Denne metoden kan hjelpe oss med å ta opp viktige spørsmål om rollen til ekstracellulære vesikler in vivo, ved å gi oss en kilde til vesikler som er representative for det lokale vevmikromiljøet. Studier av ekstracellulære vesikler i vevsmiljøet kan fremme vår forståelse av de fysiologiske rollene til ekstracellulære vesikler og deres endringer i patofysiologiske prosesser in vivo. En visuell demonstrasjon av portalvenen kanyling er nyttig som den lille størrelsen på venen gjør det vanskelig å slå manipulere.
Demonstrere prosedyren med doktor Kaori Ishiguro vil være Irene Yan, en forskningsteknolog fra laboratoriet mitt. Før du begynner prosedyren, fest lemmer av en bedøvet mus og koble 23 gauge nålen av en bevinget blodsamling satt til den frie enden av et stykke sprøytepumperør. Rengjør musens bukhud med 70% etanol og en alkoholpute og bruk saks for å åpne musen fra brystets fremre til bekkenbenet, vær forsiktig så du ikke skader noen indre organer.
Bruk en bomullstippapplikator til å forsiktig flytte tarmene til høyre side av bukhulen for å eksponere portalvenen og dårligere vena cava og bruke buede tang til å plassere en tråd under portalvenen. Bind en knute løst i suturen for å forberede seg på cinching etter kanylen og fyll kanylen med 40 grader Celsius HBSS til løsningen når kanylenålespissen. Sett kanylen inn i portalvenen fem til 10 millimeter under ligaturen og fest kanylen med suturen.
Start infusjonen med en til to milliliter per minutt strømningshastighet. Hvis kanylen ble riktig plassert, vil leveren begynne å blanche. Skjær dårligere vena cava og la overdreven væske i leveren renne.
Øk strømningshastigheten langsomt til åtte milliliter per minutt til hele 50 milliliter HBSS er perfundert gjennom leveren i løpet av de neste fem minuttene. Like før HBSS går tom, endre nylaget 40 grader Celsius collagenase fire løsning til perfusate begeret og bruke tang for å bruke forbigående trykk på dårligere vena cava på fem sekunders intervaller for å få leveren til å hovne opp og for å hjelpe med vev fordøyelse og dissosiasjon. Etter hvert som fordøyelsen utvikler seg, vil leveren svulme og bli hvit.
Når restene er trykket inn etter skånsom sondering med en bomullstippapplikator, stopp pumpen og fjern kanylen. Fjern galleblæren fra leveren, vær forsiktig så du ikke rive galleblæren vev, og bruk ren saks og tang for å høste leveren inn i en steril 10 centimeter kultur rett av PBS. Etter skånsom vask, overfør leveren til en ny 10 centimeter kulturrett som inneholder fersk kollagenase fire løsning og bruk to rene tang for å rive leveren mens forsiktig risting for å dissosiere cellene fra levervevet.
Når hele orgelet er fragmentert, bruk en tre milliliter sprøyte for å triturate vevsslurmen til de ufordøyde leverbitene ristes av. Hell den resulterende celleløsningen gjennom en 70 mikron nylonnettsil i et 50 milliliter konisk rør, vask parabolen med HBSS for å samle eventuelle gjenværende celler. Pool vasken med enkeltcellesuspensjon og fjern hepatocytter ved sentrifugering.
Deretter overfører du supernatanten til et nytt 50 milliliter rør. For å fjerne andre celler, sentrifuger supernatanten før overføring til et nytt 50 milliliter konisk rør. Fjern de døde cellene med en annen sentrifugering og overfør supernatanten til et rundt bunnet rør for å fjerne eventuelle cellerester og aggregater.
Nå overføre supernatant til en polykarbonat ultra sentrifuge rør og resuspend pellet i ca 20 milliliter PBS for en andre og siste ultra sentrifugering. Deretter resuspend ekstracellulær nanovesicle pellet i en milliliter PBS for minus 80 grader Celsius lagring hvis vesikler ikke vil bli umiddelbart analysert. Fra en enkelt muslever gir denne metoden en vevs ekstracellulær vesikkelkonsentrasjon som varierer fra 1,74 til fire ganger 10 til tolvte med et gjennomsnitt på 3,46 ganger 10 til de tolvte partiklene per milliliter som bestemmes av nanopartikkelsporingsanalyse.
Den gjennomsnittlige størrelsen på det isolerte levervevet ekstracellulære vesikler er 157,7 nanometer med en modusstørrelse på 144,5 nanometer og ekstracellulære vesikler størrelser fra 100 til 600 nanometer ved nanopartikkelsporingsanalyse. De ekstracellulære vesikler som er isolert ved hjelp av denne tilnærmingen er egnet for nedstrøms applikasjoner og videre karakterisering kan omfatte morfologiske vurderinger ved elektromoskopi eller analyse av deres overflatemarkører eller innhold.
