Name: isolation of tissue extracellular vesicles from the liver
Uploaded: 2019-08-21T12:30:00
Duration: 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver at JoVE.com

Denne studien ble støttet av midler fra National Cancer Institute Grant CA-217833.

Alle studier som involverer dyr ble utført i samsvar med en protokoll som ble godkjent av Mayo Clinic institusjonelle Animal Care og use Committee.
1. benk forberedelse
<ol><li>Forbered et vannbad og sett den til 37 ° c. Det andre nødvendige utstyret og oppsettet er vist i figur 1.</li>
	<li>Mål 100 mg kollagenase type IV og legg den til en 125 mL kolbe som inneholder 100 mL HBSS i et vannbad (40 ° c). Sørg for at kollagenase er oppløst ved å virvler væsken i flasken, og Pass også på at flasken er fullstendig nedsenket i vannbadet. For større effektivitet, la kollagenase å oppløse i minst 30 min selv om det kan synes å oppløse umiddelbart.</li>
	<li>Senk en 125 mL kolbe som inneholder 50 mL HBSS i et vannbad ved 40 ° c. Dette vil bli brukt for første trekk.</li>
	<li>Spray ned overflaten av alle instrumenter som saksen og pinsett med 70% etanol. Forbered noen rene bomullspinner.</li>
	<li>Skyll ut slangen på pumpen ved å kjøre 70% etanol gjennom pumpen og fjerne eventuelle gjenværende etanol ved å skylle den to ganger med rennende vann.</li>
	<li>Legg en absorberende benk pad på laboratoriebenken og Plasser en hard boks beholder øverst. Dette vil være nødvendig for å inneholde overflødig væske under musen. Pakk en polystyren skum pad med aluminiumsfolie og legg den inne i beholderen.</li>
	<li>Plasser en steril 10 cm kultur rett nær benken. Dette vil bli brukt til å holde fordøyd leveren etter at den er ferdig.</li>
	<li>Hell 10 mL kollagenase medium (trinn 1,2) inn i en steril kultur rett på forhånd.</li>
	<li>Ved hjelp av en vinge blod samling sett, koble 23-gauge til den frie enden av pumpeslangen (kutte vingene av sommerfuglen kanyle kan føre til bedre håndtering). Pass til tuppen av kanyle av blod samlingen er fylt.</li>
</ol>2. Animal forberedelse
<ol><li>Før du starter anestesi ved hjelp av isoflurane, sørg for at en tilstrekkelig mengde av forsynings gass er tilgjengelig for varigheten av prosedyren. Slå på oksygen (O2) forsyning til induksjon kammeret på 1-2 L, og slå på isoflurane mellom 2-4% ved hjelp av en flowmeter.</li>
	<li>Sett musen inn i induksjon kammer og Lukk toppdekselet. Overvåk musen til den er tilbakelent. Merk: gassene i kammeret vil holde mus anesthetized i flere minutter.</li>
	<li>Plasser musen på en polystyren skum pad innpakket med aluminiumsfolie. Bytt flyten fra induksjon kammeret til en nosecone. Sørg for at anestesi er tilstrekkelig. Hvis musen har begynt å reagere, forsiktig holde den i en nese kjegle til den er helt anesthetized.</li>
	<li>Sørg for anestesi ved å overvåke åndedrett og respons på stimulering under inngrepet. Juster hastigheten flowmeter etter behov for å sikre tilstrekkelig anestesi. Den poter må avslutte til knipe test under anestesi. Ytterligere detaljer kan fås fra laboratoriet guide for omsorg for dyr.</li>
	<li>Tape eller PIN ned alle fire lemmer av musen.</li>
	<li>Rengjør huden over magen ved sprøyting med 70% etanol og tørk den av med gasbind og en alkohol pute. Dette trinnet er avgjørende for å unngå forurensning fra musen pels.</li>
	<li>Lag en vidåpne skjære gjennom huden fra fremre til bekkenet beinet ved hjelp av et sett av sterile saks. Vær forsiktig så du ikke kutte noen indre organer. Fortrenge tarmen til dyrets venstre side ved hjelp av en bomulls spiss applikator for å forsiktig for å eksponere portalen vene (PV) og dårligere vena cava (IVC).</li>
</ol>3. kanyleringen og (0,5 h)
<ol><li>Ved hjelp av buet tang, plassere en tråd under portalen vene og knyt en knute løst for å forberede helmkompatibel tett etter kanyleringen.</li>
	<li>Sett inn kanyle (23G fra blodprøvetakingssettet) i portalen vene 5-10 mm under ligatur. Ikke sett inn kanyle forbi den første portalen gren, ellers høyre fremre flik kan være utilstrekkelig perfusert. Kanyle kan festes eller festes med tråd ved hjelp av en propp knute.</li>
	<li>Start pumpen for å sette mot i HBSS ved lav strømningshastighet (1-2 mL/min). Når kanyleringen er bekreftet å være vellykket, leveren vil begynne å Blanch.</li>
	<li>Skjær IVC å avlaste trykket og la overdreven væske i leveren til å renne. Dette er best utført ved hjelp av operatørene andre hånden slik at kanyle ikke er flyttet.</li>
	<li>Øk strømningshastigheten langsomt til 8 mL/min og Fullfør den med hele 50 mL volum HBSS gjennom leveren, i løpet av de neste 5 min.</li>
	<li>Endre kollagenase som inneholder medium (trinn 1,2) til begeret like før HBSS begynner å renne ut. Sørg for at luftbobler ikke er tilstede og ikke strømme inn i leveren når du skifter medium.</li>
	<li>Påfør forbigående trykk til IVC ved 5 s intervaller ved å klemme med tang. Dette vil føre til at leveren til å hovne opp og hjelpe med vev fordøyelsen og dissosiasjon (7-8 min). Som fordøyelsen utvikler seg, vil leveren hovne opp og bli hvit. Leveren kan hovne opp jevnt til omtrent to ganger sin opprinnelige størrelse.</li>
	<li>Slå av pumpen og fjerne kanyle når fordøyelsen er fullført. Fullføringen av leveren fordøyelsen vil avhenge av størrelsen på musen og tilstanden til leveren. En bulk i leveren kan observeres hvis en bomulls-tippet applikator brukes til forsiktig sonde leveren.</li>
	<li>Fjern galleblæren fra leveren, være forsiktig så du ikke rive den. Ved hjelp av en vasket saks og pinsett, trekke ut leveren fra musen til en steril 10 cm kultur parabolen inneholder fosfat-bufret saltvann (PBS) for overflate vasking. Overfør leveren forsiktig inn i steril 10 cm kultur parabolen inneholder kollagenase medium (fra trinn 1,8). Dette er et kritisk skritt for å unngå forurensning fra musen blod og galle.</li>
	<li>Grip og rive fra hverandre leveren med to rene tang mens forsiktig rister cellene fra leveren. Som dette skjer, vil mediet bli formørket. Alle hepatocytter kan ristes bort, etterlot bindevev og vaskulær vev.</li>
	<li>Triturate cellen løsningen mange ganger ved hjelp av en 3 mL sprøyte til ufordøyd deler av leveren er ristet av. Hell den av i en 50 mL konisk rør med 70 μm nylon celle siler å filtrere noen ufordøyd bindevev. Vask parabolen med HBSS å samle de resterende cellene og fylle opp 50 mL konisk rør.</li>
	<li>Sentrifuger mykt 50 mL konisk slange i en svingende skuffe rotor ved 50 x g i 10 min ved 4 ° c.</li>
	<li>Overfør supernatanten til et nytt 50 mL konisk rør.</li>
</ol>4. isolering av EV-er (5 h)
<ol><li>Sentrifuger supernatanten ved 300 x g i 10 min ved 4 ° c. Overfør supernatanten til et nytt 50 mL konisk rør.</li>
	<li>Sentrifuger supernatanten ved 2000 x g i 20 min ved 4 ° c for å fjerne celle rester og aggregater.</li>
	<li>Overfør supernatanten til et rundt bunn rør og sentrifuger supernatanten ved 10 000 x g i 70 min. ved 4 ° c.</li>
	<li>Samle supernatanten og plasser i en polykarbonat ultracentrifuge tube og sentrifuger på 100 000 x g for 70 min ved 4 ° c.</li>
	<li>Samle pellet i en ultracentrifuge tube som deretter vaskes ved å re-suspendere i PBS. Sentrifuger supernatanten ytterligere ved 100 000 x g for 70 min. ved 4 ° c.</li>
	<li>Den siste pellet består av cellulære nanovesikler kan brukes direkte for eksperimenter eller re-suspendert med 1000 μL av PBS og lagret ved-80 ° c.</li>
</ol>5. vurdering av kvalitet og utbytte av isolasjoner
<ol><li>Vurder størrelsesfordelingen og konsentrasjonen ved hjelp av nanopartikkel sporings analyse eller tunable pulsmåling etter maskin produsentens protokoller.</li>
	<li>Utføre ytterligere isolering og rensing av spesifikke vesicle populasjoner av ulike tilnærminger som tillegg av en sukrose gradient eller pute, immunoaffinity teknikker, eller størrelse eksklusjon kromatografi, basert på spesifikke eksperimentelle behov.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer:+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth.">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li><li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+liver+diseases.">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li><li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture.">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Denne protokollen beskriver en optimal og reproduserbar metode for isolering av hepatic vev EV ved hjelp av en to-trinns prosess via portalen venen etterfulgt av differensial ultracentrifugation. Viktige trinn i prosedyren inkluderer kanyle plassering, kollagenase konsentrasjon og fordøyelsen tid, strømningshastighet på mediet, håndtering av vevet etter fordøyelsen, og klassisk differensial ultracentrifugation.
Celle separasjon oppnås ved separasjon fra bindevevs komponenter etter fordøyelsen bruker kollagenase type IV. Konsentrasjonen av kollagenase som brukes for blod kan variere fra 0,1 til 5 mg/mL. Det kan være betydelig batch-til-batch variasjon i effekten av kollagenase for vev fordøyelse. Konsentrasjoner av kollagenase fra 0,5 til 5 mg/mL ble testet, men konsentrasjonen som ble brukt hadde ingen stor innvirkning på avkastningen fra EV ' r. Ved hjelp av en høyere konsentrasjon av kollagenase vil resultere i en raskere hevelse og bleking av leveren. Målet er å få tilfredsstillende celle dissosiasjon uten overdreven forurensning eller skade. En optimal konsentrasjon av kollagenase som brukes i disse isolasjoner er 1-2 mg/mL perfusert for 7-8 min ved en strømningshastighet på 8 mL/min. En prosess som er for lang, vil øke risikoen for å ødelegge det tynne bindevevet i leveren, så vel som å øke tekniske risikoer som nål dislodgment fra portalen vene eller luft overlapping med venen.
Det mest utfordrende aspektet ved denne protokollen er kanyleringen av portalen vene. Dette kan være utfordrende å utføre, spesielt i mus i 18-til 25-g størrelse rekkevidde. Teknikkene for kollagenase ble opprinnelig utviklet for bruk i rotter og senere vedtatt for bruk i mus etter mange modifikasjoner og justeringer. Kanyleringen ved hjelp av en 23G blod samling sett er enklere enn plassering av et kateter i blodkarene i små luminal diameter. Festing av kanyle ved hjelp av tråd med en stopper knute anbefales for å unngå koagulater og knuten fungerer også som en markør for Portal vene plassering i tilfelle kanyle kommer av fartøyet.
For nedstrøms analyse, er det svært viktig å ha minimal forurensning fra cellene. Det er flere viktige hensyn i håndteringen av vev etter fordøyelsen. Først, pinsett og saks er endret når leveren trekkes ut for å unngå blod forurensning. For det andre er det viktig at galleblæren fjernes forsiktig fra leveren for å unngå å rive og uønsket forurensning fra galle. Tredje, når leveren er fjernet fra musen, er leveren vasket veldig forsiktig ved hjelp av PBS å fjerne blod. Minimering av forurensning med celler bør gis høyere prioritet enn reduksjon i utbyttet av EV ' r innhentet.
Ultracentrifugation er den mest brukte metoden for isolering og rensing av EV ' s8,9,10,11. Denne tilnærmingen vil fjerne de fleste parenkymatøs celler som hepatocytter eller cholangiocytes og ikke-parenkymatøs celler som Kupffer celler, sinusformet endothelial celler, og Stel celler, i tillegg vil celle rusk, celle samlinger og døde celler også bli fjernet av differensial sentrifugering. Ytterligere rensing og isolering av spesifikke populasjoner kan utføres ved størrelses ekskludering kromatografi for å fjerne eventuelle ikke-flytande protein aggregater eller lipoproteiner.
En begrensning av denne protokollen er at det ikke kan fange opp alle vev blemmer, gitt muligheten for at noen blemmer kan fjernes i perfusate. Hvis en global vurdering er nødvendig, bør innsamling av perfusate og isolering av blemmer innen perfusate vurderes. En ytterligere begrensning er potensialet for celle skade. For å overvåke den potensielle virkningen av overdreven celle død, kan celle levedyktighet overvåkes og innlemmes i kvalitetsparametre for vev EV-isolasjoner. Som konklusjon, denne prosedyren beskriver en optimalisert arbeidsflyt ved hjelp av en to-trinns prosessteknikk via portalen vene etterfulgt av differensial ultracentrifugation for å få leveren vev EV ' er fra mus lever på en høy yield. Disse vevs-EV-er egner seg for nedstrøms analyser som karakterisering av Biomolecular sammensetning og andre studier som tar sikte på å karakterisere deres fysiologiske eller patofysiologiske roller eller potensielle anvendelser som sykdoms markører.

Ekstracellulære blemmer (EV) er membran-bundet blemmer som er utgitt fra mange forskjellige typer celler i kroppen. EV ' r inneholder en last av molekyler som inkluderer RNA, DNA og protein. Overføring av denne lasten av EV ' r fra en celle til en annen er postulert som en mekanisme som celler innen vev kommuniserer med hverandre1. Flertallet av informasjon om lasten eller rollene til EV ' r i normale helse og sykdommer har blitt avledet fra studier på EV ' r som er innhentet fra celler i kultur eller innsamlet fra sirkulasjonen eller andre kroppsvæsker2. For å forstå sine fysiologiske roller in vivo, er en robust metode nødvendig for isolering av vevs-EV ' r som fanger opp alle bestander av EV ' r og unngår cellulær skade eller forurensning3. Det overordnede målet for metoden som er beskrevet her, er å isolere vevs-EV-er fra muse lever.
De fleste celletyper i leveren har vist å produsere el-biler, og studiet av EV-baserte signal er å fremme grunnleggende kunnskap og forståelse av leversykdommer. Imidlertid er den kombinerte effekten av EV-er fra forskjellige celletyper innenfor vev bare delvis forstått. Isolering av EV ' r fra lever vev er nødvendig for å kunne forstå in situ bidrag fra EV ' r i vevs miljøet. Tilnærmingen som beskrives her, er basert på en to-trinns dissosiasjon for å forbedre vevs belastningen og minimere celle skade. Deretter er EV ' er isolert fra dissosiert leveren vev. Tilnærminger som bruker to-trinns-hepatocytter har blitt brukt siden tidlig på 1950-tallet4. Disse metodene for hepatocytter isolasjon har blitt modifisert og kontinuerlig forbedret og er nå standard tilnærminger for isolering av hepatocytter i kulturer, i celle suspensjoner, og fra vev5,6,7. I det første trinnet utsettes leveren for en ikke-resirkulering, med kalsium fri buffer, Hank ' s balanserte saltløsning (HBSS). I det andre trinnet, leveren er perfusert med kollagenase å oppløse den ekstracellulære matrise for videre separasjon av desmosomal celle-til-celle veikryss. En optimal behandlingstid for kollagenase oppløsning er 7 til 10 minutter. En kortere varighet av behandlingen vil føre til ufullstendig oppløsning og beholde celle kontakter i leveren, mens en lengre varighet kan forårsake leverskader eller Portal vene avbrudd. EV ' r blir deretter isolert ved hjelp av differensial sentrifugering for å fjerne celler og celleavfall. Dette resulterer i EV-kolleksjon i høye avlinger som kan brukes til videre nedstrøms analyser eller studier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:168px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB500125</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Curved non-serrated scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Masking tape</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Styrofoam pad</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:168px;">Scientific inc.</td>
			<td>B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Masterflex L/S Digital Miniflex Pump</td>
			<td style="width:168px;">Cole-parmer</td>
			<td>ZX-07525-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Water bath</td>
			<td>Thermo Electron Precision</td>
			<td>2837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:432px;">Blood collection sets</td>
			<td style="width:168px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">367292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:432px;">Petri dish, clear lid 100x15</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 70mm Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Moore medical</td>
			<td>69622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">25mL Serological Pipet</td>
			<td style="width:168px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser</td>
			<td>BioSurplus</td>
			<td>203-2751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:432px;">&#160;Levo Plus Motorized Pipette Filler</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>74020002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5804R</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>22628048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>969347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B34182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JA-25.50Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Round-bottom tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Reagents</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">HyClone Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30588.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase, Type IV, powder</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tissue extracellular vesicles from the liver

Ekstracellulære blemmer (EV) kan frigjøres fra mange forskjellige celletyper og oppdages i de fleste, om ikke alle, kroppsvæsker. EV ' r kan delta i celle-til-celle-kommunikasjon ved å skytteltrafikk bioaktive molekyler som RNA eller proteiner fra en celle til en annen. De fleste studier av EV ' r er utført i cellekultur modeller eller i EV ' er isolert fra kroppsvæsker. Det er økende interesse for isolering av EV ' r fra vev for å studere deres bidrag til fysiologiske prosesser og hvordan de er endret i sykdom. Isolering av EV ' r med tilstrekkelig utbytte fra vev er teknisk utfordrende på grunn av behovet for vev dissosiasjon uten cellulær skade. Denne metoden beskriver en fremgangsmåte for isolering av EV-er fra mus leveren vev. Metoden innebærer en to-trinns prosess som starter med in situ kollagenase fordøyelse etterfulgt av differensial ultra-sentrifugering. Vevs bruk med kollagenase gir en fordel fremfor mekanisk skjæring eller homogenisering av leveren vev på grunn av sin økte utbytte av oppnådde EV ' r. Bruken av denne to-trinns prosessen for å isolere EV ' r fra leveren vil være nyttig for studiet av vevs-EV ' r.

Apparatet som trengs for disse isolasjoner består av standard laboratorieutstyr, noe som gjør dette til en relativt enkel og kostnadseffektiv tilnærming. Isolasjoner har blitt utført fra tolv-til tretti-ukers-gamle mannlige og kvinnelige Balb/c eller FVB mus. Skuffen som holder musen er foret med aluminiumsfolie inne i en hard-vegger container som samler overflødig væske under. Flaskene som inneholder HBSS eller kollagenase medium er nedsenket i et vannbad (40 ° c) som er klar til bruk. To sterile 10 cm kultur retter brukes. En er nødvendig for overflate vasking med PBS, og den andre for hepatocytter separasjon fra bindevevs komponenter.
I denne metoden, leveren er perfusert i en ikke-kontinuerlig måte via portalen vene i preferanse til kanyleringen fra dårligere vena cava. En alternativ og vanlig metode for å utføre retrograd ved å cannulating den underlegne vena cava og kutte portalen vene for drenering. Men, Portal vene kanyleringen er lett å få tilgang til og innebærer en kort avstand til leveren, som portalen vene feeds direkte inn i leveren8. Valget av et innsettingspunkt for kanyleringen er avgjørende for optimal suksess (figur 2). Kanyle er plassert forbi grenene av magesekken og bukspyttkjertelen årer, men ikke utover den første portalen gren (høyre og venstre hepatic Portal årer). Når den optimale innsetting plassering i portalen venen er identifisert, buet tang brukes til å plassere en tråd under Portal vene og knytte en løs knute. Nålen på kanyle er festet med tråd ved hjelp av en propp knute for å stoppe nålen faller ut.
Figur 3 skisserer den generelle behandlingen ordningen for differensial sentrifugering for lever vevet EV ' s isolasjon. Ultracentrifugation fjerner celler, rusk og andre urenheter. De første fire sentrifugering trinn (50 x g, 300 x g, 2 000 x g, 10 000 x g) er utformet for å fjerne hepatocytter, intakt andre celler, døde celler, eller celle rusk hhv. (Tall 4a og 4b). Etter disse trinnene, er ultracentrifugation igjen utført ved 100 000 x g for å samle pellet (Figur 4C). Pellet er vasket av re-suspendere i PBS og utsatt for en endelig ultracentrifugation på 100 000 x g. Pellet etter ultracentrifugation er absolutt synlig og viscid i denne prosedyren sammenlignet med EV ' r fra kultur medier. Pipettering mange ganger er nødvendig til noen brune aggregater er ute av syne og helt oppløst. Den siste pellet re-suspendert med 1000 μL av PBS (Figur 4D). Ultracentrifugation fjerner urenheter og andre løselige forurensninger fra plasma, noe som kan påvirke funksjonelle eksperimentelle utfall. Sentrifugering utføres ved 4 ° c.
Fra mus leveren, denne metoden gir en vev EV konsentrasjon som spenner fra 1,74 til 4,00 x 1012 med en gjennomsnittlig 3,46 x 1012 partikler per ml som bestemmes av NANOPARTIKKEL Tracking analyse (nTa) (figur 5). Den gjennomsnittlige størrelsen på de isolerte leveren vev EV ' r var 157,7 NM, med en modus størrelse på 144,5 NM og EV størrelser fra 100-600 NM ved NTA. Avkastningen av EV vil avhenge av faktorer som leveren vekt og tap innenfor perfusate eller ultracentrifugation trinn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> Figur 1 : Benk forberedelse. Materialene og deres steder er: (A) pumpe, (B) varmet 125 mL kolbe inneholder HBSS og vann suge port, (C) nese kjegle koblet til en isoflurane damper, (D) vann eksos porten på pumpen forbinder med nålen, (E) skuff foret med aluminiumsfolie inne i en harde vegger container, og (F) 10 cm kultur rett der kollagenase medium helles på forhånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> Figur 2 : Kanyleringen nettsted. Anatomien til muse magen er vist. Ved hjelp av buet tang, er en tråd plassert under portalen venen (PV) og en løs knute er bundet. Innsettingsstedet er nær leveren, 5-10 mm under ligatur, men ikke utover den første portalen grenen (venstre og høyre hepatic Portal årer). Kanyle er fast eller festet ved hjelp av tråd med en propp knute. Denne knuten fungerer som en markør for PV plassering Hvis kanyle er forskyves. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> Figur 3 : Skjematisk av sentrifugering skritt. Målet er å fjerne uønskede celler og andre komponenter og isolere EV ' r. De fire første sentrifugering trinnene er utformet for å fjerne hepatocytter og andre celler, døde celler eller celle rusk ved hjelp av differensial sentrifugering. Etter disse stegene utføres ultracentrifugation ved 100 000 x g for å samle pellet av EV ' r. Pellet er vasket av re-suspendere i PBS og utsatt for en endelig ultracentrifugation på 100 000 x g. Alle sentrifugering trinnene utføres ved 4 ° c. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> Figur 4 : Differensial sentrifugering. (A) etter sentrifugering ved 50 x g i 10 min, observeres en pellet som inneholder hepatocytter. (B) en rund bunn tube brukes for sentrifugering ved 10 000 x g for 70 min for å fjerne celle rusk. (C) en polykarbonat ultracentrifuge tube brukes for sentrifugering på 100 000 x g for 70 min. Pellet er samlet i ett rør og vasket ved å re-suspendere med PBS. (D) den endelige pellet er re-suspendert i 1000 μL av PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> Figur 5 : Representative resultat. Størrelsen og konsentrasjonen av lever vev EV ' r kan bestemmes av nanopartikkel Tracking analyse (NTA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver at JoVE.com

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Dette er en protokoll for å isolere vev ekstracellulære blemmer (EV) fra leveren. Protokollen beskriver en to-trinns prosess som involverer kollagenase, etterfulgt av differensial ultracentrifugation for å isolere lever vev EV ' r.

Isolering av tissue ekstracellulære blemmer fra leveren

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Denne metoden kan hjelpe oss med å ta opp viktige spørsmål om rollen til ekstracellulære vesikler in vivo, ved å gi oss en kilde til vesikler som er representative for det lokale vevmikromiljøet. Studier av ekstracellulære vesikler i vevsmiljøet kan fremme vår forståelse av de fysiologiske rollene til ekstracellulære vesikler og deres endringer i patofysiologiske prosesser in vivo. En visuell demonstrasjon av portalvenen kanyling er nyttig som den lille størrelsen på venen gjør det vanskelig å slå manipulere.Demonstrere prosedyren med doktor Kaori Ishiguro vil være Irene Yan, en forskningsteknolog fra laboratoriet mitt. Før du begynner prosedyren, fest lemmer av en bedøvet mus og koble 23 gauge nålen av en bevinget blodsamling satt til den frie enden av et stykke sprøytepumperør. Rengjør musens bukhud med 70% etanol og en alkoholpute og bruk saks for å åpne musen fra brystets fremre til bekkenbenet, vær forsiktig så du ikke skader noen indre organer.Bruk en bomullstippapplikator til å forsiktig flytte tarmene til høyre side av bukhulen for å eksponere portalvenen og dårligere vena cava og bruke buede tang til å plassere en tråd under portalvenen. Bind en knute løst i suturen for å forberede seg på cinching etter kanylen og fyll kanylen med 40 grader Celsius HBSS til løsningen når kanylenålespissen. Sett kanylen inn i portalvenen fem til 10 millimeter under ligaturen og fest kanylen med suturen.Start infusjonen med en til to milliliter per minutt strømningshastighet. Hvis kanylen ble riktig plassert, vil leveren begynne å blanche. Skjær dårligere vena cava og la overdreven væske i leveren renne.Øk strømningshastigheten langsomt til åtte milliliter per minutt til hele 50 milliliter HBSS er perfundert gjennom leveren i løpet av de neste fem minuttene. Like før HBSS går tom, endre nylaget 40 grader Celsius collagenase fire løsning til perfusate begeret og bruke tang for å bruke forbigående trykk på dårligere vena cava på fem sekunders intervaller for å få leveren til å hovne opp og for å hjelpe med vev fordøyelse og dissosiasjon. Etter hvert som fordøyelsen utvikler seg, vil leveren svulme og bli hvit.Når restene er trykket inn etter skånsom sondering med en bomullstippapplikator, stopp pumpen og fjern kanylen. Fjern galleblæren fra leveren, vær forsiktig så du ikke rive galleblæren vev, og bruk ren saks og tang for å høste leveren inn i en steril 10 centimeter kultur rett av PBS. Etter skånsom vask, overfør leveren til en ny 10 centimeter kulturrett som inneholder fersk kollagenase fire løsning og bruk to rene tang for å rive leveren mens forsiktig risting for å dissosiere cellene fra levervevet.Når hele orgelet er fragmentert, bruk en tre milliliter sprøyte for å triturate vevsslurmen til de ufordøyde leverbitene ristes av. Hell den resulterende celleløsningen gjennom en 70 mikron nylonnettsil i et 50 milliliter konisk rør, vask parabolen med HBSS for å samle eventuelle gjenværende celler. Pool vasken med enkeltcellesuspensjon og fjern hepatocytter ved sentrifugering.Deretter overfører du supernatanten til et nytt 50 milliliter rør. For å fjerne andre celler, sentrifuger supernatanten før overføring til et nytt 50 milliliter konisk rør. Fjern de døde cellene med en annen sentrifugering og overfør supernatanten til et rundt bunnet rør for å fjerne eventuelle cellerester og aggregater.Nå overføre supernatant til en polykarbonat ultra sentrifuge rør og resuspend pellet i ca 20 milliliter PBS for en andre og siste ultra sentrifugering. Deretter resuspend ekstracellulær nanovesicle pellet i en milliliter PBS for minus 80 grader Celsius lagring hvis vesikler ikke vil bli umiddelbart analysert. Fra en enkelt muslever gir denne metoden en vevs ekstracellulær vesikkelkonsentrasjon som varierer fra 1,74 til fire ganger 10 til tolvte med et gjennomsnitt på 3,46 ganger 10 til de tolvte partiklene per milliliter som bestemmes av nanopartikkelsporingsanalyse.Den gjennomsnittlige størrelsen på det isolerte levervevet ekstracellulære vesikler er 157,7 nanometer med en modusstørrelse på 144,5 nanometer og ekstracellulære vesikler størrelser fra 100 til 600 nanometer ved nanopartikkelsporingsanalyse. De ekstracellulære vesikler som er isolert ved hjelp av denne tilnærmingen er egnet for nedstrøms applikasjoner og videre karakterisering kan omfatte morfologiske vurderinger ved elektromoskopi eller analyse av deres overflatemarkører eller innhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Rask isolering av Mitoribosome fra HEK celler

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rask fluorescens-baserte karakterisering av enkelt ekstracellulær blemmer i menneskelig blod hydrogenion sporing analyse

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging av ekstracellulære blemmer av Atomic Force mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Isolering av Histone fra Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profilering av potensielle epigenetiske markører

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Utforske biomolekylær interaksjon mellom molekylær chaperone Hsp90 og dets klientprotein Kinase Cdc37 ved hjelp av field-effect biosensing teknologi

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Optimalisering av flowcytometriske sorteringsparametere for høykapasitetsisolering og rensing av små ekstracellulære vesikler

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Isolating Small Extracellular Vesicles and Extracting Their Peptidome

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages (Video) | JoVE

Identifisering av peptider av små ekstracellulære vesikler fra benmargsavledede makrofager

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...