הדור של מהגרים תימיים שמקורם ב- iPSC על ידי תרבות איברים תימית תלת מימדית הוא הראשון בשיטת vivo המתחדשת אוכלוסייה הומוגנית של תאי T דמויי אנטיגן סרטניים. היתרונות העיקריים הם iTE הם רלוונטיים יותר פיזיולוגית, שיטה זו יותר הוא חזק יותר מאשר כל שיטה דיפרנציאלית vivo אחרים לייצר כל הזמן תאי T ספציפיים. iTE הוא נסער הומוגנית של CD8 אלפא בטא אנטי genous תאים ספציפיים T עם פנוטיפ פונקציונלי נאיבי דמוי תא T, כולל היכולת של התפשטות, remodiformation, ודיכוי הגידול ב vivo.
הדגמת ההליך תהיה ד"ר רפיקול איסלאם פוסט-דוקטורט במעבדה שלי. כדי להתחיל את תרבות OP9/DLL1 תאים במדיה OP9 ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מגיעים 80 עד 95 אחוז confluency, לשטוף אותם פעם אחת עם אחד X מגנזיום, סידן, פנול אדום חינם PBS.
מוסיפים ארבעה מיליליטר של נקודה אפס חמישה אחוזים טריפסין ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של מדיה OP9 pipet כדי לנתק את שכבת התא ולעשות השעיה תא יחיד. העבר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר דרך מסננת תא 100 מיקרומטר.
צנטריפוגה ב 300 G וב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. שאף את ההשעיה מחדש של התאים ב-12 מיליליטר של מדיה OP9. ואז צלחת שני מיליליטר של ההשעיה התא OP9 / DLL1 לתוך צלחת חדשה 10 ס"מ תאים פטרי.
הוסף שמונה מיליליטר נוספים של מדיה OP9. חזור על קטע זה כל יומיים עד שלושה ימים. ביום אפס לקצור את תאי גזע pluripotent המושרה כמו השעיה תא יחיד על ידי טריפסיניזציה.
לאסוף את התאים ואת הצנטריפוגה ב 300 G בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. שאפו את העל-טבעי והשעו מחדש את ה-IPC's בצפיפות של 100,000 תאים לכל 10 מיליליטר של מדיה OP9. לאחר מכן צלחת 100, 000 תאים על צלחת OP9 / DLL1 קונפלנטית 10 ס"מ.
המשך הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני. ביום השלישי שאף את המדיה הישנה והחלף אותה ב-10 מיליליטר של מדיה חדשה של OP9. ביום השישי לשטוף כל 10 ס"מ confluent OP9 צלחת עם 10 מיליליטר של PBS.
מוסיפים שלושה מיליליטר של נקודה אפס חמישה אחוזים טריפסין לכל מנה. ודגירה במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיליליטר של מדיה OP9 בעדינות pipet כדי לאסוף את התאים.
מעבירים את התאים דרך מסננת תאים מיקרומטר 100 וצנטריפוגה ב 300 G ו ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. ואז להשליך את העל-טבעי. להשעות מחדש את התאים ב 10 מיליליטר של מדיה ההידול.
צלחת ההשעיה התא על צלחת חדשה 10 ס"מ OP9 / DLL1 confluent. המשך הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני. ביום התשיעי, שאף את התקשורת הישנה והחלף אותה ב-10 מיליליטר של אמצעי תקשורת טריים.
המשך דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים CO2. ביום 11 כאשר קרדיומיוציטים נצפו במושבות iPSC להשתמש pipet כדי לנתק באופן מכני תאים שאינם חסידים. מסננים את התאים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-300 ג'י וארבע מעלות במשך חמש דקות.
לאחר מכן, שאף את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-24 מיליליטר של אמצעי מידול. צלחת iPSC של לתוך OP9/ DLL1 confluent שש צלחת גם. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני.
ביום 15, לאסוף את כל התאים שאינם חסידים ולסנן אותם דרך מסננת תאים 40 מיקרומטר. צנטריפוגה ב 300 G וב 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. המשך להעביר את התאים שאינם חסידים כל שלושה עד ארבעה ימים כפי שתואר קודם לכן.
ביום השביעי של טיפול DGWO, להוציא ארבע מנות חדשות 10 ס"מ. מלאו כל מנה ב-20 מיליליטר של מדיה שלמה. מעבירים את כל קרום הניטרוסלולוס עם האונות התימיות לתבשיל אחד באורך 10 ס"מ.
באמצעות מדפים, לנתק את האונות הבודדות מן הממברנה המאפשר להם להיות שקועים בתקשורת. הדגירה את האונות במשך שעה בטמפרטורת החדר. ואז להעביר את האונות התימית לצלחת חדשה 10 ס"מ עם מדיה מלאה.
ותתגרה במשך שעה בטמפרטורת החדר. חזור על העברה זו ודגירה פעמיים נוספות. באמצעות ממטרים, לתקן את האונות התימית לצלחת תוך שימוש ביד השנייה כדי להפוך חתך עמוק 100 עד 200 מיקרומטר במרכז ולהרחיב מחצית קוטר האונה כדי להקל על נדידת אבי התא T לתוך האונה.
מעבירים את האונות התימיות לתבשיל חדש באורך 10 ס"מ מלא במדיית הידול מוחלטת. אם אתם משתמשים בצלחות תרבות תלת-מימדיות ברשתות ברמה התחתונה והעליונה, מלאו את שתי הרשתות ב- PPS סטרילי כדי למנוע אידוי וייבוש של הטיפות התלויות. ההעברה הבאה 30 microliters של מדיה מלאה המכילה אחד DGWO טיפלו האונה התימית לתוך כל באר של צלחת התרבות 3D.
אסוף את תאי השושלת T שאינם חסידים מתרבות ה- OP9/DLL1. ולהשעות מחדש את התאים בצפיפות של 2, 000 עד 5, 000 תאי שושלת תאים לכל 20 מיקרוליטרים של מדיה. הוסף 20 microliters של ההשעיה תא שושלת T לכל האונה התימית בצלחת התרבות 3D.
דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני. למחרת, להגדיר את צינור P200 ל 30 microliters. צינור התקשורת בכל באר למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להסיר את כל התאים המקיפים את האונות התימית.
לאחר מכן שאף את המדיה מכל באר והחלף אותה ב-30 מיקרוליטרים של מדיה שלמה. חזור על תהליך זה, pipeting, הסרה, והחלפת המדיה חמש עד שבע פעמים כדי להסיר את כל תאי T בשלים נוספים אשר אינו נודד לתוך האונות. המשך דגירה האונות, הקפד לשנות 25 עד 30 microliters של מדיה מדי יום.
ביום הרביעי או החמישי, השתמש במיקרוסקופיה קלה כדי לאשר היווצרות של הילה של מהגרים תימיים שמקורם ב- iPSC סביב האונות. אסוף את ה-iTE מדי יום על ידי צינורות מדיה ללא הפרעה באונה. לשנות את המדיה כל יום ולהמשיך את האוסף עד כ 12 ימים.
iTE's שנקטפו מוכנים לשימוש לניתוח מולקולרי או לניסויים בהשתלת vivo. במחקר זה, תימוס עוברי בתרבות שותף מנותחים כדי לנתח אם תאי שושלת תאי T שמקורם ב- iPSC יכולים לנדוד לתוך האונות התימית. אונות בקרה ללא זרעים יש ארכיטקטורת רקמות המאופיינת על ידי אינטרנט אפיתל תימי דמוי אסטרוציטים פרוס של תאים חיוביים CD3 אנדוגני.
עם זאת האונות התימית זרע עם תאי T בשלים iPSC נגזר מאוכלסים מחדש עם CD3 תאים mononuclear חיובי המציין הגירה של תאי T בשלים iPSC נגזר לתוך האונות. תאי T הנודדים לתוך, ובוגרים, בתוך microenvironment התימית לאחר מכן יציאה כמו iTE. ניתוח ציטומטרי זרימה משמש לאחר מכן כדי לבדוק את האפיון הפנוטיפי של תאים שונים.
תאי T תימיים נוספים מציגים CD4, CD8 תאי T חיוביים כפולים ותאי T חיוביים בודדים מסוג CD8 אלפא ללא ביטוי של סמן הבחירה החיובי, MHC Class One ואילו iTE הם אוכלוסייה הומוגנית של CD8 אלפא חיובי יחיד MHC Class T חיובי T תא פנוטיפ המציין את המעבר המוצלח שלהם דרך בחירה חיובית לפני יציאה מן האונה התימית. ל-iTE יש ספציפיות אנטיגן נגד פפטיד קוגנטי. iTE מתורבתת עם תאים מציגים אנטיגן טעון מראש עם פפטיד לא רלוונטי כמו nucleoprotein אינם מראים לתוך ייצור תאי של ציטוקינות.
עם זאת iTE שיתוף תרבות אנטיגן הצגת תאים מראש פעמו עם קוגנט פפטיד GP100, לייצר אינטרלוקין אלפא TNF תאי ii ו אינטרפרון גמא. זכור שתרבות תאים של קו פתוח תלויה מאוד בחריץ ABS. iTE שנוצר יכול לשמש בכל מוצג אחר עובד עם תאי T קונבנציונליים.
לדוגמה, T cell ניקוי מבחנים, מוסט ייצור ציטוקיני, בניסויים רגרסיה גידול vivo, מחקר התברות תא T, וכו '. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על פרויקטים אימונולוגיים רבים או כאלה. כולל התביור תא T, תזמון דופק T התבגרות התא, ואת הדור של תא T ספציפי אנטיגן מן ההמטוקריט הצאצאים או תא גזע.
לאחר צפייה בסרטון זה הצופה צריך להבין כיצד ליצור pluripotent המושרה, תא גזע נגזר, גידול אנטיגן ספציפי מהגרים תימיים באמצעות מערכת תרבות איברים תימי 3D.
