Name: isolation of tissue extracellular vesicles from the liver
Uploaded: 2019-08-21T12:30:00
Duration: 5 s
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Este estudio fue apoyado por fondos del Instituto Nacional del Cáncer Grant CA-217833.

Todos los estudios que involucran animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic.
1. Preparación de banco
<ol><li>Preparar un baño de agua y ponerlo a 37 oC. El resto del equipo y la configuración necesarios se muestran en la Figura1.</li>
	<li>Mida 100 mg de colagenasa tipo IV y agréguela a un matraz de 125 ml que contenga 100 ml de HBSS en un baño de agua (40 oC). Asegúrese de que la colagenasa se ha disuelto girando el líquido en el matraz, y también asegúrese de que el matraz esté completamente sumergido en el baño de agua. Para una mayor eficiencia, permita que la colagenasa se disuelva durante al menos 30 minutos aunque parezca que se disuelve instantáneamente.</li>
	<li>Sumerja un matraz de 125 ml que contenga 50 ml de HBSS en un baño de agua a 40 oC. Esto se utilizará para el lavado inicial.</li>
	<li>Rocíe por la superficie de todos los instrumentos como las tijeras y fórceps con 70% de etanol. Prepare unos hisopos de algodón limpios.</li>
	<li>Enjuague el tubo de la bomba ejecutando 70% de etanol a través de la bomba y retire cualquier etanol residual enjuagándolo dos veces con agua corriente.</li>
	<li>Coloque una almohadilla de banco absorbente en el banco de laboratorio y coloque un recipiente de caja dura en la parte superior. Esto será necesario para contener cualquier exceso de líquidos durante la perfusión del ratón. Envuelva una almohadilla de espuma de poliestireno con papel de aluminio y colóquela dentro del recipiente.</li>
	<li>Coloque un plato de cultivo estéril de 10 cm cerca del banco. Esto se utilizará para contener el hígado digerido después de que se haya completado la perfusión.</li>
	<li>Vierta 10 ml de medio de colagenasa (paso 1.2) en un plato de cultivo estéril de antemano.</li>
	<li>Usando un conjunto de recolección de sangre allado, conecte el calibre 23 al extremo libre del tubo de la bomba (cortar las alas de la cánula de mariposa puede conducir a un mejor manejo). Pase hasta que se llene la punta de la cánula de la recolección de sangre.</li>
</ol>2. Preparación animal
<ol><li>Antes de comenzar la anestesia con isoflurano, asegúrese de que haya una cantidad adecuada de gas de suministro disponible durante la duración del procedimiento. Encienda el suministro de oxígeno (O2) a la cámara de inducción a 1-2 L, luego encienda el isoflurano entre 2-4% usando un medidor de flujo.</li>
	<li>Coloque el ratón en la cámara de inducción y cierre la puerta superior. Supervise el ratón hasta que se recline. NOTA: Los gases de la cámara mantendrán a los ratones anestesiados durante varios minutos.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una almohadilla de espuma de poliestireno envuelta con papel de aluminio. Cambie el flujo de la cámara de inducción a un nosecone. Asegúrese de que la anestesia sea adecuada. Si el ratón ha comenzado a responder, retérelo suavemente en un cono nasal hasta que esté completamente anestesiado.</li>
	<li>Asegurar la anestesia mediante el monitoreo de la respiración y la respuesta a la estimulación durante el procedimiento. Ajuste el caudalímetro según sea necesario para garantizar una anestesia adecuada. Las patas deben no responder a la prueba de pellizcar bajo anestesia. Se pueden obtener más detalles de la guía de laboratorio para el cuidado de animales.</li>
	<li>Tape o fija las cuatro extremidades del ratón.</li>
	<li>Limpie la piel sobre el abdomen rociándola con 70% de etanol y limpiándola con gasa y una almohadilla de alcohol. Este paso es fundamental para evitar la contaminación del pelaje del ratón.</li>
	<li>Haz un corte abierto a través de la piel desde el hueso anterior hasta el hueso de la pelvis usando un conjunto de tijeras estériles. Tenga cuidado de no cortar ningún órgano interno. Desplazar los intestinos hacia el lado izquierdo del animal mediante el uso de un aplicador con punta de algodón para exponer suavemente la vena porta (PV) y la vena cava inferior (IVC).</li>
</ol>3. Cannulación y perfusión (0,5 h)
<ol><li>Usando fórceps curvos, coloca un hilo debajo de la vena porta y ata un nudo libremente para preparar el cinching firmemente después de la cannulación.</li>
	<li>Inserte la cánula (23G del conjunto de recolección de sangre) en la vena porta 5-10 mm por debajo de la ligadura. No inserte la cánula más allá de la primera rama del portal, de lo contrario el lóbulo anterior correcto puede ser insuficientemente perfundido. La cánula se puede fijar o fijar con rosca utilizando un nudo de tapón.</li>
	<li>Encienda la bomba para infundir en HBSS a un caudal bajo (1-2 ml/min). Una vez que se confirma que la cannulación es exitosa, el hígado comenzará a blanquear.</li>
	<li>Corte el CIV para aliviar la presión y permitir que el exceso de líquido dentro del hígado drene. Esto se realiza mejor utilizando los operadores de la otra mano para que la cánula no se mueva.</li>
	<li>Aumente lentamente el caudal a 8 ml/min y complete la perfusión utilizando todo el volumen de 50 ml de HBSS a través del hígado, durante los siguientes 5 min.</li>
	<li>Cambie la colagenasa que contiene el medio (paso 1.2) en el vaso de precipitados justo antes de que el HBSS comience a agotarse. Asegúrese de que las burbujas de aire no están presentes y no fluyen hacia el hígado al cambiar el medio.</li>
	<li>Aplique presión transitoria al IVC a intervalos de 5 s sujetando con fórceps. Esto hará que el hígado se hinche y ayudará con la digestión de los tejidos y la disociación (7-8 min). A medida que la digestión progresa, el hígado se hinchará y se volverá blanco. El hígado puede hincharse uniformemente a aproximadamente el doble de su tamaño original.</li>
	<li>Apague la bomba y retire la cánula una vez completada la digestión. La finalización de la digestión hepática dependerá del tamaño del ratón y la condición del hígado. Se puede observar una abolladura en el hígado si se utiliza un aplicador con punta de algodón para sondear suavemente el hígado.</li>
	<li>Retire la vesícula biliar del hígado, teniendo cuidado de no rasgarla. Usando un par lavado de tijeras y fórceps, extraiga el hígado del ratón en un plato de cultivo estéril de 10 cm que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS) para el lavado de superficies. Transfiera el hígado cuidadosamente al plato de cultivo estéril de 10 cm que contiene medio de colagenasa (del paso 1.8). Este es un paso crítico para evitar la contaminación de la sangre del ratón y la bilis.</li>
	<li>Agarre y desgarre el hígado con dos fórceps limpios mientras agita suavemente las células del hígado. A medida que esto suceda, el medio se nublará. Todos los hepatocitos pueden ser sacudidos, dejando atrás el tejido conectivo y el tejido vascular.</li>
	<li>Triturar la solución celular muchas veces usando una jeringa de 3 ml hasta que las partes no digeridas del hígado se sacudan. Vierta en un tubo cónico de 50 ml con coladores de células de nylon de 70 m para filtrar cualquier tejido conectivo no digerido. Lave el plato con HBSS para recoger las células restantes y llenar el tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar suavemente el tubo cónico de 50 ml en un rotor de cucharón oscilante a 50 x g durante 10 min a 4 oC.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.</li>
</ol>4. Aislamiento de vehículos eléctricos (5 h)
<ol><li>Centrifugar el sobrenadante a 300 x g durante 10 min a 4oC. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 2000 x g durante 20 min a 4 oC para eliminar los restos celulares y los agregados.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un tubo de fondo redondo y centrifugar el sobrenadante a 10.000 x g durante 70 min a 4oC.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante y colocar en un tubo de ultracentrífuga de policarbonato y centrífuga a 100.000 x g durante 70 min a 4 oC.</li>
	<li>Recoger el pellet en un tubo ultracentrífugo que luego se lava mediante la re-suspensión en PBS. Centrifugar el sobrenadante aún más a 100.000 x g durante 70 min a 4oC.</li>
	<li>El pellet final compuesto de nanovesículas celulares se puede utilizar directamente para experimentos o re-suspendido con 1000 s de PBS y almacenado a -80 oC.</li>
</ol>5. Evaluación de la calidad y el rendimiento de los aislamientos
<ol><li>Evalúe la distribución y concentración del tamaño mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas o la sintiendo impulsos resistivos siguiendo los protocolos del fabricante del instrumento.</li>
	<li>Realizar un mayor aislamiento y purificación de poblaciones específicas de vesículas mediante diversos enfoques, como la adición de un gradiente o cojín de sacarosa, técnicas de inmunoafinidad o cromatografía de exclusión de tamaño, basada en necesidades experimentales específicas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+nanovesicle-mediated+microRNA+transfer:+a+mechanism+of+environmental+modulation+of+hepatocellular+cancer+cell+growth.">Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth.</a> Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).</li><li>Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+liver+diseases.">Extracellular vesicles in liver diseases.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).</li><li>Kogure, T., Patel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+extracellular+nanovesicle+microRNA+from+liver+cancer+cells+in+culture.">Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).</li><li>Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+role+of+the+liver+in+plasma+protein+synthesis;+a+direct+study+of+the+isolated+perfused+rat+liver+with+the+aid+of+lysine-epsilon-C14.">The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14.</a> Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).</li><li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation.">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li><li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes.">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li><li>Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+hepatocytes+for+transplantation:+a+comparison+between+antegrade+and+retrograde+liver+perfusion.">Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion.</a> Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método óptimo y reproducible para el aislamiento del EV de tejido hepático mediante un proceso de perfusión en dos pasos a través de la vena porta seguida de una ultracentrifugación diferencial. Los pasos importantes del procedimiento incluyen la colocación de la cánula, la concentración de la colagenasa y el tiempo de digestión, la velocidad de flujo del medio, el manejo del tejido después de la digestión, y la ultracentrifugación diferencial clásica.
La separación celular se logra por separación de los componentes del tejido conectivo después de la digestión utilizando colagenasa tipo IV. La concentración de colagenasa utilizada para la perfusión puede variar de 0,1 a 5 mg/ml. Puede haber una variación considerable de lote a lote en la eficacia de la colagenasa para la digestión de los tejidos. Se probaron concentraciones de colagenasa de 0,5 a 5 mg/ml, pero la concentración utilizada no tuvo un impacto importante en el rendimiento de los vehículos eléctricos obtenidos. El uso de una mayor concentración de colagenasa resultará en una hinchazón y blanqueamiento más rápidos del hígado. El objetivo es obtener una disociación celular satisfactoria sin contaminación excesiva ni daños. Una concentración óptima de colagenasa utilizada en estos aislamientos es de 1-2 mg/ml perfundido durante 7-8 min a un caudal de 8 ml/min. Un procedimiento de perfusión demasiado largo aumentará el riesgo de destruir el tejido conectivo delgado dentro del hígado, así como aumentar los riesgos técnicos como el despilpar de agujas de la vena porta o la captura de aire con la vena.
El aspecto más desafiante de este protocolo es la cannulación de la vena del portal. Esto puede ser difícil de realizar, especialmente en ratones en el rango de tamaño de 18 a 25 g. Las técnicas de perfusión de colagenasa fueron desarrolladas originalmente para su uso en ratas y posteriormente adoptadas para su uso en ratones después de numerosas modificaciones y ajustes. La cannulación con un conjunto de extracción de sangre 23G es más fácil que la colocación de un catéter en vasos sanguíneos de pequeño diámetro luminal. Se recomienda fijar la cánula utilizando rosca con un nudo de tapón para evitar el desalojamiento y el nudo también sirve como un marcador de ubicación de la vena del portal en caso de que la cánula salga del recipiente.
Para el análisis aguas abajo, es extremadamente importante tener una contaminación mínima de las células. Hay varias consideraciones importantes en el manejo del tejido después de la digestión. En primer lugar, los fórceps y tijeras se cambian cuando se extrae el hígado para evitar la contaminación de la sangre. En segundo lugar, es fundamental que la vesícula biliar se retire cuidadosamente del hígado para evitar desgarros y contaminación no deseada de la bilis. En tercer lugar, una vez que el hígado se ha eliminado del ratón, el hígado se lava muy suavemente usando PBS para eliminar cualquier sangre. La minimización de la contaminación con las células debe tener una mayor prioridad que la reducción del rendimiento de los vehículos eléctricos obtenidos.
La ultracentrifugación es el método más utilizado parael aislamiento y purificación de vehículos eléctricos 8,9,10,11. Este enfoque eliminará la mayoría de las células parénquimas como hepatocitos o colangiocitos y células no parenquimales como células Kupffer, células endoteliales sinusoidales y células estelares, además, los desechos celulares, las agregaciones celulares y las células muertas también serán por centrifugación diferencial. La purificación y el aislamiento adicionales de poblaciones específicas se pueden realizar mediante cromatografía de exclusión de tamaño para eliminar cualquier agregado de proteína no vesicular o lipoproteínas.
Una limitación de este protocolo es que puede no capturar todas las vesículas tisulares, dada la posibilidad de que algunas vesículas puedan ser eliminadas en el perfusato. Si se necesita una evaluación global, se debe considerar la recopilación de perfusato y el aislamiento de vesículas dentro de perfusate. Otra limitación es el potencial de daño celular. Para monitorear el impacto potencial de la muerte celular excesiva, la viabilidad celular puede ser monitoreada e incorporada dentro de los parámetros de calidad para los aislamientos de EV de tejido. En conclusión, este procedimiento describe un flujo de trabajo optimizado utilizando una técnica de perfusión de dos pasos a través de la vena porta seguida de una ultracentrifugación diferencial para obtener vehículos eléctricos de tejido hepático a partir de hígados de ratón a un alto rendimiento. Estos vehículos eléctricos tisulares son adecuados para análisis posteriores, como la caracterización de la composición biomolecular y otros estudios que tienen como objetivo caracterizar sus funciones fisiológicas o fisiopatológicas o posibles aplicaciones como marcadores de enfermedad.

Las vesículas extracelulares (EV) son vesículas unidas a la membrana que se liberan de muchos tipos diferentes de células en el cuerpo. Los vehículos eléctricos contienen una carga de moléculas que incluyen ARN, ADN y proteínas. La transferencia de esta carga por vehículos eléctricos de una célula a otra se postula como un mecanismo por el cual las células dentro de los tejidos se comunican entre sí1. La mayor parte de la información sobre la carga o las funciones de los vehículos eléctricos en la salud normal y las enfermedades se ha obtenido de estudios sobre vehículos eléctricos obtenidos de células en cultivo o recogidos de la circulación u otros fluidos corporales2. Con el fin de entender sus funciones fisiológicas in vivo, es necesario un método robusto para el aislamiento de los vehículos eléctricos de tejido que captura todas las poblaciones de vehículos eléctricos y evita el daño celular o la contaminación3. El objetivo general del método descrito aquí es aislar los vehículos eléctricos de tejido de los hígados de ratón.
La mayoría de los tipos de células en el hígado se han demostrado para producir vehículos eléctricos, y el estudio de la señalización basada en EV está avanzando en el conocimiento básico y la comprensión de las enfermedades hepáticas. Sin embargo, el impacto combinado de los vehículos eléctricos de diferentes tipos de células dentro de los tejidos sólo se entiende parcialmente. El aislamiento de los vehículos eléctricos de los tejidos hepáticos es necesario para comprender las contribuciones in situ de los vehículos eléctricos dentro del entorno del tejido. El enfoque descrito en este documento se basa en una perfusión en dos pasos para mejorar la disociación del tejido y minimizar el daño celular. Posteriormente, los vehículos eléctricos se aíslan del tejido hepático disociado. Los enfoques que utilizan perfusión en dos pasos para el aislamiento de hepatocitos se han utilizado desde principios de la década de 19504. Estos métodos para el aislamiento de hepatocitos han sido modificados y mejorados continuamente y ahora sonenfoques estándar para el aislamiento de hepatocitos en cultivos, en suspensiones celulares y de los tejidos 5,6,7. En el primer paso, el hígado se somete a una perfusión no recirculante con tampón libre de calcio, la solución salina equilibrada de Hank (HBSS). En el segundo paso, el hígado se perfunde con la colagenasa para disolver la matriz extracelular para una mayor separación de las uniones desmosómicas de célula a célula. Un tiempo óptimo de tratamiento para la disolución de la colagenasa es de 7 a 10 minutos. Una duración más corta del tratamiento causará disolución incompleta y retendrá los contactos celulares en el hígado, mientras que una duración más larga puede causar daño hepático o interrupción de la vena porta. Los vehículos eléctricos se aíslan mediante centrifugación diferencial para eliminar células y desechos celulares. Esto da como resultado la recolección de EV en altos rendimientos que se pueden utilizar para más análisis o estudios posteriores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:783px;" width="783">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:168px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB500125</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">125 mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>FB500125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Curved non-serrated scissors</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14069-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Curved forceps</td>
			<td style="width:168px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">13009-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:432px;">Masking tape</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Styrofoam pad</td>
			<td style="width:168px;">Home supply store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:168px;">Scientific inc.</td>
			<td>B1623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Masterflex L/S Digital Miniflex Pump</td>
			<td style="width:168px;">Cole-parmer</td>
			<td>ZX-07525-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Water bath</td>
			<td>Thermo Electron Precision</td>
			<td>2837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:432px;">Blood collection sets</td>
			<td style="width:168px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">367292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:432px;">Petri dish, clear lid 100x15</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon 70mm Nylon Cell Strainers</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:168px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Tipped Applicators</td>
			<td style="width:168px;">Moore medical</td>
			<td>69622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">25mL Serological Pipet</td>
			<td style="width:168px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser</td>
			<td>BioSurplus</td>
			<td>203-2751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">O2 gas</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:432px;">&#160;Levo Plus Motorized Pipette Filler</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>74020002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5804R</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-aldrich</td>
			<td>22628048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>969347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Beckman Coulter Avanti JXN-26</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B34182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">70 Ti Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">JA-25.50Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>363055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nalgene Round-bottom tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3118-0028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:432px;">Reagents</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">HyClone Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30588.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase, Type IV, powder</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of tissue extracellular vesicles from the liver

Las vesículas extracelulares (EV) pueden liberarse de muchos tipos de células diferentes y detectarse en la mayoría de los fluidos corporales, si no en todos. Los vehículos eléctricos pueden participar en la comunicación de célula a célula mediante el cierre de moléculas bioactivas como el ARN o la proteína de una célula a otra. La mayoría de los estudios de vehículos eléctricos se han realizado en modelos de cultivo celular o en vehículos eléctricos aislados de fluidos corporales. Existe un interés emergente en el aislamiento de los vehículos eléctricos para estudiar su contribución a los procesos fisiológicos y cómo se alteran en la enfermedad. El aislamiento de los vehículos eléctricos con suficiente rendimiento de los tejidos es técnicamente difícil debido a la necesidad de disociación de tejidos sin daño celular. Este método describe un procedimiento para el aislamiento de los vehículos eléctricos del tejido hepático del ratón. El método implica un proceso de dos pasos que comienza con la digestión de la colagenasa in situ seguido de la ultracentrifugación diferencial. La perfusión de tejido mediante colagenasa proporciona una ventaja sobre el corte mecánico u homogeneización del tejido hepático debido a su mayor rendimiento de los vehículos eléctricos obtenidos. El uso de este proceso de dos pasos para aislar los vehículos eléctricos del hígado será útil para el estudio de los vehículos eléctricos de tejido.

El aparato necesario para estos aislamientos comprende equipos de laboratorio estándar, lo que lo convierte en un enfoque relativamente simple y rentable. Se han realizado aislamientos de ratones Balb/c o FVB de doce a treinta semanas de edad. La bandeja que sujeta el ratón está forrada con papel de aluminio dentro de un recipiente de paredes duras que recoge el exceso de líquidos durante la perfusión. Los matraces que contienen HBSS o medio que contiene colagenasa están sumergidos en un baño de agua (40 oC) listo para ser utilizado. Se utilizan dos platos de cultivo estériles de 10 cm. Uno es necesario para el lavado de superficie con PBS, y el otro para la separación de hepatocitos de los componentes del tejido conectivo.
En este método, el hígado se perfunde de manera no continua a través de la vena porta en lugar de la cannulación de la vena cava inferior. Un enfoque de perfusión alternativo y comúnmente utilizado es realizar perfusión retrógrada mediante la cánnula de la vena cava inferior y cortar la vena porta para el drenaje. Sin embargo, la cannulación de la vena portal es de fácil acceso e implica una corta distancia al hígado, ya que la vena porta se alimenta directamente en el hígado8. La selección de un punto de inserción para la cánula es crucial para un éxito óptimo (Figura2). La cánula se coloca más allá de las ramas del estómago y las venas pancreáticas, pero no más allá de la primera rama del portal (venas porta hepáticas derecha e izquierda). Una vez identificada la ubicación de inserción óptima en la vena del portal, se utilizan fórceps curvos para colocar un hilo debajo de la vena del portal y atar un nudo suelto. La aguja de la cánula se fija con hilo utilizando un nudo de tapón para evitar que la aguja se caiga.
La Figura 3 describe el esquema de procesamiento general para la centrifugación diferencial para el aislamiento de los vehículos eléctricos de tejido hepático. La ultracentrifugación elimina las células, los desechos y otras impurezas. Los primeros cuatro pasos de centrifugación (50 x g, 300 x g, 2.000 x g, 10.000 x g) están diseñados para eliminar hepatocitos, otras células intactas, células muertas o desechos celulares respectivamente. (Figuras 4A y 4B). Después de estos pasos, la ultracentrifugación se realiza de nuevo a 100.000 x g para recoger el pellet (Figura4C). El pellet se lava resuspendiendo en PBS y sometido a una ultracentrifugación final a 100.000 x g. El pellet después de la ultracentrifugación es absolutamente visible y viscid en este procedimiento en comparación con los vehículos eléctricos de medios de cultivo acondicionados. Se requiere pipeteo muchas veces hasta que los agregados marrones estén fuera de la vista y se disuelvan por completo. El pellet final se vuelve a suspender con 1000 l de PBS (Figura4D). La ultracentrifugación elimina las impurezas y otros contaminantes solubles del plasma, lo que puede afectar los resultados experimentales funcionales. La centrifugación se lleva a cabo a 4oC.
A partir del hígado de ratón, este método produce una concentración de EV tisular que oscila entre 1,74 y 4,00 x 1012 con una media de 3,46 x 1012 partículas por ml según lo determinado por el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) (Figura 5). El tamaño medio de los vehículos eléctricos de tejido hepático aislado fue de 157,7 nm, con un tamaño de modo de 144,5 nm y tamaños EV que oscilan entre 100-600 nm por NTA. El rendimiento del EV dependerá de factores como el peso hepático y las pérdidas dentro de los pasos de perfusate o ultracentrifugación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig1.jpg"> Figura 1 : Preparación del banco. Los materiales y sus ubicaciones son: (A) bomba, (B) matraz calentado de 125 ml que contiene HBSS y puerto de aspiración de agua, (C) cono de nariz conectado a un vaporizador de isoflurano, (D) puerto de escape de agua de la bomba que se conecta con aguja, (E) bandeja forrada con papel de aluminio dentro de un vaporizador de isoflurano, (D) puerto de escape de agua de la bomba que se conecta con la aguja, (E) bandeja forrada con papel de aluminio dentro de un vaporizador de isoflurano, (D) puerto de escape de agua de la bomba que se conecta con aguja, (E) bandeja forrada con papel de aluminio dentro de un vaporizador de isoflurano, (D) puerto de escape de agua de la bomba que se conecta con aguja, (E) bandeja forrada con papel de aluminio dentro de un vaporizador de isoflurano dentro de un vaporizador de isoflur recipiente de paredes duras, y (F) plato de cultivo de 10 cm en el que el medio de colagenasa se vierte de antemano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig2.jpg"> Figura 2 : Sitio de cannulación. Se muestra la anatomía del abdomen del ratón. Usando fórceps curvos, se coloca un hilo debajo de la vena portal (PV) y se ata un nudo suelto. La ubicación de inserción está cerca del hígado, 5-10 mm por debajo de la ligadura, pero no más allá de la primera rama del portal (venas porta hepáticas izquierda y derecha). La cánula se fija o fija mediante rosca con un nudo de tapón. Este nudo sirve como un marcador de la ubicación fotovoltaica si la cánula se desaloja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig3.jpg"> Figura 3 : Esquema de pasos de centrifugación. El objetivo es eliminar las células no deseadas y otros componentes y aislar los vehículos eléctricos. Los primeros cuatro pasos de centrifugación están diseñados para eliminar hepatocitos y otras células, células muertas o desechos celulares mediante centrifugación diferencial. Después de estos pasos, la ultracentrifugación se realiza a 100.000 x g para recoger el pellet de los vehículos eléctricos. El pellet se lava resuspendiendo en PBS y sometido a una ultracentrifugación final a 100.000 x g. Todas las etapas de centrifugación se llevan a cabo a 4oC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig4.jpg"> Figura 4 : Centrifugación diferencial. (A) Después de la centrifugación a 50 x g durante 10 min, se observa un pellet que contiene hepatocitos. (B) Se utiliza un tubo de fondo redondo para la centrifugación a 10.000 x g durante 70 minutos para eliminar los restos celulares. (C) Se utiliza un tubo de ultracentrífuga de policarbonato para centrifugación a 100.000 x g durante 70 min. El pellet se recoge en un tubo y se lava mediante la re-suspensión con PBS. (D) El pellet final se vuelve a suspender en 1000 l de PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58649/58649fig5.jpg"> Figura 5 : Resultado representativo. El tamaño y la concentración de los vehículos eléctricos de tejido hepático se pueden determinar mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58649/58649fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Este es un protocolo para aislar las vesículas extracelulares del tejido (EV) del hígado. El protocolo describe un proceso de dos pasos que implica perfusión de colagenasa seguido de ultracentrifugación diferencial para aislar los vehículos eléctricos de tejido hepático.

Aislamiento de las vesículas extracelulares de tejido del hígado

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Este método puede ayudarnos a abordar preguntas clave sobre el papel de las vesículas extracelulares in vivo, proporcionándonos una fuente de vesículas que son representativas del microambiente tisular local. Los estudios de vesículas extracelulares dentro del entorno tisular pueden mejorar nuestra comprensión de las funciones fisiológicas de las vesículas extracelulares y sus alteraciones en los procesos fisiopatológicos in vivo. Una demostración visual de la cannulación de la vena porta es útil ya que el pequeño tamaño de la vena dificulta la manipulación de la vuelta.Demostrando el procedimiento con el Doctor Kaori Ishiguro estará Irene Yan, una tecnóloga de investigación de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, asegure las extremidades de un ratón anestesiado y conecte la aguja del calibre 23 de una colección de sangre alada establecida en el extremo libre de un pedazo de tubo de la bomba de jeringa. Limpie la piel abdominal del ratón con 70% de etanol y una almohadilla de alcohol y use tijeras para abrir el ratón desde la parte anterior del pecho hasta el hueso pélvico, teniendo cuidado de no dañar ningún órgano interno.Utilice un aplicador con punta de algodón para mover suavemente los intestinos hacia el lado derecho de la cavidad abdominal para exponer la vena porta y la vena cava inferior y utilizar fórceps curvos para colocar un hilo debajo de la vena porta. Ate un nudo libremente en la sutura para prepararse para el cinching después de la cannulación y llene la cánula con 40 grados Celsius HBSS hasta que la solución llegue a la punta de la aguja de la cánula. Inserte la cánula en la vena porta de cinco a 10 milímetros por debajo de la ligadura y asegure la cánula con la sutura.Inicie la perfusión a un caudal de uno a dos mililitros por minuto. Si la cánula se colocó correctamente, el hígado comenzará a blanquearse. Cortar la vena cava inferior y dejar que el líquido excesivo dentro del hígado drene.Aumente lentamente el caudal a ocho mililitros por minuto hasta que se hayan perfundido 50 mililitros completos de HBSS a través del hígado durante los próximos cinco minutos. Justo antes de que se acabe el HBSS, cambie la colagenasa de 40 grados Celsius recién preparada y utilice fórceps para aplicar presión transitoria a la vena cava inferior en intervalos de cinco segundos para hacer que el hígado se hinche y para ayudar con la digestión y la disociación de los tejidos. A medida que la digestión progresa, el hígado se hinchará y se volverá blanco.Cuando los restos estén deprimidos después de un sondeo suave con un aplicador con punta de algodón, detenga la bomba y retire la cánula. Retire la vesícula biliar del hígado, teniendo cuidado de no rasgar el tejido de la vesícula biliar, y utilizar tijeras y fórceps limpios para cosechar el hígado en un plato de cultivo estéril de 10 centímetros de PBS. Después de un lavado suave, transfiera el hígado a un nuevo plato de cultivo de 10 centímetros que contenga la solución de colagenasa fresca cuatro y use dos fórceps limpios para desgarrar el hígado mientras agita suavemente para disociar las células del tejido hepático.Cuando todo el órgano se haya fragmentado, utilice una jeringa de tres mililitros para triturar la suspensión del tejido hasta que se sacudan los trozos no digeridos del hígado. Vierta la solución celular resultante a través de un colador de malla de nylon de 70 micras en un tubo cónico de 50 mililitros, lavando el plato con HBSS para recoger las células restantes. Acople el lavado con la suspensión de una sola célula y retire los hepatocitos por centrifugación.A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros. Para eliminar cualquier otra célula, centrifugar el sobrenadante antes de transferirlo a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Retire las células muertas con otra centrifugación y transfiera el sobrenadante a un tubo de fondo redondo para eliminar los restos y agregados celulares.Ahora transfiera el sobrenadante en un tubo de policarbonato ultra centrífuga y resuspender el pellet en unos 20 mililitros de PBS para una segunda y última centrifugación ultra. A continuación, resuspender el pellet de nanovesícula extracelular en un mililitro de PBS para menos 80 grados Celsius almacenamiento si las vesículas no se analizarán inmediatamente. A partir de un solo hígado de ratón, este método produce una concentración de vesícula extracelular de tejido que oscila entre 1,74 y cuatro veces 10 y el duodécimo con una media de 3,46 veces 10 a las doce partículas por mililitro, según lo determinado por el análisis de seguimiento de nanopartículas.El tamaño medio de las vesículas extracelulares del tejido hepático aislado es de 157,7 nanómetros con un tamaño de modo de 144,5 nanómetros y vesículas extracelulares que oscilan entre 100 y 600 nanómetros por análisis de seguimiento de nanopartículas. Las vesículas extracelulares que se aíslan utilizando este enfoque son adecuadas para aplicaciones posteriores y la caracterización posterior puede incluir evaluaciones morfológicas por electromicroscopia o análisis de sus marcadores de superficie o contenido.

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