Isolement des vésicules extracellulaires de tissu du foie

Cette méthode peut nous aider à répondre aux questions clés concernant le rôle des vésicules extracellulaires in vivo, en nous fournissant une source de vésicules représentatives du microenvironnement tissulaire local. Les études des vésicules extracellulaires dans le milieu de tissu peuvent plus loin notre compréhension des rôles physiologiques des vésicules extracellulaires et de leurs altérations dans les processus pathophysiologiques in vivo. Une démonstration visuelle de la cannulation de veine de portail est utile car la petite taille de la veine le rend difficile à manipuler.

Irene Yan, technologue de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de l’intervention avec le Docteur Kaori Ishiguro. Avant de commencer l’intervention, fixez les membres d’une souris anesthésiée et connectez l’aiguille de calibre 23 d’une collecte de sang ailé réglée à l’extrémité libre d’un tube de pompe à seringues. Nettoyez la peau abdominale de la souris avec 70% d’éthanol et un tampon d’alcool et utilisez des ciseaux pour ouvrir la souris de l’antérieur de la poitrine à l’os pelvien, en prenant soin de ne pas endommager les organes internes.

Utilisez un applicateur à pointe de coton pour déplacer doucement les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale pour exposer la veine portail et le cava vena inférieur et utiliser des forceps incurvés pour placer un fil sous la veine du portail. Attachez un nœud lâchement dans la suture pour vous préparer au cintrissage après la cannulation et remplissez la canule de 40 degrés Celsius HBSS jusqu’à ce que la solution atteigne la pointe de l’aiguille de la canule. Insérez la canule dans la veine portail de cinq à 10 millimètres sous la ligature et fixez la canule avec la suture.

Démarrez l’infusion à un débit d’un à deux millilitres par minute. Si la canule a été correctement placée, le foie commencera à blanchir. Couper le cava vena inférieur et laisser le liquide excessif dans le foie à s’écouler.

Augmentez lentement le débit à huit millilitres par minute jusqu’à ce qu’un plein 50 millilitres de HBSS a été perfusé à travers le foie au cours des cinq prochaines minutes. Juste avant que le HBSS s’épuise, changer fraîchement préparé 40 degrés Celsius collagène quatre solution au bécher perfusate et utiliser des forceps pour appliquer une pression transitoire sur le cava vena inférieur à cinq intervalles de seconde pour provoquer la houle du foie et d’aider à la digestion des tissus et la dissociation. Au fur et à mesure que la digestion progresse, le foie gonfle et devient blanc.

Lorsque les restes sont déprimés après avoir sondé doucement à l’aide d’un applicateur à pointe de coton, arrêtez la pompe et retirez la canule. Retirer la vésicule biliaire du foie, en prenant soin de ne pas déchirer le tissu vésicule biliaire, et utiliser des ciseaux propres et des forceps pour récolter le foie dans un plat stérile de culture de 10 centimètres de PBS. Après un lavage en douceur, transférer le foie dans un nouveau plat de culture de 10 centimètres contenant quatre solutions de collagène frais et utiliser deux forceps propres pour déchirer le foie tout en secouant doucement pour dissocier les cellules du tissu hépatique.

Lorsque l’organe entier a été fragmenté, utilisez une seringue de trois millilitres pour triturer le lisier des tissus jusqu’à ce que les morceaux de foie non digérés soient secoués. Versez la solution cellulaire résultante à travers une passoire en maille de nylon de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres, en lavant le plat avec HBSS pour recueillir les cellules restantes. Mettre le lavage à l’aide de la suspension à cellule unique et retirer les hépatocytes par centrifugation.

Ensuite, transférez le supernatant dans un nouveau tube de 50 millilitres. Pour enlever toutes les autres cellules, centrifuger le supernatant avant de le transférer dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Enlevez les cellules mortes avec une autre centrifugation et transférez le supernatant dans un tube à fond rond pour enlever les débris cellulaires et les agrégats.

Maintenant, transférez le supernatant dans un tube d’ultra centrifugeuse en polycarbonate et réutilisez la pastille dans environ 20 millilitres de PBS pour une deuxième et dernière ultra centrifugation. Puis résuspendez la pastille extracellulaire de nanovesicle dans un millilitre de PBS pour moins 80 degrés Celsius de stockage si les vésicules ne seront pas immédiatement analysées. À partir d’un seul foie de souris, cette méthode donne une concentration extracellulaire de vésicule tissulaire qui varie de 1,74 à quatre fois 10 à la douzième avec une moyenne de 3,46 fois 10 à la douzième particule par millilitre déterminée par l’analyse de suivi des nanoparticules.

La taille moyenne des vésicules extracellulaires isolées de tissu de foie est 157.7 nanomètres avec une taille de mode de 144.5 nanomètres et des tailles extracellulaires de vésicules s’étendant de 100 à 600 nanomètres par analyse nanoparticle de suivi. Les vésicules extracellulaires isolées à l’aide de cette approche conviennent aux applications en aval et la caractérisation supplémentaire peut inclure des évaluations morphologiques par électromicroscopie ou l’analyse de leurs marqueurs ou contenus de surface.