Name: nerve stem cell differentiation by a one-step cold atmospheric plasma treatment in vitro
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöds av programmet Scholar Huazhong, oberoende innovationsfonden av den Huazhong universitet av vetenskap och teknik (nr 2018KFYYXJJ071) och den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (nr 31501099 och 51707012).

1. cell kulturer och Predifferentiation
<ol><li>
Neurala stamceller kultur och predifferentiation
	<ol>
<li>Förbereda poly-D-lysin-coated coverslips. Sätta ett sterilt täckglas (20 mm i diameter) i en 12-bra platta. Coat täckglaset med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vatten (Tabell för material) för bättre celladhesion på coverslips genom att följa nästa steg. Obs: Optimala förhållanden måste bestämmas för varje cell fodrar och program.<ol>
<li>Aseptiskt belägga ytan av t?...

<ol>
	<li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+neural+stem+cells.">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).</li><li>Rossi, F., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+therapy+for+neurological+diseases:+dreams+and+reality.">Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality.</a> Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).</li><li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+redox+biology+and+some+implications+for+plasma+applications+to+medicine+and+biology.">The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).</li><li>Weltmann, K. D., von Woedtke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+medicine-current+state+of+research+and+medical+application.">Plasma medicine-current state of research and medical application.</a> Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).</li><li>Lloyd, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+Plasma:+Medical+Uses+and+Developments+in+Wound+Care.">Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care.</a> Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).</li><li>Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+plasmas+at+atmospheric+pressure:+toward+new+pharmaceutical+treatments+in+medicine.">Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine.</a> Fundamental &amp; Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).</li><li>Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Treatment+of+Onychomycosis.">Plasma Treatment of Onychomycosis.</a> Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).</li><li>Xiong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+differentiation+of+neural+stem+cells+induced+by+nanosecond+microplasma+agitation.">Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation.</a> Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).</li><li>Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Culture+and+Identification+of+Neural+Stem+Cells+in+New-born+Rats.">Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats.</a> Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).</li><li>Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+multipotent+neural+cell+lines+using+retrovirus+vector-mediated+oncogene+transfer.">Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer.</a> Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MRS+VII+mouse+brain.">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain.</a> Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Fixatives+for+Immunostaining.">Cell Fixatives for Immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).</li><li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeabilization+of+Cell+Membranes.">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li></ol>

C17.2-Karolina är en typ av förevigade neurala stamceller linje från neonatal mus cerebellär korniga lagret celler, utvecklat av Snyder och andra10,11. C17.2-Karolina kan differentieras till nervceller, astrocyter och oligodendrocyter och används allmänt i neurovetenskap12. I vår tidigare studie kunde CAPs förbättra differentieringen av C17.2-Karolina till nervceller. En proof-of-principle studie genomfördes också använda prim?...

Dirigerad differentiering av Karolina in en viss utvecklingslinje för vävnad transport anses vara en av de mest lovande behandlingar för neurodegenerativa och neurotraumatic sjukdomar1. Exempelvis önskas catecholaminergic dopaminerga neuron särskilt i Parkinsons sjukdom (PD) behandling. Traditionella metoder för att förbereda önskad cellerna för transport har dock många nackdelar, såsom kemisk toxicitet, ärrbildning, eller andra, som i hög grad hämmar tillämpningar av Karolina i regenerativ medicin2. Därför är det mycket nödvändigt att hitta en ny och säkert sätt för NSC differentiering.
Plasma är den fjärde delstaten frågor, följande fasta, flytande och gas, och det utgör mer än 95% av frågor i hela universum. Plasma är elektriskt friläget med obundna positiva/negativa och neutrala partiklar och genereras vanligtvis av en hög spänning urladdning i labbet. Under de senaste två decennierna, har tillämpningen av plasma i biomedicin uppmärksammats enormt världen över som utvecklingen av kall atmosfärstryck plasma-teknik. Tack vare detta technic, stabilt låg temperatur plasma kan genereras i den omgivande luften på atmosfär utan arc bildande och består av olika reaktiva arter, såsom reaktiva kväve arter (RNS), reaktiva syreradikaler (ROS), ultraviolett (UV) strålning, elektroner, joner och elektriska fält3. CAPs har unika fördelar för mikroorganismen inaktivering, cancerbehandling, sårläkning, behandling av hudsjukdomar, cellproliferation och cell differentiering4,5,6,7. I tidigare arbete visade vi att kalla atmosfärsplasma jet kan förbättra differentieringen av Karolina i både murina neurala stamceller C17.2 (C17.2-Karolina) och primära råtta neurala stamceller, uppvisar en stor potential att bli ett kraftfullt verktyg för den riktade differentiering av Karolina8. Även om mekanismen av CAP förbättring av NSC differentiering inte är helt klarlagt ännu, nr genereras av CAPs har visat sig vara en viktig faktor i processen. I detta arbete, vi strävar efter att tillhandahålla en detaljerad experimentellt protokoll för att använda ett atmosfäriskt tryck helium och oxygen plasma jet för behandling av Karolina i vitro, cell förberedelse och förbehandling, morfologi observation av inverterade mikroskopet, och Fluorescence mikroskopi observation av immunofluorescens färgning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:123px;">NEST</td>
			<td style="width:344px;">801008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-lysine</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30022.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Donor Horse serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30074.03</td>
			<td>tored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>25300054</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS solution</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30256.01B</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0098</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TritonX-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Normal Goat Serum Blocking Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000-20</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-Nestin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>AF2215</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-&#946;-Tubulin III</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-O4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1326</td>
			<td>stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">anti-NF200</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">anti-ChAT</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">anti- LHX3</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-GABA</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-Serotonin</td>
			<td style="width:123px;">Abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-TH</td>
			<td style="width:123px;">Abcam, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;">stored at -20 &#176;C, avoid repeated freezing and thawing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0103</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0516</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488- Labeled Goat</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>A0428</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-well plate</td>
			<td>corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 cm2 flask</td>
			<td>corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33258</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C1018</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting medium</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0128</td>
			<td>stored at -20 &#176;C and protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td>
			<td>XD-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>80i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High &#8211; voltage Power Amplifier</td>
			<td>Directed Energy</td>
			<td>PVX-4110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DC power supply</td>
			<td>Spellman</td>
			<td>SL1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Function Generator</td>
			<td>Aligent&#160;</td>
			<td>33521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oscilloscope</td>
			<td style="width:123px;">Tektronix</td>
			<td style="width:344px;">DPO3034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High voltage probe</td>
			<td style="width:123px;">Tektronix</td>
			<td style="width:344px;">P6015A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nerve stem cell differentiation by a one-step cold atmospheric plasma treatment in vitro

Utvecklingen av fysiska plasma-teknik, kall atmosfäriska plasmor (CAPs) har undersökts allmänt i sanering, cancerbehandling, sårläkning, behandling rotfyllning, etc., bildar ett nytt forskningsfält kallas plasma medicin. Att vara en blandning av elektriska, kemiska och biologiska reaktiva arter, CAPs har visat sin förmåga att förbättra nerv stamceller differentiering både in vitro- och in-vivo och är att bli en lovande väg för neurologisk sjukdomsbehandling i framtiden. Den mycket mer spännande nyheten är att använda CAPs kan förverkliga ett steg, och säkert regisserad, differentiering av neurala stamceller (Karolina) för vävnad transport. Här visar vi detaljerade experimentella protokoll använder en self-made CAP jet-enhet för att förbättra NSC differentiering i C17.2-Karolina och primära råtta neurala stamceller, och att observera cell ödet av inverterad samt fluorescensmikroskopi. Med hjälp av immunofluorescens färgning teknik, Vi hittade både de Karolina visade en accelererad differential än den obehandlade gruppen och ~ 75% av Karolina differentieras selektivt efter nervceller, som är främst mogen, kolinerga och motor neuroner.

Cellmorfologi observerades under inverterade mikroskopet varje dag efter CAP behandling. Figur 2 visar vanliga inverterad fas-kontrast ljusmikroskop bilder av celldifferentiering i både cellinjer. Den plasma-behandlade gruppen uppvisar en accelererad differentiering och -grad en hög differentiering jämfört med gruppen kontroll och gas flöde.
Immunofluorescerande resultaten av ...

Watch this Scientific Journal Video about Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro at JoVE.com

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Nerv stamcellers differentiering av en One-step kalla atmosfärsplasma behandling In Vitro

Detta protokoll syftar till att ge detaljerade experimentella steg i en kall atmosfärsplasma behandling på neurala stamceller och immunofluorescens upptäckt för differentiering förbättring.

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

Denna metod har potential att förstärka differentiering av neurala stamceller in vitro och att bidra till behandling av neurologisk sjukdom såsom Parkinsons sjukdom. De största fördelarna med denna teknik är att de kalla atmosfäriska plasma kan tillämpas i ett steg för en säker riktad differentiering av neurala stamceller för vävnadstransplantation. Kall atmosfärisk plasma kan förstärka neurala stamceller differentiering inom en kort behandlingsperiod.Och med behöver mer skada på cellerna, vilket ger de önskade cellerna för transplantation. Börja med att så omkring fem gånger tio till den femte murin neurala stamceller i en 25 centimeter kvadrat kolv. Innehåller fem milliliter av komplett DMEM för två till tre dagar vid 37 grader celsius och fem procent koldioxid.När cellerna når 85 procent konfluency, tvätta kulturen med en milliliter PBS. Före behandling, med en milliliter på 25 procent trypsin i en minut. När cellerna har lossnat, stoppa reaktionen med en milliliter av odlingsmedium.Och pipettera flera gånger för att generera en enda cell suspension. Efter räkning, späd cellerna till en två gånger tio till den fjärde celler per milliliter koncentration. Utsäde en milliliter stamceller på en poly-D-lysin belagda täcka slip per brunn i nio brunnar av en 12 cellodling tallrik.Kontrollera celltätheten under ett mikroskop. Och återför cellerna till inkubatorn i 12 timmar. När cellerna har fäst, tvätta locket glider två gånger med en milliliter PBS per tvätt, och behandla cellerna med differentiering medium i 48 timmar.För jet förvärv, först ansluta utgående tråd av strömförsörjningen till plasmastrålen enheten. Och spetsen på högspänningssonden med utmatningstråden för att upptäcka spänningen. Anslut sedan den andra änden av högspänningssonden till oscilloskopet för att registrera informationen från utspänningen.Kontrollera hela kretsen för att se till att strömförsörjningen, oscilloskopet och högspänningssonden alla är jordade. Och kontrollera gasledningen för att se till att gasröret är anslutet till plasmastråleapparaten. Därefter öppnar helium och syre gasventiler och ställ in gasflödet till en en liter till 01 liter per minut förhållandet mellan helium och syre.Kontrollera kretsen igen och tryck på utmatningsknappen för att skapa en plasmastråle. För att plasmabehandla de neurala stamcellerna, ställ in avståndet mellan sprutmunstycket och den första brunnen av celler till 15 millimeter. Byt ut supernatanterna i de neurala stamcellskulturerna mot 800 mikroliter av färskt differentieringsmedium.Och placera plattan under plasmastrålarna. Se till att sprutmunstycket är fast över mitten av varje brunn. Skapa tre brunnar med plasma i 60 sekunder per behandling, och tre brunnar med en procent helium och syregas i 60 sekunder per behandling.Lämnar tre brunnar obehandlade, som kontroller. Byt sedan ut supernatanterna mot en milliliter av färskt differentieringsmedium. Och återför cellerna till inkubatorn i sex dagar.Kontrollera differentieringsstatusen för de olika grupperna dagligen, under ett inverterat faskontrastljusmikroskop. Efter behandlingen, låt cellerna helt ekvilo i tillståndsmediet i ungefär en timme innan du ersätter supernatanten med nytt differentieringsmedium. För immunofluorescensanalys, fixera kulturerna med 500 mikroliter av fyra procent paraformaldehyd per brunn under 20 minuter vid rumstemperatur.Följt av tre milda fem minuters sköljningar, med en milliliter PBS per tvätt. Därefter permeabilize de fasta proverna med 2 procent Triton X-100 i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur. Följt av mild sköljning som visats.Efter den sista tvätten, blockera eventuell icke specifik bindning med en milliliter av 10 procent getserum i PBS per prov under en timme vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen, märka cellerna i varje brunn med 300 mikroliter av den primära antikroppen av intresse över natten vid fyra grader celsius. Följt av tre tvättar i PBS som visats.Efter den sista tvätten, märka cellerna med 300 mikroliter av lämpliga sekundära antikroppar. Inkubera i två timmar i rumstemperatur, skyddad från ljus. Skölj sedan cellerna försiktigt med en milliliter PBS per brunn i tio minuter i rumstemperatur.Bild cellerna på ett fluorescensmikroskop utrustad med lämpliga filter. Plasmabehandlade neurala stamceller uppvisar en accelererad differentieringshastighet, och ett högre differentieringsförhållande jämfört med obehandlad kontroll, och gasflödesbehandlade stamceller. Efter plasmabehandling minskar Nestin.Beta-Tubulin III ökar avsevärt. Och O4 ökar något, jämfört med kontrollbehandlade och gasflöde behandlade stamceller. Vidare, efter 60 sekunder av plasmabehandling, observeras ett robust uttryck för mogen neuron, kolinerga neuron, och motor neuron markörer.Med mycket få GABAergic och serotonergic nervceller, och inga dopaminerga nervceller upptäcks. Medan du försöker dessa förfaranden, Det är viktigt att komma ihåg, behandla cellerna med rätt plasma dosering, eftersom en lång och intensiv plasma behandlingsperiod kommer att inducera cell apoptos eller nekros. Kom ihåg att även förtesta cellens viabilitet innan applikationen nedströms.

Research

JoVE Journal

Engineering

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

Investigation of Early Plasma Evolution Induced by Ultrashort Laser Pulses

Undersökning av Tidig Plasma Evolution inducerad av ultrakorta laserpulser

Early plasma is generated owing to high intensity laser irradiation of target and the subsequent target material ionization. Its dynamics plays a ...

Measurement of Coherence Decay in GaMnAs Using Femtosecond Four-wave Mixing

The application of femtosecond four-wave mixing to the study of fundamental properties of diluted magnetic semiconductors ((s,p)-d hybridization, ...

How to Ignite an Atmospheric Pressure Microwave Plasma Torch without Any Additional Igniters

Hur Ignite ett atmosfärstryck Mikrovågsugn Plasma Torch utan ytterligare Tändstiften

This movie shows how an atmospheric pressure plasma torch can be ignited by microwave power with no additional igniters. After ignition of the plasma, a ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

In vitro-odling av epikardiella celler från mus embryonala hjärta

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Applying X-ray Imaging Crystal Spectroscopy for Use as a High Temperature Plasma Diagnostic

Tillämpa X-ray Imaging Crystal spektroskopi för användning som en hög temperatur plasma Diagnostic

X-ray spectra provide a wealth of information on high temperature plasmas; for example electron temperature and density can be inferred from line ...

An Atmospheric Pressure Plasma Setup to Investigate the Reactive Species Formation

Atmosfärstryck Plasma Setup för att undersöka de reaktiva artbildning

Non-thermal atmospheric pressure (&#39;cold&#39;) plasmas have received increased attention in recent years due to their significant biomedical potential. ...

Ice Generation and the Heat and Mass Transfer Phenomena of Introducing Water to a Cold Bath of Brine

Is Generation och värmen och masstransport Fenomen av införande av vatten till ett kallt bad saltlösning

We demonstrate a method for the study of the heat and mass transfer and of the freezing phenomena in a subcooled brine environment. Our experiment showed ...

Spark Plasma Sintering Apparatus Used for the Formation of Strontium Titanate Bicrystals

Spark Plasma Sintring apparat som används för bildandet av strontium titanate Bicrystals

A spark plasma sintering apparatus was used as a novel method for diffusion bonding of two single crystals of strontium titanate to form bicrystals with ...

New Application of an Atmospheric Pressure Plasma Jet as a Neuro-protective Agent Against Glucose Deprivation-induced Injury of SH-SY5Y Cells

Ny tillämpning av ett atmosfäriskt tryck Plasma Jet som neuroskyddande Agent mot glukos Deprivation-inducerad skada av SH-SY5Y celler

The atmospheric pressure plasma jet (APPJ) has attracted the attention of many researchers from multiple disciplines in recent years because its emissions ...

Atmospheric Pressure Fabrication of Large-Sized Single-Layer Rectangular SnSe Flakes

Atmosfäriskt tryck tillverkning av stora lager rektangulära SnSe flingor

Tin selenide (SnSe) belongs to the family of layered metal chalcogenide materials with a buckled structure like phosphorene, and has shown potential for ...