Name: isolation of tissue extracellular vesicles from the liver
Uploaded: 2019-08-21T12:30:00
Duration: 5 s
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Cette étude a été appuyée par un financement de la Subvention CA-217833 de l'Institut national du cancer.

Toutes les études portant sur des animaux ont été réalisées conformément à un protocole qui a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de la clinique Mayo.
1. Préparation du banc
<ol><li>Préparer un bain d'eau et le mettre à 37 oC. Les autres équipements et configurations nécessaires sont indiqués à la figure 1.</li>
	<li>Mesurez 100 mg de collagène de type IV et ajoutez-le à un flacon de 125 ml contenant 100 ml de HBSS dans un bain d'eau (40 oC). Assurez-vous que le collagène a été dissous en tourbillonnant le liquide dans le flacon, et assurez-vous également que le flacon est immergé complètement dans le bain d'eau. Pour une plus grande efficacité, laisser le collagène se dissoudre pendant au moins 30 min, même s'il peut sembler se dissoudre instantanément.</li>
	<li>Immerger un flacon de 125 ml contenant 50 ml de HBSS dans un bain d'eau à 40 oC. Ceci sera utilisé pour le rinçage initial.</li>
	<li>Vaporiser la surface de tous les instruments tels que les ciseaux et les forceps avec 70% d'éthanol. Préparer quelques cotons-tiges propres.</li>
	<li>Rincer le tube de la pompe en faisant fonctionner 70 % d'éthanol à travers la pompe et enlever tout éthanol résiduel en le rinçant deux fois avec de l'eau courante.</li>
	<li>Poser un banc absorbant sur le banc du laboratoire et placer un contenant de boîte dure sur le dessus. Ceci sera nécessaire pour contenir tout excès de liquides pendant la perfusion de la souris. Enveloppez un tampon en mousse de polystyrène avec du papier d'aluminium et placez-le à l'intérieur du contenant.</li>
	<li>Déposer un plat de culture stérile de 10 cm près du banc. Ceci sera employé pour tenir le foie digéré après que la perfusion soit accomplie.</li>
	<li>Verser 10 ml de milieu de collagène (étape 1,2) dans un plat de culture stérile à l'avance.</li>
	<li>À l'aide d'un ensemble de collecte de sang ailé, connectez le calibre 23 à l'extrémité libre du tube de la pompe (couper les ailes de la canule papillon peut conduire à une meilleure manipulation). Passez jusqu'à ce que la pointe de la canule de la collecte de sang soit remplie.</li>
</ol>2. Préparation des animaux
<ol><li>Avant de commencer l'anesthésie à l'aide d'isoflurane, assurez-vous qu'une quantité suffisante de gaz d'approvisionnement est disponible pour la durée de la procédure. Allumez l'apport en oxygène (O2) de la chambre d'induction à 1-2 L, puis allumez l'isoflurane entre 2-4% à l'aide d'un débitmètre.</li>
	<li>Mettez la souris dans la chambre d'induction et fermez la porte supérieure. Surveillez la souris jusqu'à ce qu'elle soit couchée. REMARQUE : Les gaz dans la chambre maintiendront les souris anesthésiées pendant plusieurs minutes.</li>
	<li>Placez la souris sur un tampon en mousse de polystyrène enveloppé de papier d'aluminium. Passer le flux de la chambre d'induction à un cône de nez. Assurez-vous que l'anesthésie est adéquate. Si la souris a commencé à répondre, retenez-la doucement dans un cône de nez jusqu'à ce qu'elle soit entièrement anesthésiée.</li>
	<li>Assurer l'anesthésie en surveillant la respiration et la réponse à la stimulation pendant la procédure. Ajuster le débitmètre au besoin pour assurer une anesthésie adéquate. Les pattes doivent ne pas répondre au test de pincement sous anesthésie. Des détails supplémentaires peuvent être obtenus auprès du guide de laboratoire pour le soin des animaux.</li>
	<li>Tapez ou épinglez les quatre membres de la souris.</li>
	<li>Nettoyez la peau sur l'abdomen en pulvérisant 70 % d'éthanol et en l'essuyant avec de la gaze et un tampon d'alcool. Cette étape est essentielle pour éviter la contamination par la fourrure de la souris.</li>
	<li>Faire une coupe grande ouverte à travers la peau de l'antérieur à l'os du bassin à l'aide d'un ensemble de ciseaux stériles. Veillez à ne pas couper les organes internes. Déplacez les intestins sur le côté gauche de l'animal à l'aide d'un applicateur à pointe de coton pour exposer délicatement la veine du portail (PV) et le veau de véna inférieur (IVC).</li>
</ol>3. Cannulation et Perfusion (0.5 h)
<ol><li>À l'aide de forceps incurvés, placez un fil sous la veine du portail et attachez un noeud lâchement pour préparer le cinching bien après le cannulation.</li>
	<li>Insérer la canule (23G de l'ensemble de collecte de sang) dans la veine du portail 5-10 mm au-dessous de la ligature. N'insérez pas la canule au-delà de la première branche de portail, sinon le lobe antérieur droit peut être insuffisamment perfusé. La canule peut être fixée ou attachée avec du fil à l'aide d'un noeud d'arrêt.</li>
	<li>Démarrer la pompe pour infuser dans HBSS à un faible débit (1-2 mL/min). Une fois que l'annulation est confirmée pour être réussie, le foie commencera à blanchir.</li>
	<li>Couper l'IVC pour soulager la pression et laisser le liquide excessif dans le foie s'écouler. Ceci est mieux effectué en utilisant les opérateurs d'autre part de sorte que la canule n'est pas déplacé.</li>
	<li>Augmentez lentement le débit à 8 ml/min et complétez la perfusion en utilisant le volume entier de 50 ml de HBSS à travers le foie, au cours des 5 minutes suivantes.</li>
	<li>Changer le milieu contenant du collagène (étape 1.2) dans le bécher juste avant que le HBSS commence à manquer. Assurez-vous que les bulles d'air ne sont pas présentes et ne s'écoulent pas dans le foie lors du changement du milieu.</li>
	<li>Appliquer une pression transitoire sur l'IVC à 5 s intervalles en serrant avec des forceps. Cela fera gonfler le foie et aidera à la digestion des tissus et la dissociation (7-8 min). Au fur et à mesure que la digestion progresse, le foie gonflera et deviendra blanc. Le foie peut gonfler uniformément à environ deux fois sa taille d'origine.</li>
	<li>Éteignez la pompe et retirez la canule une fois la digestion terminée. L'achèvement de la digestion du foie dépendra de la taille de la souris et de l'état du foie. Une bosselure dans le foie peut être observée si un applicateur à pointe de coton est utilisé pour sonder doucement le foie.</li>
	<li>Enlever la vésicule biliaire du foie, en prenant soin de ne pas la déchirer. À l'aide d'une paire de ciseaux et de forceps lavés, extraire le foie de la souris dans un plat stérile de culture de 10 cm contenant de la saline tamponnée de phosphate (PBS) pour le lavage de surface. Transférer soigneusement le foie dans le plat stérile de culture de 10 cm contenant du milieu de collagène (à partir de l'étape 1.8). Il s'agit d'une étape critique pour éviter la contamination par le sang de souris et la bile.</li>
	<li>Saisir et déchirer le foie avec deux forceps propres tout en secouant doucement les cellules du foie. Au fur et à mesure, le milieu s'assombrit. Tous les hépatocytes peuvent être secoués, laissant derrière eux le tissu conjonctif et le tissu vasculaire.</li>
	<li>Triturate la solution cellulaire plusieurs fois à l'aide d'une seringue de 3 ml jusqu'à ce que les parties non digérées du foie soient secouées. Versez-le dans un tube conique de 50 ml avec des passoires à cellules en nylon de 70 m pour filtrer tout tissu conjonctif non digéré. Laver le plat avec HBSS pour recueillir les cellules restantes et remplir le tube conique de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeuse doucement le tube conique de 50 ml dans un rotor de seau oscillant à 50 x g pendant 10 min à 4 oC.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 ml.</li>
</ol>4. Isolement des véhicules électriques (5 h)
<ol><li>Centrifuger le supernatant à 300 x g pendant 10 min à 4 oC. Transférer le supernatant dans un nouveau tube conique de 50 ml.</li>
	<li>Centrifuger le supernatant à 2000 x g pendant 20 min à 4 oC pour enlever les débris cellulaires et les agrégats.</li>
	<li>Transférer le supernatant dans un tube à fond rond et centrifuger le supernatant à 10 000 x g pendant 70 min à 4 oC.</li>
	<li>Recueillir le supernatant et le placer dans un tube d'ultracentrifuge en polycarbonate et une centrifugeuse à 100 000 x g pendant 70 min à 4 oC.</li>
	<li>Recueillir la pastille dans un tube d'ultracentrifuge qui est ensuite lavé par la suspension à nouveau dans PBS. Centrifuger le supernatant plus loin à 100.000 x g pendant 70 min à 4 oC.</li>
	<li>Le granule final composé de nanovésicules cellulaires peut être directement utilisé pour des expériences ou re-suspendu avec 1000 L de PBS et stocké à -80 oC.</li>
</ol>5. Évaluation de la qualité et du rendement des isolements
<ol><li>Évaluer la répartition et la concentration de la taille à l'aide d'une analyse du suivi des nanoparticules ou d'une détection d'impulsions résistantes réglable suivant les protocoles du fabricant de l'instrument.</li>
	<li>Effectuer un isolement et une purification supplémentaires de populations spécifiques de vésicules par diverses approches telles que l'ajout d'un gradient ou d'un coussin de saccharose, des techniques d'immunoaffinité ou une chromatographie d'exclusion de taille, basée sur des besoins expérimentaux spécifiques.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer:+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth.">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li><li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+liver+diseases.">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li><li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture.">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole décrit une méthode optimale et reproductible pour l'isolement du tissu hépatique EV utilisant un processus de perfusion en deux étapes par l'intermédiaire de la veine de portail suivie de l'ultracentrifugation différentielle. Les étapes importantes de la procédure incluent le placement de canule, la concentration et le temps de digestion de collagène, la vitesse d'écoulement du milieu, la manipulation du tissu après la digestion, et l'ultracentrifugation différentielle classique.
La séparation cellulaire est obtenue par séparation des composants du tissu conjonctif après digestion en utilisant le type de collagène IV. La concentration de collagène utilisée pour la perfusion peut varier de 0,1 à 5 mg/ml. Il peut y avoir une variation considérable de lot à lot dans l'efficacité de la collagène pour la digestion des tissus. Des concentrations de collagène de 0,5 à 5 mg/mL ont été testées, mais la concentration utilisée n'a pas eu d'impact majeur sur le rendement des véhicules électriques obtenus. L'utilisation d'une concentration plus élevée de collagène se traduira par un gonflement plus rapide et le blanchiment du foie. L'objectif est d'obtenir une dissociation cellulaire satisfaisante sans contamination excessive ni dommage. Une concentration optimale de collagène utilisée dans ces isolements est de 1-2 mg/mL perfusé pendant 7-8 min à un débit de 8 ml/min. Une procédure de perfusion trop longue augmentera le risque de détruire le tissu conjonctif mince dans le foie ainsi que d'augmenter les risques techniques tels que le délogement d'aiguille de la veine du portail ou le piégeage de l'air avec la veine.
L'aspect le plus difficile de ce protocole est l'annulation de la veine du portail. Cela peut être difficile à réaliser, en particulier chez les souris de la taille de 18 à 25 g. Les techniques pour la perfusion de collagène ont été développées à l'origine pour une utilisation chez les rats et plus tard adoptées pour une utilisation chez la souris après de nombreuses modifications et ajustements. Cannulation à l'aide d'un ensemble de collecte de sang 23G est plus facile que le placement d'un cathéter dans les vaisseaux sanguins de petit diamètre luminal. Il est recommandé de fixer la canule à l'aide d'un nœud d'arrêt avec un noeud d'arrêt pour éviter le délogement et le noeud sert également de marqueur de l'emplacement de la veine du portail au cas où la canule se détache du navire.
Pour l'analyse en aval, il est extrêmement important d'avoir une contamination minimale des cellules. Il y a plusieurs considérations importantes dans la manipulation des tissus après digestion. Tout d'abord, les forceps et les ciseaux sont changés lorsque le foie est extrait pour éviter la contamination sanguine. Deuxièmement, il est essentiel que la vésicule biliaire soit soigneusement enlevée du foie pour éviter la déchirure et la contamination non désirée de la bile. Troisièmement, une fois que le foie a été retiré de la souris, le foie est lavé très doucement en utilisant PBS pour enlever tout sang. La réduction de la contamination par les cellules devrait être plus prioritaire que la réduction du rendement des véhicules électriques obtenus.
L'ultracentrifugation est la méthode la plus couramment utilisée pour l'isolement et la purification des véhicules électriques8,9,10,11. Cette approche éliminera la plupart des cellules parenchymales telles que les hépatocytes ou les cholangiocytes et les cellules non parenchymales telles que les cellules Kupffer, les cellules endothéliales sinusoïdales, et les cellules stellates, En outre, les débris cellulaires, les agrégations cellulaires, et les cellules mortes seront également par centrifugation différentielle. La purification et l'isolement ultérieurs des populations spécifiques peuvent être exécutés par chromatographie d'exclusion de taille pour enlever tous les agrégats ou lipoprotéines non vésiculaires de protéine.
Une limitation de ce protocole est qu'il ne peut pas capturer toutes les vésicules tissulaires, étant donné la possibilité que certaines vésicules peuvent être enlevés dans le perfusate. Si une évaluation globale est nécessaire, il convient de prendre en considération la collecte des perfusats et l'isolement des vésicules à l'intérieur du perfusat. Une autre limitation est le risque de dommages cellulaires. Pour surveiller l'impact potentiel de la mort cellulaire excessive, la viabilité cellulaire peut être surveillée et incorporée dans les paramètres de qualité pour les isolements des tissus EV. En conclusion, cette procédure décrit un flux de travail optimisé utilisant une technique de perfusion en deux étapes par l'intermédiaire de la veine de portail suivie d'ultracentrifugation différentielle pour obtenir des véhicules électriques de tissu de foie des foies de souris à un rendement élevé. Ces véhicules électriques tissulaires conviennent à des analyses en aval telles que la caractérisation de la composition biomoléculaire et d'autres études qui visent à caractériser leurs rôles physiologiques ou pathophysiologiques ou leurs applications potentielles en tant que marqueurs de maladie.

Les vésicules extracellulaires (VEV) sont des vésicules membranaires qui sont libérées de nombreux types de cellules dans le corps. Les véhicules électriques contiennent une cargaison de molécules qui comprennent l'ARN, l'ADN et les protéines. Le transfert de cette cargaison par les véhicules électriques d'une cellule à l'autre est postulé comme un mécanisme par lequel les cellules dans les tissus communiquent les uns avec les autres1. La majorité de l'information concernant la cargaison ou les rôles des véhicules électriques dans la santé normale et les maladies a été dérivée d'études sur les véhicules électriques obtenus à partir de cellules en culture ou recueillies à partir de la circulation ou d'autres fluides corporels2. Afin de comprendre leurs rôles physiologiques invivo, une méthode robuste est nécessaire pour l'isolement des véhicules électriques tissulaires qui capte toutes les populations de véhicules électriques et évite les dommages cellulaires ou la contamination3. L'objectif global de la méthode décrite ci-contre est d'isoler les véhicules électriques tissulaires des foies de souris.
La plupart des types de cellules dans le foie ont été montrés pour produire des véhicules électriques, et l'étude de la signalisation basée sur les véhicules électriques fait progresser les connaissances de base et la compréhension des maladies hépatiques. Cependant, l'impact combiné des véhicules électriques de différents types de cellules dans les tissus n'est que partiellement compris. L'isolement des véhicules électriques des tissus hépatiques est nécessaire afin de comprendre les contributions in situ des véhicules électriques dans le milieu tissulaire. L'approche décrite ci-dessus est basée sur une perfusion en deux étapes pour améliorer la dissociation des tissus et minimiser les dommages cellulaires. Par la suite, les véhicules électriques sont isolés du tissu hépatique dissocié. Des approches utilisant la perfusion en deux étapes pour l'isolement des hépatocytes ont été utilisées depuis le début des années 19504. Ces méthodes pour l'isolement d'hépatocyte ont été modifiées et continuellement améliorées et sont maintenant des approches standard pour l'isolement des hépatocytes dans les cultures, dans les suspensions de cellules, et des tissus5,6,7. Dans la première étape, le foie est soumis à une perfusion non-recirculation avec tampon sans calcium, la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS). Dans la deuxième étape, le foie est perfusé avec du collagène pour dissoudre la matrice extracellulaire pour une séparation plus poussée des jonctions cellulaires-cellulaires desmosomales. Le temps de traitement optimal pour la dissolution de collagène est de 7 à 10 minutes. Une durée plus courte du traitement causera la dissolution incomplète et maintiendra des contacts de cellules dans le foie, alors qu'une plus longue durée peut causer des dommages de foie ou la perturbation de veine de portail. Les véhicules électriques sont ensuite isolés à l'aide d'une centrifugation différentielle pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Il en résulte une collecte de véhicules électriques dans des rendements élevés qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses ou études en aval.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:168px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB500125</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Curved non-serrated scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Masking tape</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Styrofoam pad</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:168px;">Scientific inc.</td>
			<td>B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Masterflex L/S Digital Miniflex Pump</td>
			<td style="width:168px;">Cole-parmer</td>
			<td>ZX-07525-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Water bath</td>
			<td>Thermo Electron Precision</td>
			<td>2837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:432px;">Blood collection sets</td>
			<td style="width:168px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">367292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:432px;">Petri dish, clear lid 100x15</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 70mm Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Moore medical</td>
			<td>69622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">25mL Serological Pipet</td>
			<td style="width:168px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser</td>
			<td>BioSurplus</td>
			<td>203-2751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:432px;">&#160;Levo Plus Motorized Pipette Filler</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>74020002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5804R</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>22628048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>969347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B34182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JA-25.50Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Round-bottom tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Reagents</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">HyClone Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30588.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase, Type IV, powder</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tissue extracellular vesicles from the liver

Les vésicules extracellulaires (VE) peuvent être libérées de nombreux types de cellules différentes et détectées dans la plupart, sinon la totalité, des fluides corporels. Les véhicules électriques peuvent participer à la communication de cellule à cellule en fermant des molécules bioactives comme l'ARN ou la protéine d'une cellule à l'autre. La plupart des études sur les véhicules électriques ont été réalisées dans des modèles de culture cellulaire ou dans des véhicules électriques isolés des fluides corporels. On s'intéresse de plus en plus à l'isolement des véhicules électriques des tissus pour étudier leur contribution aux processus physiologiques et la façon dont ils sont modifiés dans la maladie. L'isolement des véhicules électriques avec un rendement suffisant des tissus est techniquement difficile en raison de la nécessité de dissociation des tissus sans dommages cellulaires. Cette méthode décrit une procédure pour l'isolement des véhicules électriques à partir du tissu hépatique de souris. La méthode implique un processus en deux étapes commençant par la digestion in situ de collagène suivie de l'ultra-centrifugation différentielle. La perfusion tissulaire à l'aide de collagène offre un avantage sur la coupe mécanique ou l'homogénéisation du tissu hépatique en raison de son rendement accru des véhicules électriques obtenus. L'utilisation de ce processus en deux étapes pour isoler les véhicules électriques du foie sera utile pour l'étude des véhicules électriques tissulaires.

L'appareil nécessaire à ces isolements comprend des équipements de laboratoire standard, ce qui en fait une approche relativement simple et rentable. Des isolements ont été exécutés des souris mâles et femelles de Balb/c ou de FVB de douze à trente semaines. Le plateau qui tient la souris est recouvert de papier d'aluminium à l'intérieur d'un contenant à parois dures qui recueille l'excès de liquides pendant la perfusion. Les flacons contenant du HBSS ou du milieu contenant de la collagène sont immergés dans un bain d'eau (40 oC) prêt à être utilisé. Deux plats stériles de culture de 10 cm sont utilisés. L'un est nécessaire pour le lavage de surface avec PBS, et l'autre pour la séparation des hépatocytes des composants du tissu conjonctif.
Dans cette méthode, le foie est perfused d'une manière non-continue par l'intermédiaire de la veine de portail de préférence à cannulation du cava inférieur de veine. Une approche alternative et couramment utilisée perfusion est d'effectuer la perfusion rétrograde en cannisant le cava vena inférieur et en coupant la veine du portail pour le drainage. Cependant, la veine de portail cannulation est facile d'accès et implique une courte distance au foie, car la veine de portail alimente directement dans le foie8. Le choix d'un point d'insertion pour le cannulation est crucial pour un succès optimal (Figure 2). La canule est placée au-delà des branches de l'estomac et des veines pancréatiques, mais pas au-delà de la première branche du portail (veines hépatiques droites et gauches). Une fois que l'emplacement optimal d'insertion dans la veine du portail est identifié, les forceps incurvés sont utilisés pour placer un fil sous la veine du portail et nouer un noeud lâche. L'aiguille de canule est fixée avec du fil à l'aide d'un noeud d'arrêt pour empêcher l'aiguille de tomber.
La figure 3 décrit le schéma de traitement global de la centrifugation différentielle pour l'isolement des véhicules électriques des tissus hépatiques. L'ultracentrifugation élimine les cellules, les débris et autres impuretés. Les quatre premières étapes de centrifugation (50 x g, 300 x g, 2 000 x g, 10 000 x g) sont conçues pour éliminer les hépatocytes, les autres cellules intactes, les cellules mortes ou les débris cellulaires respectivement. (Figures 4A et 4B). Après ces étapes, l'ultracentrifugation est à nouveau effectuée à 100 000 x g pour recueillir la pastille (Figure 4C). La pastille est lavée par la suspension à nouveau en PBS et soumise à une ultracentrifugation finale à 100 000 x g. Le granule après ultracentrifugation est absolument visible et viscide dans cette procédure par rapport aux véhicules électriques des médias de culture conditionnés. Pipetting plusieurs fois est nécessaire jusqu'à ce que les agrégats bruns sont hors de vue et complètement dissous. Le granule final est resuspendu avec 1000 l de PBS (Figure 4D). L'ultracentrifugation élimine les impuretés et autres contaminants solubles du plasma, ce qui peut affecter les résultats expérimentaux fonctionnels. La centrifugation est effectuée à 4 oC.
À partir du foie de souris, cette méthode donne une concentration de particules de tissu qui varie de 1,74 à 4,00 x 1012 avec une moyenne de 3,46 x 1012 particules par mL, selon l'analyse du suivi des nanoparticules (NTA) (Figure 5). La taille moyenne des véhicules électriques isolés de tissu de foie était 157.7 nm, avec une taille de mode de 144.5 nm et tailles de EV s'étendant de 100-600 nm par NTA. Le rendement de EV dépendra de facteurs tels que le poids du foie et les pertes dans les étapes de perfusate ou d'ultracentrifugation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> Figure 1 : Préparation du banc. Les matériaux et leurs emplacements sont les : (A) pompe, (B) flasque réchauffé de 125 ml contenant HBSS et port d'aspiration d'eau, cône de nez (C) relié à un vaporisateur d'Isoflurane, (D) port d'échappement d'eau de la pompe se connectant à l'aiguille, (E) plateau doublé de papier d'aluminium à l'intérieur d'un récipient fort dur, et (F) plat de culture de 10 cm dans lequel le milieu de collagène est versé à l'avance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> Figure 2 : Site Cannulation. L'anatomie de l'abdomen de la souris est montrée. À l'aide de forceps incurvés, un fil est placé sous la veine du portail (PV) et un noeud lâche est attaché. L'emplacement d'insertion est près du foie, 5-10 mm au-dessous de la ligature, mais pas au-delà de la première branche de portail (veines hépatiques gauches et droites). La canule est fixée ou attachée à l'aide d'un fil avec un noeud d'arrêt. Ce noeud sert de marqueur de l'emplacement PV si la canule est délogée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> Figure 3 : Schematic des étapes de centrifugation. L'objectif est d'éliminer les cellules indésirables et d'autres composants et d'isoler les véhicules électriques. Les quatre premières étapes de centrifugation sont conçues pour éliminer les hépatocytes et autres cellules, les cellules mortes ou les débris cellulaires à l'aide d'une centrifugation différentielle. Après ces étapes, l'ultracentrifugation est effectuée à 100 000 x g pour collecter le granule de véhicules électriques. La pastille est lavée par la suspension à nouveau en PBS et soumise à une ultracentrifugation finale à 100 000 x g. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 4 oC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> Figure 4 : Centrifugation différentielle. (A) Après centrifugation à 50 x g pendant 10 min, on observe une pastille contenant des hépatocytes. (B) Un tube à fond rond est utilisé pour la centrifugation à 10 000 x g pendant 70 min pour enlever les débris cellulaires. (C) Un tube d'ultracentrifuge en polycarbonate est utilisé pour la centrifugation à 100 000 x g pendant 70 min. La pastille est recueillie dans un tube et lavée par une suspension à nouveau avec du PBS. (D) Le granule final est resuspendu dans 1000 L de PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> Figure 5 : Résultat représentatif. La taille et la concentration des véhicules électriques des tissus hépatiques peuvent être déterminées par l'analyse du suivi des nanoparticules (ATN). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Il s'agit d'un protocole visant à isoler les vésicules extracellulaires tissulaires (VE) du foie. Le protocole décrit un processus en deux étapes impliquant la perfusion de collagène suivie de l'ultracentrifugation différentielle pour isoler les véhicules électriques du tissu hépatique.

Isolement des vésicules extracellulaires de tissu du foie

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Cette méthode peut nous aider à répondre aux questions clés concernant le rôle des vésicules extracellulaires in vivo, en nous fournissant une source de vésicules représentatives du microenvironnement tissulaire local. Les études des vésicules extracellulaires dans le milieu de tissu peuvent plus loin notre compréhension des rôles physiologiques des vésicules extracellulaires et de leurs altérations dans les processus pathophysiologiques in vivo. Une démonstration visuelle de la cannulation de veine de portail est utile car la petite taille de la veine le rend difficile à manipuler.Irene Yan, technologue de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec le Docteur Kaori Ishiguro. Avant de commencer l’intervention, fixez les membres d’une souris anesthésiée et connectez l’aiguille de calibre 23 d’une collecte de sang ailé réglée à l’extrémité libre d’un tube de pompe à seringues. Nettoyez la peau abdominale de la souris avec 70% d’éthanol et un tampon d’alcool et utilisez des ciseaux pour ouvrir la souris de l’antérieur de la poitrine à l’os pelvien, en prenant soin de ne pas endommager les organes internes.Utilisez un applicateur à pointe de coton pour déplacer doucement les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale pour exposer la veine portail et le cava vena inférieur et utiliser des forceps incurvés pour placer un fil sous la veine du portail. Attachez un nœud lâchement dans la suture pour vous préparer au cintrissage après la cannulation et remplissez la canule de 40 degrés Celsius HBSS jusqu’à ce que la solution atteigne la pointe de l’aiguille de la canule. Insérez la canule dans la veine portail de cinq à 10 millimètres sous la ligature et fixez la canule avec la suture.Démarrez l’infusion à un débit d’un à deux millilitres par minute. Si la canule a été correctement placée, le foie commencera à blanchir. Couper le cava vena inférieur et laisser le liquide excessif dans le foie à s’écouler.Augmentez lentement le débit à huit millilitres par minute jusqu’à ce qu’un plein 50 millilitres de HBSS a été perfusé à travers le foie au cours des cinq prochaines minutes. Juste avant que le HBSS s’épuise, changer fraîchement préparé 40 degrés Celsius collagène quatre solution au bécher perfusate et utiliser des forceps pour appliquer une pression transitoire sur le cava vena inférieur à cinq intervalles de seconde pour provoquer la houle du foie et d’aider à la digestion des tissus et la dissociation. Au fur et à mesure que la digestion progresse, le foie gonfle et devient blanc.Lorsque les restes sont déprimés après avoir sondé doucement à l’aide d’un applicateur à pointe de coton, arrêtez la pompe et retirez la canule. Retirer la vésicule biliaire du foie, en prenant soin de ne pas déchirer le tissu vésicule biliaire, et utiliser des ciseaux propres et des forceps pour récolter le foie dans un plat stérile de culture de 10 centimètres de PBS. Après un lavage en douceur, transférer le foie dans un nouveau plat de culture de 10 centimètres contenant quatre solutions de collagène frais et utiliser deux forceps propres pour déchirer le foie tout en secouant doucement pour dissocier les cellules du tissu hépatique.Lorsque l’organe entier a été fragmenté, utilisez une seringue de trois millilitres pour triturer le lisier des tissus jusqu’à ce que les morceaux de foie non digérés soient secoués. Versez la solution cellulaire résultante à travers une passoire en maille de nylon de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres, en lavant le plat avec HBSS pour recueillir les cellules restantes. Mettre le lavage à l’aide de la suspension à cellule unique et retirer les hépatocytes par centrifugation.Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres. Pour enlever toutes les autres cellules, centrifuger le supernatant avant de le transférer dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Enlevez les cellules mortes avec une autre centrifugation et transférez le supernatant dans un tube à fond rond pour enlever les débris cellulaires et les agrégats.Maintenant, transférez le supernatant dans un tube d’ultra centrifugeuse en polycarbonate et réutilisez la pastille dans environ 20 millilitres de PBS pour une deuxième et dernière ultra centrifugation. Puis résuspendez la pastille extracellulaire de nanovesicle dans un millilitre de PBS pour moins 80 degrés Celsius de stockage si les vésicules ne seront pas immédiatement analysées. À partir d’un seul foie de souris, cette méthode donne une concentration extracellulaire de vésicule tissulaire qui varie de 1,74 à quatre fois 10 à la douzième avec une moyenne de 3,46 fois 10 à la douzième particule par millilitre déterminée par l’analyse de suivi des nanoparticules.La taille moyenne des vésicules extracellulaires isolées de tissu de foie est 157.7 nanomètres avec une taille de mode de 144.5 nanomètres et des tailles extracellulaires de vésicules s’étendant de 100 à 600 nanomètres par analyse nanoparticle de suivi. Les vésicules extracellulaires isolées à l’aide de cette approche conviennent aux applications en aval et la caractérisation supplémentaire peut inclure des évaluations morphologiques par électromicroscopie ou l’analyse de leurs marqueurs ou contenus de surface.

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