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August 9th, 2019
DOI :
August 9th, 2019
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Title
0:57
Preparation of OP9/DLL1 Cells for Co-culture with iPSC
2:08
In Vitro Differentiation of iPSC into Immature T Cells
5:00
3D Thymic Organ Culture to Generate iTE
8:00
Results: Generation of Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants
9:46
Conclusion
Transcript
3 डी थाइमिक ऑर्गन कल्चर द्वारा आईपीएससी-व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों की पीढ़ी वीवो विधि में पहली बार ट्यूमर एंटीजन-विशिष्ट भोली-जैसी टी कोशिकाओं की समरूप आबादी को पुनर्जीवित करती है। मुख्य फायदे हैं आईटीई अधिक शारीरिक प्रासंगिक हैं, और यह विधि अधिक शक्तिशाली है, इसलिए वीवो अंतर विधि में किसी भी अन्य को लगातार एक विशिष्ट टी कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए। iTE एक भोले टी सेल की तरह कार्यात्मक फेनोटाइप के साथ सीडी 8 अल्फा-बीटा एंटी-जेनस विशिष्ट टी कोशिकाओं से सजातीय परेशान है, जिसमें प्रसार, पुनर्मोदीचना और वीवो में ट्यूमर दमन की क्षमता शामिल है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉक्टर रफीकुल इस्लाम मेरी प्रयोगशाला में एक के बाद डॉक्टर होगा । ३७ डिग्री सेल्सियस पर OP9 मीडिया में संस्कृति OP9/DLL1 कोशिकाओं को शुरू करने के लिए । जब कोशिकाएं 80 से 95 प्रतिशत तक पहुंच जाती हैं, तो उन्हें एक एक्स मैग्नीशियम, कैल्शियम और फिनॉल रेड फ्री पीबीएस के साथ एक बार धोएं।
प्वाइंट शून्य पांच प्रतिशत ट्राइपसिन के चार मिलीलीटर जोड़ें और पांच मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । फिर सेल लेयर को असंबद्ध करने और एकल सेल निलंबन बनाने के लिए ओपी 9 मीडिया और पिपेट के चार मिलीलीटर जोड़ें। सेल सस्पेंशन को 100 माइक्रोमीटर सेल छन्नी के माध्यम से 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें।
३०० जी पर सेंट्रलाइज और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर । OP9 मीडिया के 12 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और फिर से निलंबित करें। फिर एक नए 10 सेंटीमीटर सेल कल्चर पेट्री डिश में OP9/DLL1 सेल सस्पेंशन के दो मिलीलीटर प्लेट करें ।
OP9 मीडिया के एक अतिरिक्त आठ मिलीलीटर जोड़ें । इस पैसेज को हर दो से तीन दिन में दोहराएं। दिन शून्य फसल पर ट्राइपसिनाइजेशन द्वारा प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल को एकल सेल निलंबन के रूप में।
कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र पर ३०० जी पर पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर ले लीजिए । सुपरनेट को एस्पिरेट करें और ओपी9 मीडिया के 10 मिलीलीटर प्रति 100, 000 कोशिकाओं के घनत्व पर आईपीसी को फिर से निलंबित करें। तो एक ढुलमुल OP9/DLL1 10 सेंटीमीटर पकवान पर १००, 000 कोशिकाओं की थाली ।
पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जारी रखें । तीन दिन पुराने मीडिया आकांक्षी और ताजा OP9 मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ बदलें । दिन छह पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक 10 सेंटीमीटर ढुलमुल OP9 पकवान धोने ।
प्रत्येक पकवान के लिए बिंदु शून्य पांच प्रतिशत ट्रिपसिन के तीन मिलीलीटर जोड़ें। और कमरे के तापमान पर तीन से पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट । ओपी 9 मीडिया के चार मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।
कोशिकाओं को 100 माइक्रोमीटर सेल छन्नी और सेंट्रलाइज के माध्यम से 300 ग्राम और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पास करें। इसके बाद सुपरनेट को त्याग दें। भेदभाव मीडिया के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें ।
एक नया 10 सेंटीमीटर OP9/DLL1 ढुलमुल पकवान पर सेल निलंबन प्लेट । पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जारी रखें । नौ दिन, पुराने मीडिया आकांक्षी और यह ताजा भेदभाव मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ बदलें ।
कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस और पांच प्रतिशत CO2 पर इनक्यूबेटिंग जारी रखें । 11 दिन जब आईपीएससी कॉलोनियों में कार्डियोमायोसाइट्स मनाए जाते हैं तो यांत्रिक रूप से गैर-अनुयायी कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करते हैं। कोशिकाओं को 100 माइक्रोमीटर सेल छन्नी और सेंट्रलाइज के माध्यम से 300 ग्राम और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस के माध्यम से फ़िल्टर करें।
इसके बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और भेदभाव मीडिया के 24 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्लेट एक ढुलमुल OP9/DLL1 छह अच्छी तरह से थाली में है iPSC है । कोशिकाओं को पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ।
15 दिन, सभी गैर-अनुयायी कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 40 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। सेंट्रलाइज 300 जी पर और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर। पहले वर्णित हर तीन से चार दिनों में गैर-अनुयायी कोशिकाओं को पास करना जारी रखें।
डीजीडब्ल्यूओ उपचार के सात दिन, चार नए 10 सेंटीमीटर व्यंजन बाहर ले जाएं। प्रत्येक डिश को 20 मिलीलीटर पूर्ण मीडिया के साथ भरें। थाइमिक लोब्स के साथ नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के सभी एक 10 सेंटीमीटर पकवान में स्थानांतरित करें।
संदंश का उपयोग करके, झिल्ली से व्यक्तिगत लोब्स को अलग करें जिससे उन्हें मीडिया में जलमग्न होने की अनुमति मिल सके। कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए लोब्स को इनक्यूबेट करें। फिर थिमिक लोब्स को पूर्ण मीडिया के साथ एक नए 10 सेंटीमीटर डिश में स्थानांतरित करें।
और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट। इस स्थानांतरण को दोहराएं और दो बार अतिरिक्त इनक्यूबेशन। संदंश का उपयोग करना, दूसरे हाथ का उपयोग करते हुए केंद्र में 100 से 200 माइक्रोमीटर गहरा चीरा बनाने के लिए और लोब में टी सेल जनक प्रवास की सुविधा के लिए पालि के आधे व्यास का विस्तार करते हुए पकवान के लिए थाइमिक लोब्स को ठीक करें।
थाइमिक लोब्स को पूर्ण विभेदन मीडिया से भरे एक नए 10 सेंटीमीटर पकवान में स्थानांतरित करें। यदि निचले और ऊपरी स्तर के ग्रिड के साथ 3 डी संस्कृति प्लेटों का उपयोग कर रहे हैं, तो फांसी की बूंदों के वाष्पीकरण और सूखने को रोकने के लिए दोनों ग्रिडों को स्टरल पीपीएस से भरें। अगला स्थानांतरण पूर्ण मीडिया के 30 माइक्रोलीटर जिसमें एक डीजीडब्ल्यूओ ने 3 डी संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में थाइमिक पालि का इलाज किया।
OP9/DLL1 सह संस्कृति से गैर-अनुयायी टी वंश कोशिकाओं को इकट्ठा करें। और मीडिया के 20 माइक्रोलीटर प्रति 2, 000 से 5, 000 टी सेल वंश कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 3 डी कल्चर प्लेट में प्रत्येक थाइमिक पालि में टी वंश सेल निलंबन के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें।
रात भर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर पांच प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ इनक्यूबेट । अगले दिन, 30 माइक्रोलीटर के लिए P200 पिपेट सेट करें। थाइमिक लोब्स के आसपास की सभी कोशिकाओं को हटाने के लिए कई बार प्रत्येक अच्छी तरह से ऊपर और नीचे मीडिया को पिपेट करें।
फिर प्रत्येक कुएं से मीडिया को आकांक्षी करें और इसे पूर्ण मीडिया के 30 माइक्रोलीटर की जगह लें। इस प्रक्रिया को दोहराएं, पिपटिंग करें, हटाएं और मीडिया को पांच से सात बार प्रतिस्थापित करें ताकि किसी भी अतिरिक्त अपरिपक्व टी कोशिकाओं को हटाया जा सके जो लोब्स में माइग्रेट नहीं होता है। लोब्स को इनक्यूबेटिंग जारी रखें, जिससे रोजाना मीडिया के 25 से 30 माइक्रोलीटर बदलना सुनिश्चित हो सके ।
चार या पांच दिन, लोब्स के चारों ओर आईपीएससी-व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों के प्रभामंडल के गठन की पुष्टि करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। लोब व्यवधान के बिना मीडिया को पिपिंग करके iTE के दैनिक को इकट्ठा करें। हर दिन मीडिया बदलें और लगभग 12 दिनों तक संग्रह जारी रखें।
काटा iTE आणविक विश्लेषण के लिए या वीवो प्रत्यारोपण प्रयोगों में उपयोग करने के लिए तैयार हैं । इस अध्ययन में, सह-संस्कारी भ्रूण थाइमस को यह विश्लेषण करने के लिए अनुभागित किया जाता है कि क्या आईपीएससी व्युत्पन्न टी सेल वंश कोशिकाएं थाइमिक लोब्स में स्थानांतरित हो सकती हैं। संयुक्त राष्ट्र-वरीयता प्राप्त नियंत्रण लोब्स में एक ऊतक वास्तुकला होती है जो अंतर्जात सीडी 3 सकारात्मक कोशिकाओं के तैनात एस्ट्रोसाइट जैसे थाइमिक एपिथेलियल वेब की विशेषता होती है।
हालांकि आईपीएससी व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त थाइमिक लोब्स को सीडी 3 सकारात्मक मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के साथ फिर से आबाद किया जाता है जो आईपीएससी व्युत्पन्न अपरिपक्व टी कोशिकाओं के लोब्स में प्रवास का संकेत देते हैं। टी कोशिकाएं जो थाइमिक माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर माइग्रेट होती हैं, और परिपक्व होती हैं, बाद में आईटीई के रूप में पीछे हटती हैं। इसके बाद फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण का उपयोग विभिन्न कोशिकाओं के फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन का परीक्षण करने के लिए किया जाता है।
अतिरिक्त थाइमिक टी कोशिकाओं सीडी 4, सीडी 8 डबल सकारात्मक टी कोशिकाओं और सीडी 8 अल्फा एकल सकारात्मक टी कोशिकाओं सकारात्मक चयन मार्कर, MHC वर्ग एक की अभिव्यक्ति के बिना दिखाते हैं, जबकि iTE सीडी 8 अल्फा एकल सकारात्मक MHC वर्ग एक सकारात्मक टी सेल फेनोटाइप की एक समरूप आबादी है जो अजवायन पालि से egressing से पहले सकारात्मक चयन के माध्यम से उनके सफल मार्ग का संकेत है । iTE में कॉग्नेट पेप्टाइड के खिलाफ एंटीजन-विशिष्टता है। एंटीजन पेश कोशिकाओं के साथ आईटीई सह-संस्कारी एक अप्रासंगिक पेप्टाइड के साथ प्रीलोडेड कोशिकाओं के रूप में न्यूक्लियोप्रोटीन साइटोकिन्स के सेलुलर उत्पादन में नहीं दिखाते हैं।
हालांकि आईटीई सह-संस्कृति एंटीजन पेश कोशिकाओं को कॉग्नेट पेप्टाइड जीपी 100 के साथ पूर्व-स्पंदित करता है, इंट्रासेल्यूलर टीएनएफ अल्फा इंटरल्यूकिन ii और इंटरफेरॉन गामा का उत्पादन करता है। कृपया याद रखें कि ओपन लाइन सेल संस्कृति एबीएस स्लॉट पर दृढ़ता से निर्भर है। उत्पन्न iTE पारंपरिक टी कोशिकाओं के साथ काम कर रहे किसी भी अन्य परख में इस्तेमाल किया जा सकता है।
उदाहरण के लिए, टी सेल समाशोधन परख, साइटोकिन उत्पादन परख, वीवो ट्यूमर प्रतिगमन परीक्षणों में, टी सेल भेदभाव अध्ययन, एट cetera। इस तकनीक को कई इम्यूनोलॉजिकल या ऐसी परियोजना पर लागू किया जा सकता है। एक टी सेल भेदभाव, पल्स टाइमिंग टी सेल परिपक्वता, और हेमेटोरिट जनक या स्टेम सेल से एंटीजन-विशिष्ट टी सेल की पीढ़ी शामिल है।
इस वीडियो को देखने के बाद दर्शक को समझना चाहिए कि 3 डी थाइमिक ऑर्गन कल्चर सिस्टम का उपयोग करके प्रेरित प्लेरिपोटेंट, स्टेम सेल व्युत्पन्न, ट्यूमर एंटीजन विशिष्ट थाइमिक उत्प्रवासियों को कैसे उत्पन्न किया जाए।
यह लेख एक तीन आयामी (3 डी) थाइमिक संस्कृति प्रणाली द्वारा ट्यूमर प्रतिजन-विशिष्ट प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न थाइमिक उत्प्रवासियों (iTE) उत्पन्न करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है। iTE टी कोशिकाओं का एक समरूप सबसेट बारीकी से प्रसार के लिए क्षमता के साथ भोले टी कोशिकाओं से संबंधित हैं, स्मृति गठन, और ट्यूमर दमन.
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