De pellet wordt verzameld in één buis en gewassen door opnieuw te schorsen met PBS. D) de laatste pellet wordt opnieuw opgehangen in 1000 μL PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> Figuur 5 : Representatief resultaat. De grootte en concentratie van EVs van leverweefsel kunnen worden bepaald door nanodeeltjes-traceer analyse (NTA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver at JoVE.com

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Dit is een protocol om weefsel extracellulaire blaasjes (EVs) te isoleren van de lever. Het protocol beschrijft een proces in twee stappen waarbij Collagenase perfusie gevolgd door differentiële ultracentrifugatie om leverweefsel EVs te isoleren.

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen met betrekking tot de rol van extracellulaire milticles in vivo aan te pakken, door ons een bron van vikjes te bieden die representatief zijn voor de lokale weefselmicro-omgeving. Studies naar extracellulaire blaasjes in het weefselmilieu kunnen ons begrip van de fysiologische rol van extracellulaire blaasjes en hun veranderingen in pathofysiologische processen in vivo bevorderen. Een visuele demonstratie van de poortader cannulation is nuttig als de kleine omvang van de ader maakt het moeilijk om te draaien manipuleren.Het aantonen van de procedure met Dokter Kaori Ishiguro zal Irene Yan, een onderzoek technoloog van mijn lab. Voordat u met de procedure begint, beveiligt u de ledematen van een verdoofde muis en sluit u de 23-meter naald van een gevleugelde bloedafname aan het vrije uiteinde van een stuk spuitpompbuizen. Reinig de buikhuid van de muis met 70% ethanol en een alcoholpad en gebruik een schaar om de muis te openen van de voorste van de borst tot het bekken, waarbij u ervoor zorgt dat geen inwendige organen worden beschadigd.Gebruik een katoenen kip applicator om de darmen voorzichtig naar de rechterkant van de buikholte te verplaatsen om de poortader en inferieure vena cava bloot te leggen en gebogen tangen te gebruiken om een draad onder de poortader te plaatsen. Bind een knoop losjes in de hechting voor te bereiden op cinching na de cannulatie en vul de canule met 40 graden Celsius HBSS totdat de oplossing de canule naaldpunt bereikt. Steek de canule in de poortader vijf tot 10 millimeter onder de ligatuur en zet de canule vast met de hechting.Start de infusie met een één tot twee milliliter per minuut stroomsnelheid. Als de canule correct is geplaatst, zal de lever beginnen te blancheren. Snijd de inferieure vena cava en laat de overmatige vloeistof in de lever uitlekken.Langzaam verhogen van de stroomsnelheid tot acht milliliter per minuut tot een volledige 50 milliliter HBSS is geperfundeerd door de lever in de komende vijf minuten. Net voordat de HBSS opraakt, verander vers bereide 40 graden Celsius collagenase vier oplossing voor de perfusate beker en gebruik tangen om tijdelijke druk toe te passen op de inferieure vena cava met vijf seconden intervallen om de lever te zwellen en te helpen met weefsel spijsvertering en dissociatie. Naarmate de spijsvertering vordert, zal de lever zwellen en wit worden.Wanneer de resten depressief na zachte indringende met een katoen getipt applicator, stop de pomp en verwijder de canule. Verwijder de galblaas uit de lever, voorzichtig niet te scheuren de galblaas weefsel, en gebruik schone schaar en tangen om de lever te oogsten in een steriele 10 centimeter cultuur schotel van PBS. Na het zachte wassen, breng de lever in een nieuwe 10 centimeter cultuur schotel met verse collagenase vier oplossing en gebruik twee schone tangen om de lever te scheuren terwijl zachtjes schudden om de cellen te scheiden van het leverweefsel.Wanneer het hele orgaan is gefragmenteerd, gebruik dan een drie milliliter spuit om het weefsel drijfmest triturate totdat de onverteerd stukken van de lever worden geschud. Giet de resulterende celoplossing door een 70 micron nylon mesh zeef in een 50 milliliter conische buis, het wassen van de schotel met HBSS om eventuele resterende cellen te verzamelen. Verpool de was met de eencellige suspensie en verwijder de hepatocyten door centrifugatie.Breng de supernatant vervolgens over naar een nieuwe buis van 50 milliliter. Om andere cellen te verwijderen, centrifugeren de supernatant voordat overdracht in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Verwijder de dode cellen met een andere centrifugatie en breng de supernatant in een ronde bodem buis om eventuele celpuin en aggregaten te verwijderen.Breng nu de supernatant in een polycarbonaat ultra centrifuge buis en resuspend de pellet in ongeveer 20 milliliter PBS voor een tweede en laatste ultra centrifugatie. Dan resuspend de extracellulaire nanovesicle pellet in een milliliter PBS voor min 80 graden Celsius opslag als de vesicles niet onmiddellijk worden geanalyseerd. Van een enkele muislever levert deze methode een weefsel extracellulaire vesicleconcentratie op die varieert van 1,74 tot vier keer 10 tot de twaalfde met een gemiddelde van 3,46 keer 10 tot de twaalfde deeltjes per milliliter, zoals bepaald door nanodeeltjes tracking analyse.De gemiddelde grootte van het geïsoleerde leverweefsel extracellulaire vesicles is 157,7 nanometer met een modus grootte van 144,5 nanometer en extracellulaire vesikels maten variërend van 100 tot 600 nanometer door nanodeeltjes tracking analyse. De extracellulaire luiers die met deze benadering geïsoleerd zijn, zijn geschikt voor downstreamtoepassingen en de verdere karakterisering kan morfologische beoordelingen door elektromicroscopie of analyse van hun oppervlaktemarkers of inhoud omvatten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Geoptimaliseerd Protocol voor de Extractie van Proteïnen uit de Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Snelle isolatie van de Mitoribosome van HEK cellen

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolatie van histone van Sorghum Leaf Tissue voor Top Down Mass Spectrometry Profiling van potentiële epigenetische markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identificatie van peptiden van kleine extracellulaire blaasjes uit van beenmerg afgeleide macrofagen

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...