Denna metod kan hjälpa oss att ta itu med viktiga frågor när det gäller rollen av extracellulära vesiklar in vivo, genom att ge oss en källa av vesiklar som är representativa för den lokala vävnaden mikromiljö. Studier av extracellulära vesicles inom vävnaden miljön kan ytterligare vår förståelse av de fysiologiska roller extracellulära vesicles och deras förändringar i patofysiologiska processer in vivo. En visuell demonstration av portalvenen kannulation är till hjälp som den lilla storleken på venen gör det svårt att vända manipulera.
Demonstrerar proceduren med doktor Kaori Ishiguro blir Irene Yan, forskningstekniker från mitt labb. Innan du börjar proceduren, säkra lemmarna på en sövd mus och anslut 23 gauge nålen av en bevingad blodsamling inställd på den fria änden av en bit spruta pumprör. Rengör buken huden på musen med 70%etanol och en alkohol pad och använda sax för att öppna musen från främre delen av bröstet till bäckenbenet, var noga med att inte skada några inre organ.
Använd en bomull tippas applikator för att försiktigt flytta tarmarna till höger sida av bukhålan för att exponera portalvenen och sämre vena cava och använda böjda tlys för att placera en tråd under portalvenen. Knyt en knut löst i suturen för att förbereda för cinching efter kanyleringen och fyll kanylen med 40 grader Celsius HBSS tills lösningen når kanylnålsspetsen. Sätt in kanylen i portalvenen fem till 10 millimeter under ligaturen och säkra kanylen med suturen.
Starta infusionen med en en till två milliliter per minut flödeshastighet. Om kanylen var korrekt placerad, kommer levern att börja blanche. Skär den underlägsna vena cava och låt den överdrivna vätskan i levern att rinna.
Långsamt öka flödet till åtta milliliter per minut tills hela 50 milliliter HBSS har perfused genom levern under de kommande fem minuterna. Strax innan HBSS tar, ändra nyberedda 40 grader Celsius kollagenas fyra lösning på perfusate bägaren och använda tövröpningar för att tillämpa övergående tryck på sämre vena cava med fem sekunders mellanrum för att orsaka levern att svälla och för att hjälpa till med vävnad matsmältning och dissociation. Som matsmältningen fortskrider, levern kommer att svälla och bli vit.
När förblir nedtryckt efter skonsam sondering med en bomullstippad applikator, stanna pumpen och ta bort kanylen. Ta bort gallblåsan från levern, var noga med att inte riva gallblåsan vävnaden, och använda rena sax och tivor för att skörda levern i en steril 10 centimeter kultur maträtt av PBS. Efter skonsam tvätt, överför levern till en ny 10 centimeter kultur maträtt som innehåller färska kollagenas fyra lösning och använda två rena tövär för att riva levern samtidigt försiktigt skakar för att skilja cellerna från levervävnaden.
När hela organet har fragmenterat, använd en tre milliliter spruta för att triturtera vävnadsslammen tills de osmälta bitar av levern skakas av. Häll den resulterande celllösningen genom en 70 mikron nylon mesh sil i en 50 milliliter koniska röret, tvätta skålen med HBSS för att samla eventuella återstående celler. Poola tvätten med engångscellsupphängningen och avlägsna hepatocyterna genom centrifugeringen.
Överför sedan supernatanten till ett nytt 50 milliliterrör. För att avlägsna eventuella andra celler, centrifuger supernatanten före överföring till ett nytt koniskt rör på 50 milliliter. Ta bort de döda cellerna med en annan centrifugering och överför supernatanten i ett runt bottenrör för att ta bort eventuellt cellskräp och aggregat.
Överför nu supernatanten till ett polykarbonat ultracentrifugeringsrör och återanvänd pelleten i ca 20 milliliter PBS för en andra och sista ultracentrifugering. Sedan resuspend den extracellulära nanovesikel pellet i en milliliter av PBS för minus 80 grader Celsius lagring om vesiklarna inte kommer att omedelbart analyseras. Från en enda muslever ger denna metod en vävnad extracellulär vesikelkoncentration som sträcker sig från 1,74 till fyra gånger 10 till tolfte med ett medelvärde på 3,46 gånger 10 till tolfte partiklar per milliliter som bestäms av nanopartikelspårningsanalys.
Medelstorleken på den isolerade levervävnad extracellulära vesiklar är 157,7 nanometer med ett läge storlek 144,5 nanometer och extracellulära vesiklar storlekar från 100 till 600 nanometer genom nanopartikel spårning analys. De extracellulära vesiklar som isoleras med hjälp av detta tillvägagångssätt är lämpliga för tillämpningar nedströms och den ytterligare karakteriseringen kan omfatta morfologiska bedömningar genom elektromikroskopi eller analys av deras ytmarkörer eller innehåll.
