Ett tredimensionellt thymic kultur system för att generera murin inducerad pluripotenta stamcells härledda tumör antigen-specifika thymic emigranter

Genereringen av iPSC-härledda thymic emigranter genom en 3D thymic orgel kultur är den första in vivo metod regenerera homogena populationen av tumör antigen-specifika naiva-liknande T-celler. De främsta fördelarna är iTE är mer fysiologiska relevant, och denna metod mer är mer potent då någon annan in vivo differential metod för att producera ständigt en specifik T-celler. iTE är homogen upprörd av CD8 alfa-beta anti-genous specifika T-celler med en naiv T cell-liknande funktionell fenotyp, inklusive kapacitet för spridning, remodiformation och tumör dämpning in vivo.

Demonstrera förfarandet kommer att doktor Rafiqul Islam en post-doc i mitt laboratorium. Till att börja odla OP9/DLL1 celler i OP9 media vid 37 grader Celsius. När cellerna når 80 till 95 procent konfluency, tvätta dem en gång med en X magnesium, kalcium och fenol röd fri PBS.

Tillsätt fyra milliliter punkt noll fem procent trypsin och inkubera vid 37 grader celsius i fem minuter. Lägg sedan till fyra milliliter OP9-media och pipet för att ta avstånd från cellskiktet och göra en enda cellupphängning. Överför cellupphängningen till ett koniskt rör på 50 milliliter genom en 100 mikrometercellsil.

Centrifugera vid 300 G och vid fyra grader Celsius i fem minuter. Aspirera varbildning och åter avbryta cellerna i 12 milliliter av OP9 media. Sedan platta två milliliter av OP9/DLL1 cell suspension i en ny 10 centimeter cell kultur Petriskål.

Lägg till ytterligare åtta milliliter OP9-media. Upprepa denna passage varannan till var tredje dag. På dag noll skörd de inducerade pluripotenta stamceller som en enda cell suspension genom trypsinization.

Samla in cellerna och centrifugen vid 300 G vid fyra grader celsius i fem minuter. Aspirera supernatanten och åter upphäva IPC: s vid en densitet på 100, 000 celler per 10 milliliter AV OP9 media. Sedan tallrik 100, 000 celler på en konfluent OP9/DLL1 10 centimeter skålen.

Fortsätt inkubationen vid 37 grader celsius med fem procent koldioxid. På dag tre aspirera de gamla medierna och ersätta den med 10 milliliter färska OP9 media. På dag sex tvätta varje 10 centimeter konfluent OP9 maträtt med 10 milliliter PBS.

Lägg till tre milliliter punkt noll fem procent trypsin till varje maträtt. Och inkubera i tre till fem minuter i rumstemperatur. Tillsätt fyra milliliter OP9-media och försiktigt pipet att samla cellerna.

Passera cellerna genom en 100 mikrometer cell sil och centrifug vid 300 G och fyra grader celsius i fem minuter. Kassera sedan supernatanten. Åter avbryta cellerna i 10 milliliter differentiering media.

Platta cellupphängningen på en ny 10 centimeters OP9/DLL1 konfluentfat. Fortsätt inkubationen vid 37 grader celsius med fem procent koldioxid. På dag nio, aspirera de gamla medierna och ersätta den med 10 milliliter av färska differentiering media.

Fortsätt att inkubera cellerna i 37 grader celsius och fem procent CO2. Dag 11 när kardiomyocyter observeras i iPSC kolonier använder en pipet att mekaniskt lösgöra icke-anhängare celler. Filtrera cellerna genom en 100 mikrometer cell sil och centrifug vid 300 G och fyra grader celsius i fem minuter.

Efter detta aspirera supernatanten och åter upphäva cellerna i 24 milliliter differentieringsmedia. Plate iPSC's i en konfluent OP9/DLL1 sex brunnsplatta. Inkubera cellerna i 37 grader celsius med fem procent koldioxid.

På dag 15 samlar du alla icke-vidhäftande celler och filtrerar dem genom en 40 mikrometercellsil. Centrifugera vid 300 G och vid fyra grader celsius i fem minuter. Fortsätt passaging de icke-anhängare celler var tredje till fyra dagar som tidigare beskrivits.

På dag sju av DGWO behandling, ta ut fyra nya 10 centimeter rätter. Fyll varje maträtt med 20 milliliter kompletta medier. Överför alla nitrocellulosamembranen med thymic lober i en 10 centimeters skål.

Med hjälp av tänjningar, lossa de enskilda lober från membranet Tillåter dem att vara nedsänkt i media. Inkubera lober i en timme i rumstemperatur. Överför sedan thymic lober till en ny 10 centimeter skålen med komplett media.

Och inkubera i en timme i rumstemperatur. Upprepa denna överföring och inkubation ytterligare två gånger. Med hjälp av tärningar, fixera thymic loberna till skålen medan du använder den andra handen för att göra en 100 till 200 mikrometer djupt snitt i mitten och utvidga halva diametern på loben för att underlätta T cell progenitor migration i loben.

Överför thymic loberna till en ny 10 centimeters skål fylld med komplett differentieringsmedia. Om du använder 3D-odlingsplattor med nedre och övre nivågaller, fyll båda gallren med sterila PPS för att förhindra avdunstning och torkning av de hängande dropparna. Nästa överföring 30 mikroliter av kompletta medier som innehåller en DGWO behandlad thymic lob i varje brunn av 3D-odlingsplattan.

Samla in de icke-vidhäftande T-härstamningscellerna från medkulturen OP9/DLL1. Och åter upphäva cellerna vid en densitet av 2, 000 till 5, 000 T cell härstamning celler per 20 mikroliter media. Lägg till 20 mikroliter av T-härstamning cell suspension till varje thymic lob i 3D-odlingsplattan.

Inkubera över natten vid 37 grader varmt med fem procent koldioxid. Nästa dag, ställ in P200 pipet till 30 mikroliter. Pipet media i varje brunn upp och ner flera gånger för att ta bort alla celler som omger thymic lober.

Sedan aspirera media från varje brunn och ersätta den av 30 mikroliter av kompletta medier. Upprepa denna process, pipeting, ta bort, och ersätta media fem till sju gånger för att ta bort eventuella extra omogna T-celler som inte migrerar in i lober. Fortsätt ruva lober, se till att ändra 25 till 30 mikroliter media dagligen.

På dag fyra eller fem, använd ljusmikroskopi för att bekräfta bildandet av en gloria av iPSC-härledda thymic emigranter runt lober. Samla iTE: s dagligen genom pipeting media utan lob störningar. Byt media varje dag och fortsätt samlingen upp till cirka 12 dagar.

Skördade iTE:s är redo att använda för molekylär analys eller in vivo transplantationsexperiment. I denna studie, co-odlade fetala bräss är avsnitten till analyseras om iPSC härledda T cell härstamning celler kan migrera in i thymic lober. Un-seedade kontroll lober har en vävnad arkitektur som kännetecknas av en astrocyte-liknande thymic epitelial web utplacerade av endogena CD3 positiva celler.

Men thymic lobs seedade med iPSC härledda omogna T-celler är återbefolkade med CD3 positiva mononukleära celler som anger migration av iPSC härleds omogna T-celler i lober. T-celler som migrerar till, och mognar, inom den thymic mikromiljöen som därefter egress som iTE. Flödescytometrisk analys används sedan för att testa den fenotypiska karakteriseringen av olika celler.

Extra thymic T celler visar CD4, CD8 dubbla positiva T-celler och CD8 alpha enda positiva T-celler utan uttryck för den positiva markeringen markör, MHC klass One medan iTE är en homogen population av CD8 alpha enda positiva MHC klass En positiva T cell fenotyp som anger deras framgångsrika passage genom positiva urval före egressing från thymic lobe. iTE har antigen-specificitet mot cognate peptid. iTE co-odlade med antigen presentera celler preloaded med en irrelevant peptid som nukleoprotein inte visar i en cellulär produktion av cytokiner.

Men iTE co-kultur antigen presentera celler pre-pulsed med cognate peptid GP100, producera intracellularly TNF alfa interleukin ii och interferon gamma. Kom ihåg att öppen linje cell kultur är en starkt beroende av ABS-kortplats. Genereras iTE kan användas i någon annan analys som arbetar med konventionella T-celler.

Till exempel, T cell clearing assay, cytokin produktion assay, in vivo tumör regression prövningar, T cell differentiering studie, et cetera. Denna teknik kan tillämpas på många immunologiska eller sådana projekt. Inklusive en T-cellsdifferentiering, puls timing T cell mognad, och generering av antigen-specifika T-cell från hematokrit stamcell.

Efter att ha sett denna video betraktaren bör förstå hur man genererar inducerad pluripotent, stamceller härledda, tumör antigen specifika thymic emigranter med hjälp av en 3D thymic organ kultur system.