3D timik organ kültürü tarafından iPSC kaynaklı timik göçmenlerin üretimi tümör antijenspesifik naif-t hücrelerinin homojen popülasyonu rejenerasyon ilk in vivo yöntemidir. Ana avantajları iTE daha fizyolojik ilgili, ve bu yöntem daha sonra sürekli belirli bir T hücreleri üretmek için başka bir in vivo diferansiyel yöntem daha güçlüdür. iTE, cd8 alfa-beta anti-genöz spesifik T hücrelerinin naif T hücre benzeri fonksiyonel fenotip ile homojen olarak altüst edilmesidir, proliferasyon kapasitesi de dahil olmak üzere, remodiformasyon, ve in vivo tümör baskılanması.
Prosedürü gösteren Doktor Rafiqul İslam benim laboratuvarımda bir post-doc olacaktır. OP9 ortamdaki OP9/DLL1 hücrelerini 37 santigrat derecede kültüre başlamak için. Hücreler yüzde 80-95 biraraya ulaştığında, bir kez bir X magnezyum, kalsiyum ve fenol kırmızısı içermeyen PBS ile yıkayın.
Dört mililitre sıfır noktası yüzde beş tripsin ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Sonra hücre tabakasını ayırmak ve tek bir hücre süspansiyon yapmak için OP9 medya ve pipet dört mililitre ekleyin. Hücre süspansiyonuna 100 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Santrifüj 300 G'de ve dört santigrat derecede beş dakika. Suppurate aspire ve OP9 medya 12 mililitre hücreleri yeniden askıya. Daha sonra op9/DLL1 hücre süspansiyonunun iki mililitresini yeni bir 10 santimetrelik hücre kültürü Petri kabına yerleştirin.
Ek sekiz mililitre OP9 ortam ekleyin. Bu pasajı her 2-3 günde bir tekrarlayın. Gün sıfır hasat tripsinizasyon ile tek hücre süspansiyon olarak indüklenen pluripotent kök hücreleri.
Hücreleri toplayın ve santrifüj ü 300 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca toplayın. Supernatant aspirate ve OP9 medya 10 mililitre başına 100,000 hücre yoğunluğunda IPC yeniden askıya. Sonra plaka 100, 000 hücreleri bir confluent OP9/DLL1 10 santimetre çanak üzerine.
%5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya devam edin. Üçüncü gün eski medya aspire ve taze OP9 medya 10 mililitre ile değiştirin. Altıncı günde her 10 santimetrelik confluent OP9 çanak 10 mililitre PBS ile yıkayın.
Her çanağa üç mililitre sıfır noktası yüzde beş tripsin ekleyin. Ve oda sıcaklığında 3-5 dakika kuluçkaya yat. Dört mililitre OP9 ortam ekleyin ve hücreleri toplamak için yavaşça pipet.
Hücreleri 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve 300 G'de santrifüj ve dört derece santigrat derece ile beş dakika geçirin. Sonra supernatant atın. 10 mililitre farklılaşma ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
Yeni bir 10 santimetre OP9/DLL1 confluent çanak üzerine hücre süspansiyon plaka. %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya devam edin. Dokuzuncu günde, eski medyayı aspire edin ve 10 mililitre taze farklılaşma ortamıyla değiştirin.
Hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırmaya devam edin. IPSC kolonilerinde kardiyomiyositler gözlendiğinde 11. Hücreleri 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden ve santrifüjden 300 G ve dört derece santigrat derecede beş dakika süzün.
Bundan sonra, supernatant aspire ve farklılaşma medya 24 mililitre hücreleri yeniden askıya. Plaka iPSC bir confluent OP9/DLL1 altı kuyu plaka içine. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
15. günde, tüm yapışık olmayan hücreleri toplayın ve 40 mikrometrelik bir hücre süzgecine süzün. Santrifüj 300 G'de ve dört santigrat derecede beş dakika. Daha önce açıklandığı gibi her üç ila dört günde bir yapışık olmayan hücreleri geçirmeye devam edin.
DGWO tedavisinin yedinci gününde, dört yeni 10 santimetrelik tabakları dışarı atın. Her yemeği 20 mililitre tam ortamla doldurun. Timik loblar ile tüm nitroselüloz membranları 10 santimetrelik bir tabağa aktarın.
Forceps kullanarak, membran onları medya da batırılmış izin bireysel loblar ayırmak. Lobları oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Sonra tam medya ile yeni bir 10 santimetre çanak için timik loblar aktarın.
Ve oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yat. Bu aktarım ve kuluçka bir iki kez daha tekrarlayın. Forseps kullanarak, merkezinde 100 ila 200 mikrometre derin kesi yapmak ve lob t hücre atası göçü kolaylaştırmak için lob çapının yarısını uzatmak için diğer taraftan kullanırken çanak timik loblar düzeltmek.
Timik lobları tam bir farklılaşma ortamıyla dolu 10 santimetrelik yeni bir tabağa aktarın. Alt ve üst düzey ızgaralara sahip 3B kültür plakaları kullanıyorsanız, asılı damlaların buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için her iki ızgarayı steril PPS ile doldurun. Sonraki transfer 3D kültür plakaher kuyuiçine bir DGWO işlenmiş timik lob içeren tam medya 30 mikrolitre.
OP9/DLL1 ortak kültüründen yapışık olmayan T soy hücrelerini toplayın. Ve 20 mikrolitre medya başına 2,000 ila 5, 000 T hücre soyu hücresindeki hücrelere yeniden askıya alın. 3D kültür plakasındaki her bir timik loba 20 mikrolitre T soy hücresi süspansiyonu ekleyin.
Bir gecede 37 derecede yüzde 5 karbondioksitle kuluçkaya yat. Ertesi gün, P200 pipet'i 30 mikrolitreye ayarlayın. Timik lobları çevreleyen tüm hücreleri kaldırmak için her kuyuda ortam yukarı ve aşağı birkaç kez Pipet.
Sonra her kuyudan medya aspire ve tam medya 30 mikrolitre değiştirin. Loblara göç etmeyen ekstra olgunlaşmamış T hücrelerini çıkarmak için bu işlemi, pipetleme, çıkarma ve beş ila yedi kez değiştirerek tekrarlayın. Lobları kuluçkaya yatırmaya devam edin, günde 25 ila 30 mikrolitre medya yıkın.
Dördüncü ya da beşinci günde, loblar etrafında iPSC kaynaklı timik göçmenlerin bir hale oluşumunu doğrulamak için ışık mikroskobu kullanın. Lob kesintisi olmadan medya borulama tarafından iTE günlük toplayın. Ortamı her gün değiştirin ve koleksiyona yaklaşık 12 güne kadar devam edin.
Hasat edilen iTE'ler moleküler analiz veya in vivo transplantasyon deneyleri için kullanıma hazırdır. Bu çalışmada, iPSC türetilmiş T hücre soyu hücrelerinin timik loblara geçirilip geçirilemeyeceğini analiz etmek için eş kültürlü fetal timuslar kesitlenmiştir. Tohumsuz kontrol lobları endojen CD3 pozitif hücrelerin konuşlandırılmış astrosit benzeri timik epitel ağı ile karakterize bir doku mimarisine sahiptir.
Ancak iPSC türetilmiş immatür T hücreleri ile tohumlanmış timik loblar, iPSC kaynaklı immatür T hücrelerinin loblara geçişini gösteren CD3 pozitif mononükleer hücrelerle doldurulur. Timik mikroortama göç eden ve olgunlaştıran T hücreleri daha sonra iTE olarak ortaya çıkan hücrelerdir. Akış sitometrik analizi daha sonra çeşitli hücrelerin henotipik karakterizasyonu test etmek için kullanılır.
Ekstra timik T hücreleri, CD4, CD8 çift pozitif T hücreleri ve CD8 alfa tek pozitif T hücreleri pozitif seçim belirteci ifade etmeden gösterir, MHC Sınıf Bir ise iTE, timik lobdan çıkmadan önce pozitif seçilim yoluyla başarılı geçişlerini gösteren CD8 alfa tek pozitif MHC Sınıf Bir pozitif T hücre fenotipinin homojen bir popülasyonudur. iTE'nin konjenite peptide karşı antijen özgüllüğü var. nükleoprotein sitokinlerin hücresel üretimine görünmemesi nedeniyle iTE, alakasız bir peptitle önceden yüklenmiş antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir.
Ancak iTE co-kültür antijeni, cognate peptid GP100 ile önceden darbeli hücreleri sunar, hücre içi TNF alfa interlökin ii ve interferon gama üretir. Açık hücre kültürünün ABS yuvasına güçlü bir şekilde bağlı olduğunu lütfen unutmayın. Oluşturulan iTE, geleneksel T hücreleriyle çalışan başka bir tsemek için kullanılabilir.
Örneğin, T hücre temizleme tsay, sitokin üretim tsay, in vivo tümör regresyon çalışmaları, T hücre farklılaşma çalışması, vesaire. Bu teknoloji birçok immünolojik veya böyle bir projeye uygulanabilir. T hücre farklılaşması dahil, nabız zamanlaması T hücre olgunlaşması, ve hematokrit atası veya kök hücre antijene özgü T hücre üretimi.
Bu videoyu izledikten sonra izleyici nasıl indüklenen pluripotent oluşturmak için anlamak gerekir, kök hücre türetilmiş, tümör antijen spesifik timik göçmenler kullanarak bir 3D timik organ kültür sistemi.
