यह विधि हमें वीवो में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण प्रश्नों का समाधान करने में मदद कर सकती है, जिससे हमें वेसिकल्स का स्रोत प्रदान किया जा सकता है जो स्थानीय ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट के प्रतिनिधि हैं। ऊतक परिवेश के भीतर बाहुलर वेसिकल्स के अध्ययन से एक्सपेरिमेंटल वेसिकल्स की शारीरिक भूमिकाओं और वीवो में रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं में उनके परिवर्तनों की हमारी समझ आगे बढ़ सकती है। पोर्टल नस कैनुलेशन का एक दृश्य प्रदर्शन उपयोगी है क्योंकि नस के छोटे आकार से हेरफेर करना मुश्किल हो जाता है।
डॉक्टर काओरी इशिगुरो के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन आइरीन यान, मेरी प्रयोगशाला से एक शोध प्रौद्योगिकीविद् होंगे। प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक एनेस्थेटाइज्ड माउस के अंगों को सुरक्षित करें और सिरिंज पंप ट्यूबिंग के एक टुकड़े के मुक्त अंत में सेट किए गए पंखों वाले रक्त संग्रह की 23 गेज सुई को कनेक्ट करें। माउस की पेट की त्वचा को 70% इथेनॉल और अल्कोहल पैड से साफ करें और छाती के पूर्वकाल से श्रोणि हड्डी तक माउस खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें, किसी भी आंतरिक अंगों को नुकसान न पहुंचाने का ख्याल रखें।
पोर्टल नस और अवर वेना कावा का पर्दाफाश करने के लिए आंतों को पेट की गुहा के दाईं ओर ले जाने के लिए एक कपास इत्तला दी एप्लिकेटर का उपयोग करें और पोर्टल नस के नीचे एक धागा रखने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। कैनुलेशन के बाद सिंचिंग के लिए तैयार करने के लिए सीवन में एक गाँठ को ढीला बांधें और कैनुला को 40 डिग्री सेल्सियस एचबीबीएस के साथ तब तक भरें जब तक कि समाधान कैनुला सुई टिप तक न पहुंच जाए। पोर्टल नस में कैनुला डालें लिगेचर के नीचे पांच से 10 मिलीमीटर और सीवन के साथ कैनुला सुरक्षित।
एक से दो मिलीलीटर प्रति मिनट प्रवाह दर पर जलसेक शुरू करें। यदि कैनुला को सही ढंग से रखा गया था, तो यकृत ब्लैंच करना शुरू कर देगा। अवर वेना कावा काटें और जिगर के भीतर अत्यधिक तरल पदार्थ को छानने दें।
धीरे से प्रति मिनट आठ मिलीलीटर के लिए प्रवाह की दर में वृद्धि जब तक HBSS के एक पूर्ण ५० मिलीलीटर अगले पांच मिनट से अधिक जिगर के माध्यम से perfused किया गया है । एचबीएसएस के बाहर चलने से ठीक पहले, ताजा तैयार 40 डिग्री सेल्सियस कोलेजनेज़ चार समाधान को परफ्यूज़ेट बीकर में बदलें और पांच सेकंड के अंतराल पर अवर वेना कावा के लिए क्षणिक दबाव लागू करने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि यकृत प्रफुल्लित हो सके और ऊतक पाचन और विघटन में मदद मिल सके। जैसे-जैसे पाचन आगे बढ़ेगा, यकृत प्रफुल्लित हो जाएगा और सफेद हो जाएगा।
जब एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ कोमल जांच के बाद उदास रहता है, पंप बंद करो और cannula हटा दें । जिगर से पित्ताशय की थैली निकालें, पित्ताशय की थैली ऊतक आंसू नहीं सावधान किया जा रहा है, और साफ कैंची और संदंश का उपयोग करने के लिए PBS के एक बाँझ 10 सेंटीमीटर संस्कृति पकवान में जिगर फसल । कोमल धोने के बाद, जिगर को एक नए 10 सेंटीमीटर संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें ताजा कोलेजन चार समाधान होते हैं और यकृत को फाड़ने के लिए दो साफ संदंश का उपयोग करते हैं, जबकि धीरे-धीरे जिगर के ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए मिलाते हैं।
जब पूरे अंग खंडित हो गए हों, तो ऊतक घोल को त्रिकोणीय बनाने के लिए तीन मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें जब तक कि जिगर के अपाच्य टुकड़े हिल न जाएं। एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल छलनी के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप सेल समाधान डालो, किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए HBSS के साथ पकवान धोने। सिंगल सेल सस्पेंशन के साथ वॉश पूल करें और सेंट्रलाइज करके हेपेटोसाइट्स को हटा दें।
फिर सुपरनेट को एक नई 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। किसी भी अन्य कोशिकाओं को हटाने के लिए, एक नए 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले सुपरनेट को अपकेंद्री करें। मृत कोशिकाओं को एक और अपकेंद्री के साथ निकालें और किसी भी कोशिका मलबे और समुच्चय को हटाने के लिए सुपरनिटेंट को गोल तली ट्यूब में स्थानांतरित करें।
अब सुपरनेट को पॉलीकार्बोनेट अल्ट्रा सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और एक दूसरे और अंतिम अल्ट्रा सेंट्रलाइजेशन के लिए पीबीएस के लगभग 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। फिर यदि वेसिकल्स का तुरंत विश्लेषण नहीं किया जाएगा तो शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए पीबीएस के एक मिलीलीटर में बाहुलीय नैनोवेसिकल गोली को फिर से खर्च करें। एक माउस जिगर से, इस विधि एक ऊतक बाह्य एकल वेसिकल एकाग्रता है कि १.७४ से चार बार 10 से बारहवीं के लिए ३.४६ बार 10 के एक मतलब के साथ बारहवें कणों प्रति मिलीलीटर के रूप में नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित पैदावार ।
अलग-थलग पड़े लिवर टिश्यू एक्सपेरिमेंट वेसिकल्स का मतलब आकार नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग एनालिसिस द्वारा 100 से 600 नैनोमीटर तक के 144.5 नैनोमीटर और एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स साइज के मोड साइज के साथ 157.7 नैनोमीटर है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके अलग-थलग किए गए एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं और आगे के लक्षण वर्णन में इलेक्ट्रोमाइक्रोस्कोपी या उनकी सतह मार्कर या सामग्री के विश्लेषण द्वारा रूपात्मक आकलन शामिल हो सकते हैं।
