Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen met betrekking tot de rol van extracellulaire milticles in vivo aan te pakken, door ons een bron van vikjes te bieden die representatief zijn voor de lokale weefselmicro-omgeving. Studies naar extracellulaire blaasjes in het weefselmilieu kunnen ons begrip van de fysiologische rol van extracellulaire blaasjes en hun veranderingen in pathofysiologische processen in vivo bevorderen. Een visuele demonstratie van de poortader cannulation is nuttig als de kleine omvang van de ader maakt het moeilijk om te draaien manipuleren.
Het aantonen van de procedure met Dokter Kaori Ishiguro zal Irene Yan, een onderzoek technoloog van mijn lab. Voordat u met de procedure begint, beveiligt u de ledematen van een verdoofde muis en sluit u de 23-meter naald van een gevleugelde bloedafname aan het vrije uiteinde van een stuk spuitpompbuizen. Reinig de buikhuid van de muis met 70% ethanol en een alcoholpad en gebruik een schaar om de muis te openen van de voorste van de borst tot het bekken, waarbij u ervoor zorgt dat geen inwendige organen worden beschadigd.
Gebruik een katoenen kip applicator om de darmen voorzichtig naar de rechterkant van de buikholte te verplaatsen om de poortader en inferieure vena cava bloot te leggen en gebogen tangen te gebruiken om een draad onder de poortader te plaatsen. Bind een knoop losjes in de hechting voor te bereiden op cinching na de cannulatie en vul de canule met 40 graden Celsius HBSS totdat de oplossing de canule naaldpunt bereikt. Steek de canule in de poortader vijf tot 10 millimeter onder de ligatuur en zet de canule vast met de hechting.
Start de infusie met een één tot twee milliliter per minuut stroomsnelheid. Als de canule correct is geplaatst, zal de lever beginnen te blancheren. Snijd de inferieure vena cava en laat de overmatige vloeistof in de lever uitlekken.
Langzaam verhogen van de stroomsnelheid tot acht milliliter per minuut tot een volledige 50 milliliter HBSS is geperfundeerd door de lever in de komende vijf minuten. Net voordat de HBSS opraakt, verander vers bereide 40 graden Celsius collagenase vier oplossing voor de perfusate beker en gebruik tangen om tijdelijke druk toe te passen op de inferieure vena cava met vijf seconden intervallen om de lever te zwellen en te helpen met weefsel spijsvertering en dissociatie. Naarmate de spijsvertering vordert, zal de lever zwellen en wit worden.
Wanneer de resten depressief na zachte indringende met een katoen getipt applicator, stop de pomp en verwijder de canule. Verwijder de galblaas uit de lever, voorzichtig niet te scheuren de galblaas weefsel, en gebruik schone schaar en tangen om de lever te oogsten in een steriele 10 centimeter cultuur schotel van PBS. Na het zachte wassen, breng de lever in een nieuwe 10 centimeter cultuur schotel met verse collagenase vier oplossing en gebruik twee schone tangen om de lever te scheuren terwijl zachtjes schudden om de cellen te scheiden van het leverweefsel.
Wanneer het hele orgaan is gefragmenteerd, gebruik dan een drie milliliter spuit om het weefsel drijfmest triturate totdat de onverteerd stukken van de lever worden geschud. Giet de resulterende celoplossing door een 70 micron nylon mesh zeef in een 50 milliliter conische buis, het wassen van de schotel met HBSS om eventuele resterende cellen te verzamelen. Verpool de was met de eencellige suspensie en verwijder de hepatocyten door centrifugatie.
Breng de supernatant vervolgens over naar een nieuwe buis van 50 milliliter. Om andere cellen te verwijderen, centrifugeren de supernatant voordat overdracht in een nieuwe 50 milliliter conische buis. Verwijder de dode cellen met een andere centrifugatie en breng de supernatant in een ronde bodem buis om eventuele celpuin en aggregaten te verwijderen.
Breng nu de supernatant in een polycarbonaat ultra centrifuge buis en resuspend de pellet in ongeveer 20 milliliter PBS voor een tweede en laatste ultra centrifugatie. Dan resuspend de extracellulaire nanovesicle pellet in een milliliter PBS voor min 80 graden Celsius opslag als de vesicles niet onmiddellijk worden geanalyseerd. Van een enkele muislever levert deze methode een weefsel extracellulaire vesicleconcentratie op die varieert van 1,74 tot vier keer 10 tot de twaalfde met een gemiddelde van 3,46 keer 10 tot de twaalfde deeltjes per milliliter, zoals bepaald door nanodeeltjes tracking analyse.
De gemiddelde grootte van het geïsoleerde leverweefsel extracellulaire vesicles is 157,7 nanometer met een modus grootte van 144,5 nanometer en extracellulaire vesikels maten variërend van 100 tot 600 nanometer door nanodeeltjes tracking analyse. De extracellulaire luiers die met deze benadering geïsoleerd zijn, zijn geschikt voor downstreamtoepassingen en de verdere karakterisering kan morfologische beoordelingen door elektromicroscopie of analyse van hun oppervlaktemarkers of inhoud omvatten.
