Name: isolation of tissue extracellular vesicles from the liver
Uploaded: 2019-08-21T12:30:00
Duration: 5 s
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इस अध्ययन राष्ट्रीय कैंसर संस्थान अनुदान सीए-217833 से धन द्वारा समर्थित किया गया था.

जानवरों से जुड़े सभी अध्ययन मेयो क्लिनिक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था कि एक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया.
1. बेंच तैयारी
<ol><li>एक पानी स्नान तैयार है और यह 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट. अन्य आवश्यक उपकरण और व्यवस्था चित्र 1में दर्शाए गए हैं।</li>
	<li>कोलेजाइना प्रकार IV के 100 मिलीग्राम को मापें और इसे एक 125 एमएल फ्लास्क में जोड़ें जिसमें 100 एमएल एचबीएस एस एच बी एस के पानी के स्नान (40 डिग्री सेल्सियस) में शामिल हैं। सुनिश्चित करें कि कोलाजनेस फ्लास्क में तरल घूमता द्वारा भंग कर दिया गया है, और यह भी सुनिश्चित करें कि फ्लास्क पूरी तरह से पानी के स्नान में डूब गया है। अधिक से अधिक दक्षता के लिए, कोलैनाज़ को कम से कम 30 मिनट के लिए भंग करने की अनुमति दें, भले ही यह तुरंत भंग हो सकता है।</li>
	<li>40 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में एचबीएसएस के 50 एमएल युक्त 125 एमएल फ्लास्क को जलमग्न करें। यह प्रारंभिक फ्लशिंग के लिए उपयोग किया जाएगा।</li>
	<li>इस तरह के कैंची और 70% इथेनॉल के साथ forceps के रूप में सभी उपकरणों की सतह नीचे स्प्रे। कुछ साफ कपास swabs तैयार करें.</li>
	<li>पंप के माध्यम से 70% इथेनॉल चलाने के द्वारा पंप के ट्यूबिंग बाहर कुल्ला और यह दो बार चल रहे पानी के साथ rinsing द्वारा किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल को हटा दें।</li>
	<li>प्रयोगशाला बेंच पर एक शोषक बेंच पैड रखना और शीर्ष पर एक हार्ड बॉक्स कंटेनर जगह है। यह माउस भ्रम के दौरान किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को रोकने के लिए आवश्यक हो जाएगा. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक polystyrene फोम पैड लपेटें और कंटेनर के अंदर जगह है.</li>
	<li>बेंच के पास एक बाँझ 10 सेमी संस्कृति पकवान रखें। यह अपफ्यूजन पूरा होने के बाद पचा जिगर पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।</li>
	<li>पहले से एक बाँझ संस्कृति पकवान में collagenase मध्यम (कदम 1.2) के 10 एमएल डालो.</li>
	<li>एक पंखों वाला रक्त संग्रह सेट का उपयोग करना, पंप ट्यूबिंग के मुक्त अंत करने के लिए 23 गेज कनेक्ट (बटरफ्लाई कैनुला बंद पंखों को काटने बेहतर हैंडलिंग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं)। रक्त संग्रह के कैनुला की नोक तक पास नहीं हो जाता है।</li>
</ol>2. पशु तैयारी
<ol><li>आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके संज्ञाहरण शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि प्रक्रिया की अवधि के लिए पर्याप्त मात्रा में आपूर्ति गैस उपलब्ध है। 1-2 ल पर प्रेरण कक्ष को ऑक्सीजन (ओ2) की आपूर्ति चालू करें, फिर प्रवाहमापी का उपयोग करके 2-4% के बीच isoflurane चालू करें।</li>
	<li>माउस को प्रेरण कक्ष में रखें और शीर्ष दरवाजा बंद करें। माउस की निगरानी करें जब तक कि यह recumbent है. नोट: कक्ष में गैसों चूहों कई मिनट के लिए anesthetized रखेंगे.</li>
	<li>एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लिपटे एक polystyrene फोम पैड पर माउस प्लेस. प्रेरण कक्ष से प्रवाह को एक नाककोन में स्विच करें। यह सुनिश्चित करें कि संज्ञाहरण पर्याप्त है। यदि माउस ने जवाब देना शुरू कर दिया है, तो इसे नाक शंकु में तब तक रोकें जब तक कि यह पूरी तरह से एनेस्थेट नहीं हो जाता।</li>
	<li>प्रक्रिया के दौरान श्वसन और उत्तेजना के लिए प्रतिक्रिया की निगरानी के द्वारा संज्ञाहरण सुनिश्चित करें। पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में दर flowmeter समायोजित करें. पंजे संज्ञाहरण के तहत चुटकी परीक्षण करने के लिए गैर-जिम्मेदार होना चाहिए। पशुओं की देखभाल के लिए प्रयोगशाला गाइड से अतिरिक्त विवरण प्राप्त किया जा सकता है।</li>
	<li>माउस के सभी चार अंगों को टेप करें या पिन करें।</li>
	<li>70% इथेनॉल के साथ छिड़काव और धुंध और एक शराब पैड के साथ इसे बंद पोंछते द्वारा पेट पर त्वचा को साफ करें। यह चरण माउस फर से संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।</li>
	<li>बाँझ कैंची का एक सेट का उपयोग कर श्रोणि हड्डी के लिए पूर्वकाल से त्वचा के माध्यम से एक व्यापक खुला कटौती करें। किसी भी आंतरिक अंग को काटने के लिए सावधान रहें . पोर्टल नस (पीवी) और अवर वेना कैवा (आईवीसी) को बेनकाब करने के लिए धीरे से एक कपास टिप applicator का उपयोग करके जानवर की बाईं ओर आंतों को विस्थापित करें।</li>
</ol>3. कैनुलेशन और भ्रम (0.5 ज)
<ol><li>घुमावदार संदंश का उपयोग करके, पोर्टल नस के नीचे एक धागा रखें और कैनुलेशन के बाद कसकर cinching तैयार करने के लिए एक गाँठ ढीला टाई।</li>
	<li>लिगेचर के नीचे पोर्टल नस 5-10 मिमी में कैनुला (रक्त संग्रह सेट से 23 जी) डालें। पहले पोर्टल शाखा के पिछले कैनुला न डालें, अन्यथा सही पूर्वकाल पालि अपर्याप्त रूप से उपयोग किया जा सकता है। कैनुला को एक डाट गाँठ का उपयोग करके धागे के साथ ठीक किया जा सकता है या बांधा जा सकता है।</li>
	<li>एक कम प्रवाह दर (1-2 एमएल/मिनट) पर HBSS में डालने के लिए पंप शुरू करें। एक बार कैनुलेशन सफल होने की पुष्टि की है, जिगर ब्लैंच करने के लिए शुरू हो जाएगा.</li>
	<li>दबाव को दूर करने और जिगर के भीतर अत्यधिक तरल पदार्थ नाली के लिए अनुमति देने के लिए आईवीसी कट. यह सबसे अच्छा ऑपरेटरों दूसरे हाथ का उपयोग कर किया जाता है तो cannula नहीं ले जाया जाता है.</li>
	<li>धीरे-धीरे प्रवाह दर को 8 एमएल/मिनट तक बढ़ाएं और अगले 5 मिनट से अधिक एचबीएसएस के पूरे 50 एमएल वॉल्यूम का उपयोग करके भ्रम को पूरा करें।</li>
	<li>HBSS बाहर चलाने के लिए शुरू कर रहा है बस से पहले मध्यम (चरण 1.2) बीकर में युक्त collagenase बदलें. सुनिश्चित करें कि हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं और मध्यम बदलते समय जिगर में प्रवाह नहीं करते हैं।</li>
	<li>संदंश के साथ clamping द्वारा 5 s अंतराल पर आईवीसी के लिए क्षणिक दबाव लागू करें। यह जिगर प्रफुल्लित करने के लिए और ऊतक पाचन और वियोजन (7-8 मिनट) के साथ मदद करने के लिए कारण होगा। पाचन प्रगति के रूप में, जिगर प्रफुल्लित और सफेद हो जाएगा. जिगर समान रूप से लगभग दो बार अपने मूल आकार के लिए प्रफुल्लित कर सकते हैं.</li>
	<li>पंप बंद करें और कैनुला को एक बार पाचन पूरा हो जाने पर निकालें। जिगर पाचन के पूरा होने माउस और जिगर की स्थिति के आकार पर निर्भर करेगा. जिगर में एक दांत देखा जा सकता है अगर एक कपास से फट applicator धीरे जिगर की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है.</li>
	<li>जिगर से पित्ताशय की थैली निकालें, यह आंसू नहीं सावधान किया जा रहा है. कैंची और संदंश की एक धोया जोड़ी का उपयोग करना, सतह धोने के लिए फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) युक्त एक बाँझ 10 सेमी संस्कृति पकवान में माउस से जिगर निकालने। जिगर को ध्यान से बाँझ 10 सेमी संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें कोलैडेज़ माध्यम (चरण 1.8 से) होता है। यह माउस रक्त और पित्त से संदूषण से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।</li>
	<li>पकड़ो और दो साफ forceps के साथ जिगर के अलावा आंसू जबकि धीरे जिगर से कोशिकाओं मिलाते हुए. जैसा कि होता है, माध्यम बादल हो जाएगा. सभी hepatocytes दूर हिल जा सकता है, संयोजी ऊतक और संवहनी ऊतक के पीछे छोड़ने.</li>
	<li>एक 3 एमएल सिरिंज का उपयोग कर सेल समाधान कई बार Triturate जब तक जिगर के अपाच्य भागों से हिल रहे हैं. किसी भी अपाच्य संयोजी ऊतक को फ़िल्टर करने के लिए 70 मीटर नायलॉन सेल फ़िल्टर्स के साथ 50 एमएल शंकु ट्यूब में इसे डालें। शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 50 एमएल शंकु ट्यूब को भरने के लिए HBSS के साथ पकवान धो लें।</li>
	<li>सेंट्रीफ्यूज धीरे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 50 x ग्राम पर एक झूलते बाल्टी रोटर में 50 एमएल शंकु ट्यूब।</li>
	<li>सुपरनेटेंट को एक नई 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।</li>
</ol>4. EVs के अलगाव (5 ज)
<ol><li>4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर supernatant सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को एक नई 50 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>सेल मलबे और समुच्चय को हटाने के लिए 20 मिनट पर 20 मिनट के लिए सुपरनेटकोज।</li>
	<li>सुपरनेंट को एक गोल-नीचे ट्यूब पर स्थानांतरित करें और सुपरनेटेंट को 70 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें।</li>
	<li>सुपरनेटेंट लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर एक पॉलीकार्बोनेट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब और अपकेंद्रित्र में रखें।</li>
	<li>एक ultracentrifuge ट्यूब में गोली ले लीजिए जो तो पीबीएस में फिर से निलंबित द्वारा धोया जाता है. 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर आगे supernatant सेंट्रीफ्यूज।</li>
	<li>सेलुलर नैनोवेसिकल्स से युक्त अंतिम गोली का उपयोग सीधे प्रयोगों के लिए किया जा सकता है या पीबीएस के 1000 डिग्री सेल्सियस के साथ फिर से निलंबित किया जा सकता है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।</li>
</ol>5. अलगाव की गुणवत्ता और उपज का आकलन
<ol><li>साधन निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण या टूनाबल प्रतिरोधक पल्स संवेदन का उपयोग कर आकार वितरण और एकाग्रता का आकलन करें।</li>
	<li>विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर सुक्रोज ग्रेडिएंट या कुशन, इम्यूनोएफ़िनिटी तकनीक, या आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी के अलावा विभिन्न तरीकों से विशिष्ट आशय की आबादी का और अधिक अलगाव और शुद्धि करें।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer:+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth.">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li><li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+liver+diseases.">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li><li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture.">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

इस प्रोटोकॉल में यकृत ऊतक EV के अलगाव के लिए एक इष्टतम और पुन: प्रोड्यूसकरनेयोग्य विधि का वर्णन किया गया है, जो पोर्टल नस के माध्यम से द्वि-चरणीय भ्रम प्रक्रिया का उपयोग करता है जिसके बाद अंतर ultracentrifugation होता है। प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों में कैनुला प्लेसमेंट, कोलाजनेस एकाग्रता और पाचन समय, माध्यम के प्रवाह की गति, पाचन के बाद ऊतक की हैंडलिंग, और शास्त्रीय अंतर ultracentrifugation शामिल हैं।
कोशिका जुदाई कोलैजास प्रकार IV का उपयोग कर पाचन के बाद संयोजी ऊतक घटकों से जुदाई द्वारा हासिल की है। परफ्यूजन के लिए उपयोग किए जाने वाले कोलैडेस की सांद्रता 0.1 से 5 मिलीग्राम/एमएल तक हो सकती है। ऊतक पाचन के लिए कोलैजानेस की प्रभावकारिता में काफी बैच-टू-बैच भिन्नता हो सकती है। 0.5 से 5 मिलीग्राम/एमएल तक कोलैडेंस की सांद्रता का परीक्षण किया गया था, लेकिन उपयोग की गई सांद्रता का प्राप्त ईवीएस की उपज पर कोई बड़ा प्रभाव नहीं पड़ा। कोलैनासेस की एक उच्च एकाग्रता का उपयोग एक और अधिक तेजी से सूजन और जिगर की सफेदी में परिणाम होगा. लक्ष्य अत्यधिक संदूषण या क्षति के बिना संतोषजनक सेल वियोजन प्राप्त करने के लिए है। इन आइसोलेशन में प्रयोग किए जाने वाले कोलैडेज का इष्टतम सांद्रता 8 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर 7-8 मिनट के लिए 1-2 मिलीग्राम/एमएल है। एक भ्रम प्रक्रिया है कि बहुत लंबा है जिगर के भीतर पतली संयोजी ऊतक को नष्ट करने के जोखिम में वृद्धि के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस तरह के पोर्टल नस या नस के साथ हवा फँसाने से सुई dislodgment के रूप में तकनीकी जोखिम में वृद्धि होगी.
इस प्रोटोकॉल का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू पोर्टल नस का कैनुलेशन है। यह प्रदर्शन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से चूहों में 18 से 25-जी आकार की सीमा. कोलैजानेस परफ्यूजन के लिए तकनीक मूल रूप से चूहों में उपयोग के लिए विकसित की गई थी और बाद में कई संशोधनों और समायोजनों के बाद चूहों में उपयोग के लिए अपनाया गया था। एक 23G रक्त संग्रह सेट का उपयोग कर Cannulation छोटे luminal व्यास के रक्त वाहिकाओं में एक कैथेटर की नियुक्ति की तुलना में आसान है. एक डाट गाँठ के साथ धागे का उपयोग कर cannula फिक्सिंग dislodgement से बचने के लिए सिफारिश की है और गाँठ भी पोर्टल नस स्थान के एक मार्कर के रूप में कार्य करता है मामले में cannula पोत से आता है.
डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं से न्यूनतम संदूषण होना अत्यंत महत्वपूर्ण है। पाचन के बाद ऊतक की हैंडलिंग में कई महत्वपूर्ण विचार हैं। सबसे पहले, जब जिगर रक्त संदूषण से बचने के लिए निकाला जाता है, तो संदंश और कैंची बदल रहे हैं। दूसरा, यह महत्वपूर्ण है कि पित्ताशय की थैली को पित्त से फाड़और अवांछित संदूषण से बचने के लिए यकृत से सावधानी से हटाया जाए। तीसरा, एक बार जिगर माउस से हटा दिया गया है, जिगर बहुत धीरे PBS का उपयोग कर किसी भी रक्त को दूर धोया जाता है. कोशिकाओं के साथ संदूषण को कम करने से प्राप्त ईवीएस की उपज में कमी की तुलना में उच्च प्राथमिकता दी जानी चाहिए।
ईवीएस8,9,10,11के अलगाव और शुद्धि के लिए अल्ट्रासेंट्रीफेशन सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है . इस दृष्टिकोण इस तरह के hepatocytes या cholangiocytes और ऐसे Kupffer कोशिकाओं के रूप में गैर parenchymal कोशिकाओं के रूप में सबसे parenchymal कोशिकाओं को दूर करेगा, sinusoidal endothelial कोशिकाओं, और स्टेलेट कोशिकाओं, इसके अलावा, सेल मलबे, सेल समुच्चय, और मृत कोशिकाओं को भी हो जाएगा अंतर centrifugation द्वारा हटा दिया. इसके अलावा शुद्धि और विशिष्ट आबादी के अलगाव आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा किसी भी गैर vesicular प्रोटीन समुच्चय या लिपोप्रोटीन को दूर करने के लिए किया जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि यह सभी ऊतक vesicles पर कब्जा नहीं हो सकता है, संभावना है कि कुछ vesicles perfusate में हटाया जा सकता है दिया. यदि एक वैश्विक मूल्यांकन की जरूरत है, perfusate और perfusate के भीतर vesicles के अलगाव के संग्रह पर विचार किया जाना चाहिए. एक और सीमा सेल क्षति के लिए संभावित है. अत्यधिक सेल मौत के संभावित प्रभाव पर नजर रखने के लिए, सेल व्यवहार्यता पर नजर रखी जा सकती है और ऊतक EV अलगाव के लिए गुणवत्ता मानकों के भीतर शामिल किया जा सकता है. अंत में, इस प्रक्रिया को एक अनुकूलित कार्यप्रवाह पोर्टल नस के माध्यम से एक दो कदम perfusion तकनीक का उपयोग कर एक उच्च उपज पर माउस जिगर से जिगर ऊतक EVs प्राप्त करने के लिए अंतर ultracentrifugation द्वारा पीछा किया वर्णन करता है. ये ऊतक ईवीएस डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं जैसे जैव-अणुक संरचना की विशेषता और अन्य अध्ययन जिनका उद्देश्य रोग मार्कर के रूप में उनकी शारीरिक या पैथोफिजियोलॉजिकल भूमिकाओं या संभावित अनुप्रयोगों की विशेषता है।

extracellular vesicles (EVs) झिल्ली बाध्य vesicles कि शरीर में कोशिकाओं के कई अलग अलग प्रकार से जारी कर रहे हैं. ईवीएस में अणुओं का एक कार्गो होता है जिसमें आरएनए, डीएनए और प्रोटीन शामिल होते हैं। ईवीएस द्वारा इस माल का एक सेल से दूसरे को अंतरण एक तंत्र के रूप में अभिगृहीत किया जाता है जिसके द्वारा ऊतकों के भीतर की कोशिकाएं एक दूसरे के साथ संवाद करते हैं1. सामान्य स्वास्थ्य और रोगों में ईवीएस के कार्गो या भूमिकाओं के बारे में अधिकांश जानकारी संस्कृति में कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस पर अध्ययन से प्राप्त की गई है या परिसंचरण या शरीर के अन्य तरल पदार्थ2से एकत्र की गई है . विवो मेंउनकी शारीरिक भूमिकाओं को समझने के लिए , ऊतक ईवीएस के अलगाव के लिए एक मजबूत विधि आवश्यक है जो ईवीएस की सभी आबादी को कैप्चर करती है और सेलुलर क्षति या संदूषण3से बचाती है . यहाँ वर्णित विधि का समग्र लक्ष्य माउस जिगर से ऊतक EVs को अलग करने के लिए है.
जिगर में अधिकांश सेल प्रकार EVs का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, और EV आधारित संकेतन के अध्ययन के बुनियादी ज्ञान और यकृत रोगों की समझ को आगे बढ़ रहा है. हालांकि, ऊतकों के भीतर विभिन्न कोशिका प्रकारों से EVs के संयुक्त प्रभाव केवल आंशिक रूप से समझा जाता है. जिगर के ऊतकों से EVs के अलगाव के लिए ऊतक वातावरण के भीतर EVs के insitu योगदान को समझने के लिए आवश्यक है. यहाँ वर्णित दृष्टिकोण ऊतक वियोजन को बढ़ाने और सेल क्षति को कम करने के लिए एक दो कदम perfusion पर आधारित है. बाद में, EVs अलग जिगर ऊतक से अलग कर रहे हैं. hepatocytes के अलगाव के लिए दो कदम perfusion का उपयोग दृष्टिकोण 1950 के दशकके शुरूसे 4 के बाद से इस्तेमाल किया गया है . हेपेटोसाइट अलगाव के लिए इन तरीकों को संशोधित किया गया है और लगातार सुधार किया गया है और अब संस्कृतियों में हेपाटोसाइट्स के अलगाव के लिए मानक दृष्टिकोण हैं, सेल निलंबन में, और ऊतकों से5,6,7. पहले चरण में, जिगर कैल्शियम मुक्त बफर, हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ एक गैर-पुनर्संचार भ्रम के अधीन है। दूसरे चरण में, जिगर कोलाजनेस के साथ perfused है desmosomal सेल से सेल जंक्शनों के आगे जुदाई के लिए extracellular मैट्रिक्स भंग करने के लिए. कोलैजानेस विघटन के लिए एक इष्टतम उपचार समय 7 से 10 मिनट है। उपचार की एक छोटी अवधि अपूर्ण विघटन का कारण होगा और जिगर में सेल संपर्कों को बनाए रखने, जबकि एक लंबी अवधि जिगर की क्षति या पोर्टल नस व्यवधान का कारण बन सकता है. EVs तो अलग कर रहे हैं अलग अलग अलग कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को दूर करने के लिए अंतर centrifugation का उपयोग कर. यह उच्च पैदावार है कि आगे बहाव विश्लेषण या अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में EV संग्रह में परिणाम है.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:168px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB500125</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Curved non-serrated scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Masking tape</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Styrofoam pad</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:168px;">Scientific inc.</td>
			<td>B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Masterflex L/S Digital Miniflex Pump</td>
			<td style="width:168px;">Cole-parmer</td>
			<td>ZX-07525-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Water bath</td>
			<td>Thermo Electron Precision</td>
			<td>2837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:432px;">Blood collection sets</td>
			<td style="width:168px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">367292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:432px;">Petri dish, clear lid 100x15</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 70mm Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Moore medical</td>
			<td>69622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">25mL Serological Pipet</td>
			<td style="width:168px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser</td>
			<td>BioSurplus</td>
			<td>203-2751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:432px;">&#160;Levo Plus Motorized Pipette Filler</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>74020002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5804R</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>22628048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>969347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B34182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JA-25.50Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Round-bottom tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Reagents</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">HyClone Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30588.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase, Type IV, powder</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tissue extracellular vesicles from the liver

extracellular vesicles (EVs) कई अलग अलग सेल प्रकार से जारी किया जा सकता है और सबसे में पता चला, नहीं तो सभी, शरीर के तरल पदार्थ. ईवीएस जैव सक्रिय अणुओं जैसे आरएनए या प्रोटीन को एक सेल से दूसरे में बंद करके सेल-टू-सेल संचार में भाग ले सकते हैं। EVs के अधिकांश अध्ययन सेल संस्कृति मॉडल में या शरीर के तरल पदार्थ से अलग EVs में प्रदर्शन किया गया है. शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए उनके योगदान का अध्ययन करने के लिए ऊतकों से ईवीएस के अलगाव में रुचि उभर रही है और कैसे वे रोग में बदल रहे हैं। ऊतकों से पर्याप्त उपज के साथ EVs के अलगाव सेलुलर क्षति के बिना ऊतक वियोजन की आवश्यकता की वजह से तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है. इस विधि माउस जिगर ऊतक से EVs के अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है. विधि एक दो कदम प्रक्रिया situ collagenase पाचन में अंतर अल्ट्रा-centrifugation द्वारा पीछा के साथ शुरू शामिल है. कोलैजेनस का उपयोग कर ऊतक perfusion प्राप्त EVs की अपनी वृद्धि हुई उपज के कारण यांत्रिक काटने या जिगर के ऊतकों के homogenization पर एक लाभ प्रदान करता है। जिगर से EVs को अलग करने के लिए इस दो कदम प्रक्रिया का उपयोग ऊतक EVs के अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा.

इन अलगावों के लिए आवश्यक उपकरण मानक प्रयोगशाला उपकरण ों की शामिल है, यह एक अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण बना रही है. अलगाव बारह से तीस सप्ताह पुराने पुरुष और महिला Balb/c या FVB चूहों से किया गया है. माउस पकड़े ट्रे एक हार्ड दीवारों कंटेनर है कि भ्रम के दौरान अतिरिक्त तरल पदार्थ एकत्र अंदर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लाइन में खड़ा है. HBSS या कोलाजनेस युक्त फ्लास्क युक्त एक पानी के स्नान में डूब रहे हैं (40 डिग्री सेल्सियस) इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार. दो बाँझ 10 सेमी संस्कृति व्यंजनों का उपयोग किया जाता है. एक पीबीएस के साथ सतह धोने के लिए आवश्यक है, और संयोजी ऊतक घटकों से hepatocyte जुदाई के लिए अन्य.
इस विधि में, जिगर एक गैर निरंतर तरीके से पोर्टल नस के माध्यम से वरीयता में अवर वेना cava से cannulation के लिए perfused है. एक विकल्प और आमतौर पर इस्तेमाल किया perfusion दृष्टिकोण अवर वेना cava canulating और जल निकासी के लिए पोर्टल नस काटने द्वारा प्रतिगामी भ्रम प्रदर्शन करने के लिए है। हालांकि, पोर्टल नस cannulation का उपयोग करने के लिए आसान है और जिगर के लिए एक छोटी दूरी शामिल है, के रूप में पोर्टल नस जिगर8में सीधे खिलाती है. कैनुलेशन के लिए एक सम्मिलन बिंदु का चयन इष्टतम सफलता के लिए महत्वपूर्ण है (चित्र 2)। कैनुला पेट और अग्नाशयी नसों की शाखाओं पिछले रखा गया है, लेकिन पहले पोर्टल शाखा से परे नहीं (दाएं और बाएं यकृत पोर्टल नसों). एक बार पोर्टल नस में इष्टतम प्रविष्टि स्थान की पहचान की है, घुमावदार forceps पोर्टल नस के नीचे एक धागा जगह और एक ढीला गाँठ टाई करने के लिए उपयोग किया जाता है. कैनुला की सुई बाहर गिरने से सुई को रोकने के लिए एक डाट गाँठ का उपयोग कर धागे के साथ तय की है।
चित्र 3 जिगर ऊतक EVs अलगाव के लिए अंतर centrifugation के लिए समग्र प्रसंस्करण योजना की रूपरेखा. Ultracentrifugation कोशिकाओं, मलबे और अन्य अशुद्धियों को हटा. पहले चार centrifugation कदम (50 x g, 300 x g, 2,000 x g, 10,000 x g) hepatocytes, बरकरार अन्य कोशिकाओं, मृत कोशिकाओं, या सेल मलबे को दूर करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं क्रमशः. (चित्र 4A और 4B)। इन चरणों के बाद, अल्ट्रासेन्रिफ्यूगेशन को गोली एकत्र करने के लिए 100,000 x g पर फिर से किया जाता है (चित्र 4ब्) । गोली पीबीएस में फिर से निलंबित द्वारा धोया जाता है और 100,000 x जी पर एक अंतिम ultracentrifugation के अधीन. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन के बाद गोली बिल्कुल दिखाई देती है और इस प्रक्रिया में वातानुकूलित संस्कृति मीडिया से ईवीएस की तुलना में चिपचिपा है। किसी भी भूरे रंग के समुच्चय दृष्टि से बाहर हैं और पूरी तरह से भंग कर रहे हैं जब तक कई बार पाइपिंग की आवश्यकता है। अंतिम गोली पीबीएस के 1000 डिग्री सेल्सियस के साथ फिर से निलंबित कर दी जाती है (चित्र 4डी) । Ultracentrifugation प्लाज्मा से अशुद्धियों और अन्य घुलनशील contaminants को हटा, जो कार्यात्मक प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं. अपकेंद्रण 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है।
माउस जिगर से, इस विधि एक ऊतक EV एकाग्रता है कि 1.74 से 4.00 x 1012 के एक मतलब के साथ 3.46 x 1012 कणों प्रति एमएल के रूप में नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) द्वारा निर्धारित के साथ पर्वतमाला पैदावार (चित्र5). अलग जिगर ऊतक EVs का मतलब आकार 157.7 एनएम था, 144.5 एनएम और एनटीए द्वारा 100-600 एनएम से लेकर EV आकार के एक मोड आकार के साथ. EV की उपज ऐसे जिगर वजन और perfusate या ultracentrifugation कदम के भीतर नुकसान के रूप में कारकों पर निर्भर करेगा.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> चित्र 1 : बेंच की तैयारी. सामग्री और उनके स्थान हैं: (ए) पंप, (बी) HBSS और पानी चूषण बंदरगाह युक्त 125 एमएल फ्लास्क गर्म, (सी) नाक शंकु एक Isoflurane vaporizer से जुड़ा, (डी) सुई के साथ जोड़ने पंप के पानी निकास बंदरगाह, (ई) एक के अंदर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लाइन में खड़ा ट्रे हार्ड दीवारों कंटेनर, और (एफ) 10 सेमी संस्कृति पकवान जिसमें collagenase माध्यम अग्रिम में डाला जाता है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> चित्र 2 : कैनुलेशन साइट. माउस पेट की शरीर रचना दिखाया गया है. घुमावदार संदंश का उपयोग करके, एक धागा पोर्टल नस (पीवी) के नीचे रखा जाता है और एक ढीली गाँठ बंधी हुई है। प्रविष्टि स्थान जिगर के पास है, 5-10 मिलीमीटर लिगेचर के नीचे है, लेकिन पहले पोर्टल शाखा से परे नहीं (बाएं और दाएं यकृत पोर्टल नसों). कैनुला एक डाट गाँठ के साथ धागे का उपयोग कर तय या बांधा जाता है। यह गाँठ पीवी स्थान के एक मार्कर के रूप में कार्य करता है अगर cannula disloged है. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> चित्र 3 : अपकेंद्रण चरणों का योजनाबद्ध। लक्ष्य अवांछित कोशिकाओं और अन्य घटकों को दूर करने और EVs को अलग करने के लिए है। पहले चार centrifugation कदम भिन्न centrifugation का उपयोग कर hepatocytes और अन्य कोशिकाओं, मृत कोशिकाओं, या सेल मलबे को दूर करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं. इन चरणों के बाद, ultracentrifugation 100,000 x g पर किया जाता है EVs की गोली इकट्ठा करने के लिए. गोली पीबीएस में फिर से निलंबित द्वारा धोया जाता है और 100,000 x जी पर एक अंतिम ultracentrifugation के अधीन. सभी अपकेंद्रण चरण 4 डिग्री सेल्सियस पर किए जाते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> चित्र 4 : विभेदक अपकेंद्रण. (क) 10 मिनट के लिए 50 x ग्राम पर अपकेंद्रण के बाद, हेपेटोसाइट्स युक्त एक गोली देखी जाती है। (बी) सेल के मलबे को हटाने के लिए 70 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के लिए एक गोल-तल नली का उपयोग किया जाता है। (ग) एक पॉलीकार्बोनेट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग 70 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन के लिए किया जाता है। गोली एक ट्यूब में एकत्र किया जाता है और पीबीएस के साथ फिर से निलंबित द्वारा धोया जाता है। (डी) अंतिम गोली पीबीएस के 1000 डिग्री एल में पुन निलंबित कर दी जाती है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> चित्र 5 : प्रतिनिधि परिणाम. आकार और जिगर के ऊतकों EVs की एकाग्रता नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

यह जिगर से ऊतक extracellular vesicles (EVs) को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रोटोकॉल जिगर ऊतक EVs को अलग करने के लिए अंतर ultracentrifugation द्वारा पीछा किया कोलैजानेस perfusion शामिल एक दो कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है.

जिगर से ऊतक extracellular Vesicles के अलगाव

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

यह विधि हमें वीवो में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण प्रश्नों का समाधान करने में मदद कर सकती है, जिससे हमें वेसिकल्स का स्रोत प्रदान किया जा सकता है जो स्थानीय ऊतक माइक्रोएनवायरमेंट के प्रतिनिधि हैं। ऊतक परिवेश के भीतर बाहुलर वेसिकल्स के अध्ययन से एक्सपेरिमेंटल वेसिकल्स की शारीरिक भूमिकाओं और वीवो में रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं में उनके परिवर्तनों की हमारी समझ आगे बढ़ सकती है। पोर्टल नस कैनुलेशन का एक दृश्य प्रदर्शन उपयोगी है क्योंकि नस के छोटे आकार से हेरफेर करना मुश्किल हो जाता है।डॉक्टर काओरी इशिगुरो के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन आइरीन यान, मेरी प्रयोगशाला से एक शोध प्रौद्योगिकीविद् होंगे। प्रक्रिया शुरू करने से पहले, एक एनेस्थेटाइज्ड माउस के अंगों को सुरक्षित करें और सिरिंज पंप ट्यूबिंग के एक टुकड़े के मुक्त अंत में सेट किए गए पंखों वाले रक्त संग्रह की 23 गेज सुई को कनेक्ट करें। माउस की पेट की त्वचा को 70% इथेनॉल और अल्कोहल पैड से साफ करें और छाती के पूर्वकाल से श्रोणि हड्डी तक माउस खोलने के लिए कैंची का उपयोग करें, किसी भी आंतरिक अंगों को नुकसान न पहुंचाने का ख्याल रखें।पोर्टल नस और अवर वेना कावा का पर्दाफाश करने के लिए आंतों को पेट की गुहा के दाईं ओर ले जाने के लिए एक कपास इत्तला दी एप्लिकेटर का उपयोग करें और पोर्टल नस के नीचे एक धागा रखने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। कैनुलेशन के बाद सिंचिंग के लिए तैयार करने के लिए सीवन में एक गाँठ को ढीला बांधें और कैनुला को 40 डिग्री सेल्सियस एचबीबीएस के साथ तब तक भरें जब तक कि समाधान कैनुला सुई टिप तक न पहुंच जाए। पोर्टल नस में कैनुला डालें लिगेचर के नीचे पांच से 10 मिलीमीटर और सीवन के साथ कैनुला सुरक्षित।एक से दो मिलीलीटर प्रति मिनट प्रवाह दर पर जलसेक शुरू करें। यदि कैनुला को सही ढंग से रखा गया था, तो यकृत ब्लैंच करना शुरू कर देगा। अवर वेना कावा काटें और जिगर के भीतर अत्यधिक तरल पदार्थ को छानने दें।धीरे से प्रति मिनट आठ मिलीलीटर के लिए प्रवाह की दर में वृद्धि जब तक HBSS के एक पूर्ण ५० मिलीलीटर अगले पांच मिनट से अधिक जिगर के माध्यम से perfused किया गया है । एचबीएसएस के बाहर चलने से ठीक पहले, ताजा तैयार 40 डिग्री सेल्सियस कोलेजनेज़ चार समाधान को परफ्यूज़ेट बीकर में बदलें और पांच सेकंड के अंतराल पर अवर वेना कावा के लिए क्षणिक दबाव लागू करने के लिए संदंश का उपयोग करें ताकि यकृत प्रफुल्लित हो सके और ऊतक पाचन और विघटन में मदद मिल सके। जैसे-जैसे पाचन आगे बढ़ेगा, यकृत प्रफुल्लित हो जाएगा और सफेद हो जाएगा।जब एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ कोमल जांच के बाद उदास रहता है, पंप बंद करो और cannula हटा दें । जिगर से पित्ताशय की थैली निकालें, पित्ताशय की थैली ऊतक आंसू नहीं सावधान किया जा रहा है, और साफ कैंची और संदंश का उपयोग करने के लिए PBS के एक बाँझ 10 सेंटीमीटर संस्कृति पकवान में जिगर फसल । कोमल धोने के बाद, जिगर को एक नए 10 सेंटीमीटर संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें ताजा कोलेजन चार समाधान होते हैं और यकृत को फाड़ने के लिए दो साफ संदंश का उपयोग करते हैं, जबकि धीरे-धीरे जिगर के ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करने के लिए मिलाते हैं।जब पूरे अंग खंडित हो गए हों, तो ऊतक घोल को त्रिकोणीय बनाने के लिए तीन मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें जब तक कि जिगर के अपाच्य टुकड़े हिल न जाएं। एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल छलनी के माध्यम से जिसके परिणामस्वरूप सेल समाधान डालो, किसी भी शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए HBSS के साथ पकवान धोने। सिंगल सेल सस्पेंशन के साथ वॉश पूल करें और सेंट्रलाइज करके हेपेटोसाइट्स को हटा दें।फिर सुपरनेट को एक नई 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। किसी भी अन्य कोशिकाओं को हटाने के लिए, एक नए 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले सुपरनेट को अपकेंद्री करें। मृत कोशिकाओं को एक और अपकेंद्री के साथ निकालें और किसी भी कोशिका मलबे और समुच्चय को हटाने के लिए सुपरनिटेंट को गोल तली ट्यूब में स्थानांतरित करें।अब सुपरनेट को पॉलीकार्बोनेट अल्ट्रा सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और एक दूसरे और अंतिम अल्ट्रा सेंट्रलाइजेशन के लिए पीबीएस के लगभग 20 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। फिर यदि वेसिकल्स का तुरंत विश्लेषण नहीं किया जाएगा तो शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए पीबीएस के एक मिलीलीटर में बाहुलीय नैनोवेसिकल गोली को फिर से खर्च करें। एक माउस जिगर से, इस विधि एक ऊतक बाह्य एकल वेसिकल एकाग्रता है कि १.७४ से चार बार 10 से बारहवीं के लिए ३.४६ बार 10 के एक मतलब के साथ बारहवें कणों प्रति मिलीलीटर के रूप में नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा निर्धारित पैदावार ।अलग-थलग पड़े लिवर टिश्यू एक्सपेरिमेंट वेसिकल्स का मतलब आकार नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग एनालिसिस द्वारा 100 से 600 नैनोमीटर तक के 144.5 नैनोमीटर और एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स साइज के मोड साइज के साथ 157.7 नैनोमीटर है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके अलग-थलग किए गए एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं और आगे के लक्षण वर्णन में इलेक्ट्रोमाइक्रोस्कोपी या उनकी सतह मार्कर या सामग्री के विश्लेषण द्वारा रूपात्मक आकलन शामिल हो सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

मानव मैट्रल वाल्व से प्रोटीन के निष्कर्षण के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

HEK कोशिकाओं से Mitoribosome का तेजी से अलगाव

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Nanoparticle-ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ मानव रक्त में एकल Extracellular बुलबुले के तेजी से प्रतिदीप्ति आधारित लक्षण वर्णन

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा extracellular Vesicles की इमेजिंग

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

लीवर कैंसर में सूमो प्रोटेओम के संवर्धन, अलगाव, पहचान, और विशेषता के लिए उपकरण के रूप में SUMO-Binding संस्थाओं (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

संभावित एपिजेनेटिक मार्कर के टॉप डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोफाइलिंग के लिए ज्वार लीफ टिश्यू से हिस्टोन का अलगाव

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

आणविक चैपरोन Hsp90 और इसके ग्राहक प्रोटीन किनेज Cdc37 के बीच बायोमोलेक्यूलर इंटरैक्शन की खोज फील्ड-इफेक्ट बायोसेंसिंग तकनीक का उपयोग करके

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

उच्च-थ्रूपुट अलगाव और छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्रिक सॉर्टिंग मापदंडों का अनुकूलन

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज से छोटे बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के पेप्टाइड्स की पहचान

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...